KR19980017912A - 신규한 스트렙토마이세스 속 미생물, 이로부터 제조되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 16환을 갖는 마크로라이드(macrolide) 화합물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 및 그의 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 신규한 16환을 갖는 마크로라이드 화합물을 제조하는 방법 및 본 발명의 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 항생제로 사용하는 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물을 생산하는 우리나라 토양에서 분리한 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 미생물에 관한 것이다.

Description

신규한 스트렙토마이세스 속 미생물, 이로부터 제조되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물 및 이의 제조방법.

항생물질은 병원균은 죽이면서 인체 또는 동물에서는 독성이 낮고 체내의 효소 등에 의해 비활성화되지 않는 선택적 독성작용(selective toxicity)을 갖는 물질로서, 이의 작용기전은 주로 DNA의 복제, 유전정보의 전사 및 해독, 전자에너지의 수송, 세포벽의 생합성 등에 관여하여 미생물의 증식을 억제하는 것이다.

항생물질은 플레밍(Sir Alexandor Fleming)이 1929년에 페니실린을 처음 발견하고, 플로리(Flory) 등이 1939년에 페니실리움 크리소제니움(Penicillium chrysogenum)의 배양액에서 페니실린을 분리·정제한 이후 1959년까지 본격적으로 생산되면서 현재까지 치료제로 유용하게 사용되고 있는 벤질페니실린, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 마크로라이드계의 에리트로마이신 등이 개발되었다.

이후 페니실린류가 1965년에 처음 합성 방법에 의해 개발되었고, 합성에 의해 테트라사이클린류, 리파마이신류, 리노코마이신류 등이 반합성 제제로 실용화되기 시작하였다. 또한 최근에는 세균, 진균 및 방선균 등을 배양하여 분류하고 그의 대사산물을 분리·정제하는 방법, 항생물질의 치료효과에 대한 검색방법, 그의 안전성에 대한 평가방법 및 항생물질의 심부배양방법 등의 기술이 확립되었다.

지금까지 많은 항생제가 개발되고 사용되어 왔으나, 항생제는 사용에 의해 미생물에서 내성이 생기게 되므로 계속적인 새로운 항생제의 개발이 이루어져야 한다. 또한 대부분의 항생제는 여러 개의 카이랄 중심을 가지고 있을 뿐만 아니라 마크로라이드 또는 펩타이드와 같이 복잡한 구조를 가지고 있으므로, 그 합성이 어렵고 합성방법은 발효방법과 비교하여 그 경제성이 매우 낮다. 따라서 새로운 항생제는 천연물로부터 새로운 물질 또는 그 중간산물을 발견하거나 그의 치환기를 변화시킴으로써 얻는 것이 유용하다.

브로크만(Brockmann)과 헨켈(Henkel)은 1950년에 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.)균주로부터 최초로 마크로라이드(macrolides) 항생물질을 분리하였다. 이 항생물질들은 처음에 그 특유의 쓴 맛 때문에 피크로마이신이라고 불렸으나, 이들 항생물질이 일반적으로 마크로사이클릭 락톤의 구조를 나타내므로 우드워드 등이 이들 화합물에 대해 '마크로라이드'라는 용어를 사용하였다.

마크로라이드 항생물질은 그의 항균작용 중 특히 혐기성균을 포함한 그람 양성균에 그 효과가 매우 탁월한 것으로 보고되었고, 그 외에도 그람 음성균 및 마이코플라즈마에 대해서 제한적으로 그 효과가 좋은 것으로 보고되었다. 구체적으로 이들 항생물질은 그람 양성균 중에서 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 디플로코커스(Diplococcus) 등에 대해 그 효능이 크고, 그램 음성균 중에서 나이세리아 고노로히아(Neisseria gonorroheae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 보르드텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 등에 대해 그 효능이 좋다. 특히 마크로라이드는 레지오넬라병 및 다른 레지오넬라균에 의한 감염증에도 큰 효과를 나타내는데, 베타-락탐과 같은 세포막을 표적으로 하는 항생제와 함께 사용하는 경우 마크로라이드가 상승 작용(synergistic effect)을 나타낸다고 보고되어 있다.

피크로마이신이 처음 발견된 이후, 90종 이상의 마크로라이드 항생물질이 토양 방선균(Actinomycetes)으로부터 분리되어 그들의 화학구조가 규명되었다. 실제로 현재까지 생산된 전 마크로라이드 항생물질 중 절반 이상이 방선균인 스트렙토마이세타시아(Streptomycetaceae)에서 생산된다. 또한 마크로라이드 화합물은 다양한 균주에서 생산된 대사산물 또는 중간산물로부터 생합성이 가능할 뿐만 아니라 화학적 구조변화에 의해서 그의 다양한 유도체도 얻을 수 있다.

화학적으로 마크로라이드 화합물은 아글리콘(aglycon)의 락톤 고리의 크기에 따라 12환, 14환, 16환 및 그 이상 크기의 마크로라이드로 분류되는데, 이들 마크로라이드에는 대부분 아미노 당 및/또는 중성 당이 함유된다. 토양에서 분리한 대표적인 마크로라이드 항생물질에 대해 살펴보면 다음과 같다.

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) M-2140 균주에서 생산된 메티마이신이 12환 마크로라이드로서 최초로 구조가 결정된 이후, 지금까지 몇 가지 12환 마크로라이드 화합물들이 보고되었다. 14환 마크로라이드 화합물은 많은 수가 보고되어 있으며, 실제로 14환 마크로라이드 중 에리트로마이신(erythromycin)과 오랜도마이신(oleandomycin) 등이 현재 의학과 수의학 분야에서 널리 사용되고 있다. 특히 에리트로마이신은 마크로라이드 항생제 중에서 가장 많이 연구된 물질로서, 에리트로마이신 F 등이 에리트로마이신 A, B, C, D 와 함께 스트렙토마이세스 에리트라우스(Streptomyces erythraeus) 균주로부터 생산된다. 또한 방선균이외의 아트로박터 속(Arthrobacter sp.) 균주도 에리트로마이신 A를 생산하고 이의 제조방법에 특허가 되었다. 마이크로모노스포라 속 (Micromonospora sp.) 균주에서도 메가로미신(megalomicins) A, B, C1, C2 등이 분리되었다.

16환 마크로라이드 중에서 카르보마이신 A가 최초로 분리된 이후, 1982년까지 16환 마크로라이드에 속하는 71개의 화합물이 분리되고 그의 구조가 결정되었다. 오무라 등이 카르보마이신 A 와 스피라마이신 (spiramycin) Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 구조를 각각 제안한 이후 그 구조가 수정되어 결정되었다. 또한 오무라 등이 류코마이신 복합체를 각각의 구성성분(A1, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, U 및 V)으로 분리하고 그들의 구조를 결정하였다. 이러한 마크로라이드에 관한 화학적 연구를 통해 일본 등에서 새로운 마크로라이드 항생물질의 개발이 활발히 이루어졌다. 그 결과, 1970년부터 1980년까지 미데카마이신, 플라테노마이신, 마리도마이신, 쥬베니미신(juvenimicin), M-4365 시리즈, 델타마이신 및 마이시나미신(mycinamicin) 등을 포함한 다양한 마크로라이드 화합물들이 발견되어 분리되었다.

실질적으로 마크로라이드 화합물은 생체 독성이 매우 낮으면서 상기에서 언급한 다양한 활성을 나타내므로 유용하게 사용되고 있다. 그 예로 에리트로마이신, 올랜도마이신, 류코마이신(키타사마이신), 스피라마이신, 요사마이신(류코마이신 A3) 및 미데카마이신 등은 인체 및 가축에 의학적으로 사용되고 있으며 틸로신(tylosin)은 가축 및 식품의 보존에 사용되고 있다. 또한 최근에 개발된 로사미신, 주베니미신, 마이시나미신 및 M-4365 시리즈 등은 현재 사용되고 있는 마크로라이드보다 항생제로서의 효과가 좋은데, 특히 로사미신은 에리트로마이신, 메갈로미신 이상으로 그램 양성균에 좋은 효과를 나타내고 그 외에 마이코플라즈마 및 다른 혐기성균 등에서도 효과가 좋은 것으로 보고되어 있다.

본 발명자들은 신규한 항생물질을 개발하기 위해, 우리나라 토양으로부터 다양한 균주를 수집하여 마크로라이드 항생물질을 생산하는 균주를 검색한 결과, 찰코마이신과 유사한 신규한 16환 마크로라이드 항생물질을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) SNUS 9011-250 균주를 분리하고, 이로부터 신규한 16환 마크로라이드 항생물질을 분리·정제하여 그의 구조를 밝히고 이를 이용하여 신규한 의약용 항생물질을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물을 제공함에 그 목적이 있다.

화학식 1

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속 균주를 이용하여 화학식 1로 표시되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로 본 발명은 스트렙토마이세스 속 균주의 배양 상등액을 에틸 아세테이트로 추출한 다음 여과하여 감압 증발시키고, 헥산-에틸 아세테이트 혼합용매를 이용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행한 다음, 프렙 TLC 크로마토그래피를 수행하는 방법으로 신규한 16환 마크로라이드 화합물을 분리·정제한다.

또한, 본 발명은 상기 16환 마크로라이드 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 미생물을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명의 균주를 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-250 균주로 명명하고, 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다 (수탁번호: KFCC 10911).

또한, 본 발명은 화학식 1의 신규한 16환 마크로라이드 화합물 및 그 유도체를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 항생제로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명의 16환 마크로라이드 화합물을 자외선 스펙트럼으로 분석한 결과 를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 16환 마크로라이드 화합물을 수소 핵자기공명 스펙트럼으로 분 석한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 16환 마크로라이드 화합물을 탄소 핵자기공명 스펙트럼으로 분 석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 16환의 마크로라이드 화합물을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 우리나라의 토양에서 다양한 균주를 분리한 다음 그 중에서 항균 효과가 탁월한 신규 마크로라이드 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속 미생물을 분리한다. 본 발명의 신규한 16환의 마크로라이드 화합물을 생산하는 균주를 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-250 균주로 명명하고, 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC 10911).

본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물은 특이하게도 본 발명의 신규한 마크로라이드 화합물과 더불어 이미 보고된 16환의 마크로라이드 항생제인 찰코마이신(chalcomycin)을 생산한다.

상기에서 분리한 균주로부터 본 발명의 16환의 마크로라이드 화합물을 분리하기 위하여, 본 발명의 균주의 생합성 과정 및 조절 과정을 적절히 고려한 발효공정을 수행한다. 본 발명의 마크로라이드 화합물은 이를 생산하는 균주의 배양액으로부터 얻을 수 있는데, 보통 밀접히 관련있는 성분들이 복합적으로 혼합된 형태로 생산된다.

본 발명의 균주를 V-8 배지 또는 트립틱 소이 액체 배지(tryptic soy broth) 등에 배양한 다음, 마크로라이드 생산에 적합한 배지 등으로 옮겨 계속 배양한다. 마크로라이드 생산에 적합한 배지에는 탄수화물 및 질소의 공급원으로 천천히 사용될 수 있는 녹말, 덱스트린, 소이빈 밀, 옥수수액, 파마메디아 등이 포함되면 바람직하다.

본 발명의 균주를 배양할 때 질소 대사 및 탄수화물 대사를 조절하는 것이 발효 효율에 중요한데, 실제로 오무라(Omura) 등이 질소를 억제한 발효(nitrogen depressed fermentation)에 의해 마크로라이드 화합물의 생산에 효율적임을 보고하였다. 또한 류코마이신도 질소를 제거하는 인산 마그네슘 또는 제오라이트(zeolite)를 가함으로써 그의 생산이 증진되는 것으로 알려져 있다. 또한, 칼슘 이온도 델타마이신(deltamycin) 생산에 필수적이며, 소량의 Co(NO3)2, ZnCl2, (NH4)2Mo7O24 및 MnCl2 등도 스피라마이신의 수율을 증진시킨다고 보고되었다.

상기의 과정으로 얻은 본 발명의 16환 마크로라이드 화합물은 그의 물리화학적 성질에 의해 분리·정제될 수 있다. 본 발명의 균주가 생산하는 16환의 마크로라이드 화합물이 분비되는 균주 배양액은 적절한 pH로 맞추어져야 하고, 이 때 pH 9.0 이하가 바람직하다.

상기 균주 배양액으로부터 본 발명의 마크로라이드 화합물을 적절한 유기용매를 사용하여 추출할 수 있다. 이 때 유기 용매로는 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 메틸렌 아세테이트, 클로로포름 등을 사용할 수 있다. 그 결과 얻은 추출물은 여과하여 휘발시킨다.

다음 상기에서 얻은 조물질(crude materials)로부터 각 성분을 분리하기 위하여 역 전류 분배(counter-current distribution), 알루미나 칼럼 크로마토그래피, 실리카젤 칼럼 크로마토그래피 및/또는 이온교환 칼럼 크로마토그래피 또는 HPLC (high-performance liquid chromatography) 등을 수행할 수 있다. 이 때 사용하는 용매로는 다양한 비율의 혼합용매를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 1;1, 1:2, 1:3 비율의 헥산-에틸 아세테이트 혼합용매 등을 사용할 수 있다.

또한 상기 과정에 더하여 각 분획을 페이퍼 크로마토그래피, TLC(thin-layer chromatography) 또는 HPLC 등을 사용하여 분석할 수 있다. 이 때 다양한 비율의 혼합용매를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 클로로포름-메탄올 등의 혼합용매를 사용할 수 있다.

스트렙토마이세스 속 균주의 배양액 및 분리 과정 중의 각 분획의 항균 효과를 검색하기 위하여, 그람 양성균인 마이코박테리움 스매그마티스 및 바실러스 섭틸리스 등을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 구체적으로 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) ATCC 6633 등을 사용한 아가 확산 방법 등을 수행하여 성장 억제영역의 직경을 측정함으로써 항균효과를 측정한다.

상기의 과정으로 분리·정제한 신규한 16환의 마크로라이드 화합물의 물리화학적 특성은 실시예 5에 기술한 바와 같다 (표 1, 도 1-3 참조). 또한 본 발명의 마크로라이드 화합물과 유사한 항생제인 찰코마이신, 뉴트라마이신, 항생제 C35H56O13 등의 물리화학적 특성과 비교하여 그 결과를 나타냈다(표 2-5 참조).

또한 본 발명의 신규한 16환 마크로라이드 화합물의 항생물질로의 활성을 확인하기 위하여, 표 6에 나타난 바와 같이 다양한 균주를 이용하여 그의 활성을 조사한다. 구체적으로 스트렙토코커스 파이오젠스 ATCC 8668, 스트렙토코커스 파이오젠스 C4003, 스태필로코커스 아우레우스 Smith, 스태필로코커스 아우레우스 ATCC 29213, 마이코박테리움 스매그마티스 ATCC 29213, 대장균 ATCC 10536, 대장균 ATCC 25922, 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031, 슈도모나스 에루기노사 GN 11189, 슈도모나스 에루기노사 ATCC 10145, 슈도모나스 에루기노사 ATCC 27853, 스트렙토코커스 페칼리스 ATCC 29212, 세라티아 마르세센스 ATCC 27117, 살모네라 티피무리움 C 4045 등을 사용하여 아가 희석 방법을 수행하여 최소 생육억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정한다. 그 결과 본 발명의 16환 마크로라이드 화합물은 대체로 항균효과가 크지만, 특히 그람 양성균인 스태필로코커스 아우레우스 및 마이코박테리움 스매그마티스 균주 등에 대해 탁월한 항균 효과가 있음을 확인한다.

상기의 과정을 통해 얻은 정제물의 약제학적인 이용에서는 약제학적인 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 적절한 부형제를 사용하여 정제, 캡슐제, 산제, 액제, 현탁제, 주사제 등의 제형으로 이용될 수 있다.

물에 대한 용해도를 높이기 위하여 약학적으로 허용되는 에틸 석시네이트, 에틸 카보네이트, 글루코헵토네이트, 스테아레이트, 프로피오네이트, 에스토레이트, 락토비오네이트 등의 염을 사용하여 본 발명의 16환 마크로라이드 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 250mg/ml의 농도로 매 6시간마다 경구로 또는 정맥 주사로 투여하여 이의 혈중 농도가 1.5μg/ml로 유지되도록 한다. 또한 본 발명의 마크로라이드 화합물의 세포 독성을 50% 치사량 (LD50)으로 나타내면 정맥주사의 경우 425mg/kg, 피하주사의 경우 1849mg/kg 그리고 경구 투여의 경우 2927mg/ml 정도로 나타난다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 토양에서 분리한 균주의 동정

우리나라 광주에서 수집한 토양으로부터 새로운 16환 마크로라이드 항생물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 미생물을 분리하였다.

무기질-녹말 배지(inorganic salts-starch agar medium)에서 이 균주는 나선형의 포자 사슬 형태를 나타내고 포자의 표면은 매끈(smooth)하며, 균체는 흐린 보라색으로 그의 주변은 흰색 또는 어두운 회색으로 나타났다. 본 균주의 배양학적 및 생리학적 특성은 다음과 같다. 본 균주의 콜로니의 색은 아가 배지에서 노란색으로 나타나며 무기질-녹말 배지에서는 진한 밤색으로 나타나므로 멜라노이드 색소를 생산하는 것을 보여주었다. 또한 본 균주는 녹말, 스킴 밀크(skim milk) 그리고 크산틴을 분해하고 타이로신은 분해하지 않았다. 이의 세포 가수분해 산물중 세포벽을 분석해 보면 DAP-이성질체(diaminopimelic acid-isomers)는 LL-DAP 이며 특징적인 당은 없었으므로, 본 균주는 월 케모타입 I (Wall Chemotype I)와 당 패턴 C (sugar pattern C)에 해당한다. 따라서, 상기 균주의 콜로니 모양, 호기성 마이셀리움 및 기질 마이셀리움의 형태, 포자의 형태, 세포벽의 DAP 이성질체와 당의 분석 결과 등을 통해 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 속 균주로 동정되었다.

이를 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-250 균주로 명명하고, 한국종균협회에 1996년 8월 30일에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC 10911).

실시예 2 스트렙토마이세스 속 균주의 배양

상기에 얻은 본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물에서 생산된 신규한 16환 마크로라이드 화합물을 얻기 위하여 본 균주를 V-8 아가 배지(V-8 쥬스 200ml, CaCO3 3.0g, 아가 20.0g, 증류수 800ml)에 배양하였다. 배양한 스트렙토마이세스 속 균주의 균사체를 백금니로 취하여 50ml의 TBS 배지(박토-트립톤 17.0g, 박토-소이톤 3.0g, 포도당 5.0g, NaCl 2.5g, K2HPO4 2.5g, 증류수 1.0L)가 들어있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하여 28℃에서 180rpm으로 2일 동안 배양하였다. 다시 균주 배양액을 13L의 배지(오트밀 2.0%, 포도당 2.0%, 미트 추출액 0.4%, NaCl 0.4%, CaCO3 0.3%, FeSO4 0.04%, MnCl2·H2O 0.04%)가 담긴 발효조에 옮기고 28℃에서 200rpm으로 10L/분의 속도로 공기를 공급하면서 3일간 배양하여 본 발명의 마크로라이드 화합물이 포함된 배양액 13L를 얻었다.

실시예 3 항균 효과의 검색

스트렙토마이세스 속 균주 배양액의 항균 효과를 검색하기 위하여 우선 5가지 배지를 선정하여 4일간 균주를 배양하고 바실러스 섭틸리스, 대장균, 슈도모나스 에루기노사, 마이코박테리움 스매그마티스, 칸디다 알비칸스의 균주에 대한 활성을 조사하였다. 그 결과 SNU 9100-250 균주가 생산하는 항생물질은 그람 양성균인 바실러스 섭틸리스 및 마이코박테리움 에루기노사에 대해서 항균 효과가 탁월함을 확인하였다. 또한 오트밀과 같은 복합 질소원과 포도당과 같은 탄소원이 있고 미량 금속을 많이 포함하는 조성의 배지보다는 몇 가지 특정의 금속이 들어있는 조성이 항생물질의 생산에 유리하다는 것을 확인하였다.

따라서 스트렙토마이세스 속 균주 배양액의 항균 효과를 검색하기 위하여, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) ATCC 6633 균주를 사용하였다. 바실러스 섭틸리스에 대한 항균 효과를 조사하기 위한 아가판은 다음과 같이 제조하였다. 바실러스 섭틸리스 ATCC 6633 균주의 포자 현탁액을 영양 아가 배지(펩톤 5.0g, 비프 추출액 3.0g, 증류수 1.0L, 아가 15.0g)에 0.2% (v/v) 부피가 되도록 가한 다음, 20ml씩 취하여 일회용 페트리 디쉬에 부어 판을 굳혀 사용하였다. 바실러스 섭틸리스의 포자 현탁액은 영양 배지(펩톤 5.0g, 비프 추출액 3.0g, 증류수 1.0L)에 바실러스 섭틸리스를 접종하여 포자가 충분히 형성되도록 배양한 다음, 멸균 증류수에 현탁시키고 밀봉하였다. 여기에 질소를 주입하여 냉장고에 보관하였다.

다음 항균 효과를 조사하기 위한 6.3mm 직경의 종이 디스크에 30μl씩 시료를 적신 다음 완전히 말리고 바실러스 섭틸리스가 함유된 플레이트의 위에 이를 얹었다. 이를 4℃에서 30분간 방치하여 확산시킨 다음 28℃에서 16시간 이상 배양하여 성장 억제 영역의 직경을 측정하였다.

실시예 4 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-250 균주로부터 화학식 1 화합물 의 분리·정제

우리나라 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-250 균주의 배양액을 12,000rpm 으로 10분간 원심분리하여 균사체를 제거하고 배양 상등액을 13L 얻었다. 배양 상등액 13L에 약 6L의 에틸 아세테이트를 가하여 격렬히 흔들어 주고 분액 깔떼기를 사용하여 수층과 에틸 아세테이트층을 분리하였다. 에틸 아세테이트층을 여과하고 감압 증발시켜 항생물질 시료를 8.9g 얻었다.

상기의 시료를 소량의 에틸 아세테이트에 녹인 다음 이것을 실리카겔이 충전되어 있는 칼럼(5.0×17cm)에 부어주고 계속해서 헥산-에틸 아세테이트(1:1, 1:2, 1:3) 용액을 통과시켜 분획을 수집하였다. 이 때 얻은 각 분획은 헥산-에틸 아세테이트(1:3) 용매를 사용하여 TLC 크로마토그래피로 분석하고 동일한 성분을 갖는 분획을 감압 증발시켜 항생물질 시료를 분리하였다. 또한 이렇게 얻은 시료로 클로로포름-메탄올 (20:1)을 사용한 프렙 TLC를 수행하여 다시 분리함으로써 순수한 항생물질 시료 8.0mg을 정제하였다.

실시예 5 화학식 1로 표시되는 화합물의 물리화학적 특징

우리나라 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 균주의 배양액에서 정제한 화학식 1로 표시되는 마크로라이드 화합물의 물리화학적 특성은 표 1에 나타난 바와 같다 (도 1 - 도 3 참조).

화학식 1로 표시되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물의 이화학적 특성

물질의 성상	무색, 무정형 고체
MP	74 - 76℃
[α]D26(C=0.05, EtOH)	-16
UV λmaxEtOHnm	215.7, 282.3
MW(CI-Mass, (M+H)+, m/z)	670.3920 (C35H58O12에 대해서는 670.3927)
IRνmax cm-1 (KBr)	3460, 1716, 1657
색 반응	(+): 아니스알데히드 황산 반응액, I2(-): 닌히드린, 드라젠도르프 반응액
용해도	CHCl3, Et2O, EtOH, MeOH 에 수용성헥산, 물에 난용성
TLC, SiO2	헥산-EtOAc (1:4)0.51
Rf 값	CHCl-MeOH (30:1)0.43

본 발명의 16환 마크로라이드 화합물과 이와 유사한 화합물의 마이시노스(mycinose)에 대한 탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과를 비교하여 표 2에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 마이시노스(mycinose)에 대한 13C NMR 스펙트럼의 상호 비교

위치	본 발명의 화합물	찰코마이신	뉴트라마이신	항생제 C35H56O13
1˚	101.1	100.3	100.9	100.9
2˚	81.9	81.6	81.5	81.6
3˚	79.8	79.4	79.7	79.7
4˚	72.7	72.5	72.8	72.7
5˚	70.6	70.4	70.7	70.7
5˚-CH3	17.7	17.7	18.1	17.8
2˚-OCH3	59.8	58.5	59.1	59.7
3˚-OCH3	61.7	61.4	61.7	61.7
* 찰코마이신의 화학적 시프트 값은 실험실에서 분리한 화합물로 측정한 것임.* 나머지는 선행의 참고자료에서 얻은 것임.

본 발명의 16환 마크로라이드 화합물과 이와 유사한 화합물의 찰코스(chalcose)에 대한 탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과를 비교하여 표 3에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 찰코스(chalcose)에 대한 13C NMR 스펙트럼의 상호 비교

위치	본 발명의 화합물	찰코마이신	뉴트라마이신	항생제 C35H56O13
1˚	103.6	102.9	103.9	103.4
2˚	75.1	74.8	74.9	75.2
3˚	80.3	80.3	80.3	80.5
4˚	36.9	36.7	36.9	36.9
5˚	67.8	67.5	68.1	67.8
5˚-CH3	20.8	20.8	20.9	20.9
3˚-OCH3	56.9	56.8	56.8	56.8
* 찰코마이신의 화학적 시프트 값은 실험실에서 분리한 화합물로 측정한 것임.* 나머지는 선행의 참고자료에서 얻은 것임.

본 발명의 16환 마크로라이드 화합물과 이와 유사한 화합물의 아글리콘에 대한 탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과를 비교하여 표 4에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 아글리콘에 대한 13C NMR 스펙트럼의 상호 비교

위치	본 발명의 화합물	찰코마이신	항생제 C35H56O13
C-1	165.6	165.3	165.4
C-2	121.5	120.7	120.6
C-3	150.6	151.5	151.2
C-4	40.8	41.6	41.8
C-5	86.5	87.8	86.9
C-6	34.6	34.0	34.1
C-7	32.9	36.7	32.0
C-8	44.9	79.3	44.7
C-9	213.7	200.1	200.9
C-10	38.5	124.9	125.6
C-11	26.1	146.4	143.9
C-12	132.8	58.7	59.0
C-13	128.7	59.0	58.7
C-14	50.3	49.6	49.5
C-15	69.8	68.7	68.7
14-CH2	69.9	66.9	76.0
4-CH3	18.9*	19.1	18.8
6-CH3	17.2	18.6	17.0
8-CH3	18.5*	27.8	17.6
15-CH3	18.9*	18.3	18.4
* 찰코마이신의 화학적 시프트 값은 실험실에서 분리한 화합물로 측정한 것임.* 나머지는 선행의 참고자료에서 얻은 것임.

본 발명의 16환 마크로라이드 화합물의 수소 핵자기공명 스펙트럼의 화학적 시프트 결과를 표 5a 및 표 5b에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 1H NMR 의 화학적 시프트 결과

위치	화학적 시프트(ppm)	중복	커플링 상수(Hz)
2	5.81	d	15.5
3	6.71	dd	15.5, 10.0
4	2.77	dqd	10.8,10.0, 6.5
5	3.35	t	10.8
6	1.45	m	3.9, 6.7, 10.8
7	1.401.67	dddddd	5.4, 6.7, 14.73.9, 9.7, 14.7
8	2.55	ddd	5.4, 6.9, 9.7
10	2.54	m
11	2.13	m	6.5
12	5.50	dt	6.5, 15.5
13	5.31	dd	9.0, 15.5
14	2.35	m	9.0
14-CH2	3.933.43	dddd	4.0, 9.56.0, 9.5
15	5.07	dq	6.5, 8.5
4-CH3	1.22	d	6.7
6-CH3	0.98	d	6.6
8-CH3	1.09	d	6.9
15-CH3	1.30	d	6.4
1＇	4.27	d	7.3
2＇	3.34	dd	7.3, 8.8
3＇	3.25	ddd	4.9, 6.4, 8.8
4＇eq	2.07	ddd	2.0, 4.9, 13.7
4＇ax	1.14	ddd	4.4, 9.0, 13.7
5＇	3.62	d	2.0
6＇-CH3	1.26	d	6.1
2＇-OH	2.13	m
1＂	4.56	d	7.7
2＂	3.05	dd	7.7, 2.8

화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 1H NMR 의 화학적 시프트 결과

위치	화학적 시프트(ppm)	중복	커플링 상수(Hz)
3＂	3.74	dd	2.8, 2.8
4＂	3.19	dd	2.8, 9.0
5＂	3.60	dq	5.7, 9.0
2＂-OCH3	3.62	s
3＂-OCH3	3.53	s
6＂-CH3	1.25	d	5.7
4＂-OH	2.31	m

실시예 5 화학식 1로 표시되는 마크로라이드 화합물의 항균 효과

본 발명의 화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 항균효과를 아가 희석 방법(agar dilution method)으로 최소 생육억제 농도를 측정함으로써 조사하여 표 6에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물의 항균 효과

시험 균주	최소 생육억제 농도(MIC, μg/ml)
Streptococcus pyogenes ATCC 8668	12.5
Streptococcus pyogenes C 4003	12.5
Staphylococcus aureus Smith	5.0
Staphylococcus aureus ATCC 29213	5.0
Mycobacterium smaegmatis ATCC 29213	2.5
Escherichia coli ATCC 10536	100
Escherichia coli ATCC 25922	100
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031	100
Pseudomonas aeruginosa GN 11189	100
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145	100
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	100
Streptococcus faecalis ATCC 29212	100
Serratia marcescens ATCC 27117	100
Salmonella typhimurium C 4045	100
* 최소 생육억제 농도는 Mueller-Hinton 아가(디프코사 제품)를 이용한 아가희석 방법에 의해 측정하였다.

이와 같이 본 발명의 화학식 1로 표시되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물은 다양한 균주에서 항균 효과가 있으나, 특히 그람 양성균인 스태필로코커스 아우레우스 균주 및 마이코박테리움 스매그마티스 등에서는 탁월한 항균 효과를 나타낸다. 따라서 새로운 항생제로서 그람 양성균 등에 유용하게 사용될 것으로 크게 기대된다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 16환을 갖는 마크로라이드(macrolide) 화합물에 관한 것이다.

화학식 1

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 및 그의 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 신규한 16환을 갖는 마크로라이드 화합물을 제조하는 방법 및 본 발명의 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 항생제로 사용하는 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 16환 마크로라이드 화합물을 생산하는 우리나라 토양에서 분리한 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 미생물에 관한 것이다.

Claims (5)

1. 화학식 1로 표시되는 신규한 16환 마크로라이드 화합물 및 그의 유도체.

   화학식 1
2. 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 미생물의 배양 상등액을 유기용매로 추출하여 감압 증발시키고, 다양한 비율의 헥산-에틸 아세테이트 혼합용매를 이용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 분리하는 신규한 16환 마크로라이드 화합물의 제조방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 과정에 더하여 프렙 TLC 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 신규한 16환 마크로라이드 화합물의 제조방법.
4. 제 1항의 마크로라이드 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-250 균주 (수탁번호 : KFCC 10911).
5. 제 1항의 마크로라이드 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 하여 이에 약학적으로 허용가능한 물질이 첨가된 것을 특징으로 하는 항생제용 약학적 조성물.