KR100856884B1 - 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2균주가 생산하는항 헬리코박터 파일로리의 효능을 갖는 마크로락틴 에이 - Google Patents

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2균주가 생산하는항 헬리코박터 파일로리의 효능을 갖는 마크로락틴 에이

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Abstract

본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Baciilus polyfermenticus KJS-2) (KCCM10769P)균주에서 생산되는 마크로락틴 에이(Macrolactin A)의 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대한 항균 작용에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 ( Bacillus polyfermenticus KJS-2)에서 생산되는 마크로락틴 에이(Macrolactin A)는 여러 가지 미생물과 진균에 대해 넓은 항균 스펙트럼을 보여주고 있으며 특히, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대하여 탁월한 항균 작용을 보임을 확인하였다.
따라서 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Baciilus polyfermenticus KJS-2)균주로부터 생산된 항균물질 마크로락틴 에이(Macrolactin A)는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)에 대한 항균제제로 제공될 수 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명이다.

Description

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2균주가 생산하는 항 헬리코박터 파일로리의 효능을 갖는 마크로락틴 에이{anti-helicobacter pylori macrolactin A that Bacillus polyfermenticus KJS-2 produced in}
본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Baciilus polyfermenticus KJS-2) (KCCM10769P)균주에서 생산되는 마크로락틴 에이(Macrolactin A)의 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대한 항균 작용에 관한 것이다.
헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균은 그람염색 음성( Gram - )을 띠는 것을 특징으로 하는 나선균으로서 미호기성의 특성을 갖고 있고, 우레아제(Urease)를 생산함으로써 우레아(urea)를 분해하여 암모니아를 생성하며 이 암모니아가 균 주위를 중화함으로 인하여 산성조건인 위내 환경에서도 생존이 가능하게 된다. 일반적으로 위염 및 위궤양의 경우에는 항생제를 사용하는 치료법, 위산 분비억제제인 라니티딘, 파모티딘, 시메티딘, 오프라졸 등을 사용하는 치료법, 비스무스 유도체를 사용하는 치료법, 제산제를 사용하는 치료법 및 이들의 조합에 의한 치료법이 현재 사용되고 있다. 특히 만성위염, 궤양, 재발성 궤양의 대부분은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)에 의한 것으로 잘 알려져 있으며 이의 박멸이야말로 이 질환들의 치료에 필수적이라고 할 수 있다. 그러나 위의 질환 치료에는 30일에서 6개월이 소요되므로 상기 치료법에 의한 치료는 항생제 (Ciprofloxacin, tetracyclin 등)사용으로 인한 간독성 위장장애 등의 부작용 및 내성균의 출현 등 많은 문제점을 가지고 있다
바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus )는 1933년에 일본의 Terakato가 공기로부터 분리한 내생포자(endospore)성 간균으로서 20여종의 소화효소를 분비하며 비타민 B1,B2,K,C를 합성하여 영양을 보급시킨다. 또한 티프스균, 파라티프스균, 적리균, 콜레라균, 이질균, 비브리오 등을 용균 또는 정균하는 것으로 본 발명자 등이 밝힌바 있다.
이번에 분리한 신규한 균주 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)는 다량의 마크로락틴 에이(Macrolactin A)를 생성하며 이로 인한 우수한 항균성이 있음을 발견하였고 특히, 이 물질을 발효에 의해 다량 확보함으로써 항 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori) 효력 실험을 실시하여 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)에 대한 탁월한 항균성을 보여주는 결과를 얻었다.
본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대하여 항균활성을 가지는 마크로락틴 에이(Macrolactin A)에 관한 것으로서, 상기 마크로락틴 에이(Macrolactin A)를 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)균주를 이용하여 생산하고 이에 본 물질을 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter Pylori)균에 대한 항균제제로 개발하고자 한다.
본 물질은 마크로라이드계 항생물질로서 분자량 402.24의 물질이며 이중결합 및 하이드록실기(-OH)가 다수 존재하는 한 개의 환상구조를 갖는다. 환상구조는 탄소와 산소로 이루어져 있고, 24환을 이루고 있으며 본 물질의 분자식은 C24H3405 이다. 이에 본 발명은 신규 분리 균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)(종균등록번호 KCCM10769P) 균주를 이용하여 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대한 항균제제로서의 용도를 제공할 목적으로 제안한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2) (종균등록번호 KCCM10769P) 균주를 이용하여 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대한 항균작용이 뛰어난 마크로락틴 에이(Macrolactin A)를 제공한다.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Baciilus polyfermenticus KJS-2)에서 생산되는 마크로락틴 에이(Macrolactin A)의 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대한 항균작용을 하기와 같은 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다.
이하의 본 발명의 구성을 하기 실험 및 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 마크로락틴 에이(Macrolactin A)의 생산 및 정제
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)에서 생산되는 항균물질을 분리하기 위하여 상기 균주를 티에스비 배지 3ℓ(TSB agar; Tryptone 17g, Soytone 3g, Dextrose 2.5g, NaCl 5g, Dipotassium Phosphate 2.5g, pH 6.8~7.2)에 4% 종배양하여 2.5일 동안 30℃, 200rpm, 1vvm 그리고 pH 6.8조건으로 발효하였다. 생성된 배양액을 에틸아세테이트로 추출하여 1차 추출물을 얻었다. 1 차 추출물을 정제하여 에이치피엘씨(HPLC) 분석을 실시하였다. 에이치피엘씨(HPLC) 분석에서는 에질런트(agilent) 1100 시리즈와 시마즈 에이치피엘씨 (Shimadzu HPLC)를 이용하였고 컬럼은 조르박스 에스비-씨에이틴(Zorbax SB-C18)이며 입자 크기가 5㎛에 4.6*250mm가 사용되었다. 용매는 아세토나이트릴과 물에 0.1% 포름산을 넣어 사용하였다. 에이치피엘씨(HPLC) 분석 조건은 두 가지가 사용되었는데 첫째는 아세토나이트릴을 20분 동안 0%에서 100%로 구배(gradient)용매 분석 방법으로 실시하였고, 다른 하나는 아세토나이트릴 40%로 등(isocratic)용매 분석 방법을 실행하였다. 에이치피엘씨(HPLC) 분석에서 용매 유량은 에질런트(Agilent) 1100 시리즈를 사용하여 분석한 경우 1ml/min으로 하였고 시마즈 에이치 피엘씨(Shimadzu HPLC)를 사용한 경우 1.5ml/min으로 실시하였다. 에이치피엘씨(HPLC) 분석에서는 자외선 감지기(UV detector)가 사용되었고 파장은 228, 262, 280, 300 그리고 350nm로 실시되었다. 엘씨매스(LC/Mass) 분석에서는 에질런트(agilent) 1100 MSD 장비가 사용되었고 엘씨(LC) 조건의 경우 상기에서 제시된 에이치피엘씨(HPLC) 조건과 동일하며, 매스(Mass) 조건은 AP-ESI 모드이며 건조가스(drying gas) 유량은 13ℓ/min, 증기압(vapor pressure)은 50psi, 건조가스(drying gas) 온도는 350℃, 모세관 전압(capillary voltage)은 양이온 모드에서 4000V, 음이온 모드에서 3500V, 질량범위(mass range)는 100에서 1000 m/z, 토막이온전압(fragment voltage)는 150V, 유량은 1ml/min으로 실시되었다. 분취용 엘씨(preparative LC) 분석에서는 에질런트(agilent) 분취용 엘씨(Preparative LC)가 사용되었고, 컬럼은 분취용 컬럼인 제미니-씨에이틴(Gemini-C18)이며 입자크기가 10㎛에 10mm*250mm가 사용되었다. 용매는 아세토나이트릴과 물을 이용하였으며, 유량은 5ml/min으로 실시하였다. 분취용 엘씨 분석에서도 자외선 감지기(UV detector)가 사용되었으며, 파장은 228, 262, 280, 300 그리고 350nm로 실시되었다.
최종적으로 마크로락틴 에이(Macrolactin A)를 분리 정제할 수 있었으며 엘씨매스(LC/Mass)분석에서 94.63%의 순도를 가지는 결과물을 얻었다. (도2 및 도3 참조)
[ 실시예2 ] 항헬리코박터 파일로리 효과의 실험
Helicobacter pylori 69 균주를 이용하여 항 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter Pylori) 효과의 실험에 사용하였다. Anaerobic Jar(혐기성 배양기)를 이용하여 Campygen 시약을 이용하여 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)가 잘 자라는 미호기성 상태를 유지하면서 실험하였다. Brucella 고체배지(1.5% agar 함유)에서 Helicobacter pylori 69 균주를 3일 배양하여 생성된 콜로니를 취하여 Brucella 액체배지 3ml에 옮겨 37℃에서 200rpm으로 4일간 배양하였다. Brucella 배지에는 1% isovitale X, 7% FBS, 10 ㎍/ml vancomycin, 25 ㎍/ml nalidixic acid, 5 ㎍/ml amphotericin B를 포함한다. 항균성 시료는 Bacillus polyfermenticus KJS-2 균주에서 생산되어 정제된 마크로락틴 에이(Macrolactin A,이하 'Bp-2 MA')를 사용하였다.
시험용액은 Bp-2 MA는 1000 ㎍/ml의 농도로 제조하였고 시험용액 제조 용매는 0.5% tween 80을 포함하는 70% 에탄올을 이용하였다. 배지 2.89 ml 에는 60 ㎕의 시험용액을 넣어 시험에 사용하였고, Helicobacter pylori 69 균주는 50 ㎕를 넣었다. 최종적으로 3ml이 되게 하였다. Bp-2 MA 실험용 배지 3ml에는 Helicobacter pylori 69 균주 1 x 106 cfu/ml 과 Bp-2 MA는 20 ㎍/ml, 에탄올 1.4%, tween 0.01%을 함유한다. 대조시험군 C1-1은 배지 3ml당 Helicobacter pylori 69 균주 1 x 106 cfu/ml 과 에탄올 1.4%, tween 0.01%을 함유토록하여 시험하였다. 대조시험군 C1-2에서는 배지 3ml당 Helicobacter . pylori 69균주 1 x 106 cfu/ml , tween 0.01%을 함유토록 하여 시험하였고 에탄올은 넣지 않은 배지를 사용하여 참고자료로 사용하였다.
배양조건은 미호기성 조건에서 37℃에서 200rpm으로 4일간 배양하였다
실험결과로 대조군 C1-1은 1일 배양 후 흡광도 0.035, 2일 배양 후 0.338, 3일 배양후 0.66으로 증가하였으며, 대조군 C1-2에서도 1일 배양 후 흡광도 0.152, 2일 배양 후 0.608, 3일 배양후 0.707로 증가하였다. 실험군에서는 Bp-2 MA는 1일 배양 후 흡광도 0.005, 2일 배양 후 흡광도 -0.007, 3일 배양 후 흡광도 0.011 이었다.(도4 참조)
이상 상기 실시예를 통하여 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명이 제공하는 신규한 균주 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2) 균주에서 생산되는 마크로락틴 에이(Macrolactin A)는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter Pylori)균에 대한 항균성을 가지고 있다.
본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2) 균주로부터 생산된 항균물질 마크로락틴 에이(Macrolactin A)는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)균에 대한 항균제제를 제공할 수 있으므로 의약 산업상 매우 유용한 발명이다.
도1은 마크로락틴 에이(Macrolactin A)의 구조.
도2은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Baciilus polyfermenticus KJS-2)균주의 발효물에서 추출 정제된 순도 94.63%의 마크로락틴 에이(Macrolactin A).
도3은 추출정제된 마크로락틴의 에이치피엘씨 분석결과로 순도 94.53% 를 보이고 있다.
도4는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)에 대한 항균작용을 나타내는 결과이며 대조실험 C1-1및 C1-2와 비교하여 추출 정제된 94.63% 순도의 마크로락틴 에이(Macrolactin A)을 사용한 항 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)효과의 실험결과.

Claims (3)

  1. 마크로락틴 에이(Macrolactin A)를 유효성분으로 하는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylori)에 대한 항균제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 마크로락틴 에이(Macrolactin A)는 신규의 균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)균주(기탁번호:KCCM10769P)를 이용하여 생산되는 것을 특징으로 하는 항균제용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 마크로락틴 에이(Macrolactin A)의 작용농도가 20 ㎍/㎖이상인 것을 특징으로 하는 항균제용 조성물.
KR1020070026706A 2007-03-19 2007-03-19 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2균주가 생산하는항 헬리코박터 파일로리의 효능을 갖는 마크로락틴 에이 KR100856884B1 (ko)

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