DE69519084T2

DE69519084T2 - Die substanz it-62-b und sie enthaltende medizinische zubereitungen

Info

Publication number: DE69519084T2
Application number: DE69519084T
Authority: DE
Inventors: Ru-Xian Chen; Ming-Yu Huang; Takashi Kawauchi; Hiroshi Matsumoto; Toshio Otani; Toru Sasaki; Ken-Ichiro Yoshida
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 2001-05-10
Anticipated expiration: 2015-07-13
Also published as: EP0721985A4; KR960703927A; DE69519084D1; EP0721985A1; EP0721985B1; CA2171116C; AU2935995A; WO1996002659A1; AU674115B2; US5698528A; CA2171116A1; CN1127300A; KR0173195B1; JP2748048B2; ATE196929T1; CN1059678C

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Substanz IT-62-B, ein Herstellungsverfahren derselben, ein medizinisches Mittel, das eine solche Substanz enthält, und die Verwendung von IT-62-B für die Zubereitung eines Medikaments gegen eine infektiöse Krankheit, die durch Bakterien und einen Tumor hervorgerufen wird.

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK

Es war bisher bekannt, dass Mikroorganismen verschiedene Substanzen herstellen, von denen jede weitreichende Eigenschaften unter dem Gesichtspunkt der chemischen Struktur aufweisen und pharmakologische Aktivitäten, wie z. B. antibakterielle Aktivitäten und Antitumor-Wirksamkeiten.
Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Substanz bereitzustellen, die besonders hervorragende pharmakologische Wirksamkeiten unter der Verwendung von Mikroorganismen aufweist.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Unter dem Gesichtspunkt der vorangestellten Umstände hatten die Erfinder der vorliegenden Erfindung viele Mikroorganismen aus natürlichen Böden isoliert, um deren Fähigkeit zur Herstellung von Substanzen, die nützliche pharmakologische Wirkungen aufweisen, herauszufinden. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass ein Streptomyces sp.-Stamm IT-62, welcher der Gattung Streptomyces angehört, die neue Substanz IT-62-B herstellt, die hervorragende antibakterielle Aktivitäten und Antitumor-Wirksamkeiten zeigt, die daher zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung führten.
TAN-1120 wurde als eine von Streptomyces hergestellte Substanz beschrieben, die eine Struktur aufweist, die der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ähnlich ist G apanische offen gelegte Patentanmeldung, Nr. 288892/1990). Die Substanz der vorliegenden Erfindung ist jedoch eine neue Verbindung, die eine Struktur aufweist, dergestalt, dass ein Oxazolidinring zusätzlich anelliert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft nämlich eine Substanz IT-62-B gemäß der folgenden Formel (1):
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Substanz IT-62-B, das die Kultivierung eines Mikroorganismus umfasst, der der Gattung Streptomyces angehört und der die Fähigkeit zur Herstellung der Substanz IT-62-B besitzt, um eine derartige Verbindung in der Liquorkultur herzustellen und anzureichern sowie die Verbindung abzuscheiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Medikament, einen antibakteriellen Wirkstoff und einen Antitumor-Wirkstoff, die alle die Substanz IT-62-B als wirksamen Bestandteil umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner noch ein medizinisches Mittel, das die Substanz IT-62-B und einen pharmazeutisch zulässigen Träger umfasst.
Die vorliegend Erfindung betrifft ferner noch die Verwendung der Substanz IT-62-B für ein Medikament.

FIGURENBESCHREIBUNG

Fig. 1 veranschaulicht ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, das in Beispiel 1 erhalten wurde.
Fig. 2 veranschaulicht ein Infrarot-Absorptionsspektrum der Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, das in Beispiel 1 erhalten wurde.
Fig. 3 veranschaulicht ein ¹H-NMR-Spektrum der Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, das in Beispiel 1 erhalten wurde.

BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG

Die Substanz IT-62-B gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die Formel (1) dargestellt, und es gibt Isomere auf Grund der asymmetrischen Kohlenstoffatome in dieser Verbindung. Die vorliegende Erfindung schließt jedoch alle diese Isomere und Mischungen derselben ein. Die Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung kann in der Form eines Hydrats vorliegen, und die vorliegende Erfindung schließt ein solches Hydrat ein.
Die Substanz IT-62-B gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch die Kultivierung eines Stamms hergestellt werden, der die Fähigkeit zur Herstellung dieser Substanz (im folgenden als "der, die Substanz IT-62-B-herstellende, Stamm" bezeichnet) unter geeigneten Bedingungen aufweist.
Der, die Substanz IT-62-B herstellende, Stamm schließt Mikroorganismen ein, die zur Gattung Streptomyces gehören. Als erläuterndes Beispiel kann Streptomvces sp.-Stamm IT-62 genannt werden. Dieser Stamm wird aus einem Boden der Uigurian-Provinz in der Volksrepublik China von den Erfindern der vorliegenden Erfindung isoliert und wurde zur Identifizierung des Mikroorganismus "Stamm IT-62" hinterlegt, Hinterlegungsnr. PERM BP-4666 im "National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology", in Japan, am 13. Mai 1994.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms IT-62, die gemäß dem Verfahren, das in International Journal of Systematic Bacteriology, 16(3), 313-340, 1960, beschrieben ist, untersucht wurden, ist wie folgt:
(a) Morphologie: Verzweigung der Sporen bildenden Hyphen: einfaches Verzweigen.
Form der Sporenbildung: gerade oder gebogene oder manchmal hakenförmige Sporenform in zylindrischer Form.
Anzahl der Sporen: 10 bis 50 oder mehr Sporen.
Sporenoberfläche: glatt.
Größe einer Spore: 0,5-0,8 · 0,7-1,1 um.
Vorliegen von Flagellatae: liegt nicht vor.
Vorliegen von Sporenträgern: liegt nicht vor.
Anlagerungsstelle der Sporenträger: Luft-Myzel.
Besitz von Sklerotium bildender Eigenschaft: kein Besitz.
(b) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien:
Kultivierungseigenschaften des Stamms IT-62 auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 1 gezeigt. Klassifizierungsfarben wurden gemäß "Standard Color Chart A, 1981" unter der Aufsicht des The Japan Color Research Institute bestimmt.
Daneben wurden zusätzlich genauere Farben in Klammern angegeben, was die Farben- Codes gemäß "The Color Harmony Manual, the fourth edition, 1958", publiziert von Container Corporation of America, anbelangt. Tabelle 1
(c) Physiologische Eigenschaften:
Temperaturbereich für das Wachstum:
Der Stamm zeigt gutes Wachstum in dem Temperaturbereich von 20- 37ºC.
Verflüssigung von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine-Medium, 27ºC): negativ.
Verflüssigung von Gelatine (einfaches Gelatine-Medium, 20ºC): positiv.
Koagulation von Milch (3 7ºC): positiv.
Peptonisierung von Milch (37ºC): positiv.
Produktion eines Melanoidin-Pigments:
Negativ auf Tyorsin-Agar (ISP-Medium Nr. 7), Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP-Medium Nr. 6) und Trypton-Hefeextrakt-Medium (ISP-Medium Nr. 1).
Produktion von Schwefelwasserstoff [das Medium wird erhalten durch die Zugabe von 0,5% Hefeextrakt zu einem Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP-Medium Nr. 6)]: positiv.
Hydrolyse von Stärke (Stärke-anorganisches-Salz-Agar, ISP-Medium Nr. 4): positiv.
Reduktion von Nitrat (1% Kaliumnitrat-haltige Bouillon, ISP-Medium Nr. 8): positiv.
Zersetzung von Cellulose: negativ.
(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridfiam-Gottlieb's-Medium, ISP-Medium Nr. 9):
Dieser Stamm verwertet D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Fructose, D- Manitol, D-Galactose, lösliche Stärke, Dextrin, Glycerol und Maltose, verwertet aber kein Inositol, Sucrose, L-Rhamnose, Raffinose und Salicin.
(e) Chemotaxonomie:
Das Hydrolysat der gesamten Zelle wurde durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie analysiert, beschrieben in "Experimental Method for Identifving Actinomycetes-Qualitative Analysis, Quantitative Analysis of Mycelial Components bv HPLC, S. 1-8, 1989", herausgegeben von The Japan Society for Actinomycetes Japan. Als Ergebnis wurde LL-Diaminopimelinsäure nachgewiesen.
Hinsichtlich der Tatsache, dass der Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung die oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften aufweist, insbesondere jene Eigenschaften, dass Luft-Myzelen. die viele Sporenketten aufweisen, gebildet werden, die Aminosäure in den Zellwand-Hydrolysaten LL-Diaminopimellinsäure enthält und weder Flagellatae noch Sporenbildner gebildet werden, ist es augenfällig, dass der Stamm zu der Gattung Strepotmyces gehört. Demzufolge wurde bestimmt, dass dieser Stamm, "Streptomvces sp. IT-62" bezeichnet wird.
Die Substanz IT-62-B gemäß der vorliegenden Erfindung kann z. B. hergestellt werden durch die Kultivierung verschiedener, die Substanz-IT-62-B-herstellende, Mikroorganismen, die zur Gattung Streptomyces gehören, wie z. B. der Stamm IT-62 oder Varianten desselben in ihren geeigneten Medien, dann das Abscheiden der, die Substanz der vorliegenden Erfindung enthaltenden, Rohextrakte aus dem Kulturmedium, und der weiteren Isolierung der Substanz IT-62-B aus den Rohextrakten, um sie zu reinigen.
Die Kultivierung des Mikroorganismus wird grundsätzlich gemäß der Kultivierung allgemeiner Mikroorganismen durchgeführt. Es ist jedoch in der Regel bevorzugt, die Kultivierung unter aeroben Bedingungen, wie z. B. bei einem Schüttel-Kultivierungsverfahren durch Flüssigkultivierung oder aerobe Verwirbelungs-Kultivierungsverfahren, durchzuführen. Das Medium, das bei der Kultivierung verwendet wird, kann eines von vielen Medien sein, solange es Nährstoffe enthält, die von den, die Substanz-IT-62-B-herstellenden, Bakterien verwertet werden können. Einige der verschiedenen synthetischen Medien, halbsynthetischen Medien, natürlichen Medien und dergleichen können verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle für das Medium können Glucose, Sucrose, Fructose, Glycerol, Dextrin, Stärke, Molasse, Maisquellflüssigkeit, organische Säuren und dergleichen entweder einzeln oder in jedweder Kombination verwendet werden; und als Stickstoffquelle können organische Stickstoffquellen, wie z. B. Pharmamedien, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenpulver, Kasein, Aminosäuren und Harnstoff sowie anorganische Stickstoffquellen, wie z. B. Natriumnitrat und Ammoniumsulfat entweder allein oder in irgendeiner Kombination verwendet werden. Zu dem Medium können Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Phosphate, Schwermetallsalze und/oder dergleichen zweckdienlich zugesetzt werden, sofern es notwendig ist.
Wenn ein Schäumen während der Kultivierung ausgeprägt ist, können ebenso Antischaummittel, wie z. B. pflanzliche Öle, wie z. B. Sojabohnenöl und Leinsamenöl, höhere Alkohole, wie z. B. Octadecanol, Tetradecanol und Heptadecanol sowie verschiedene Siliciumverbindungen zweckdienlich zu dem Medium gegeben werden.
Es ist bevorzugt, den pH des Mediums nahezu neutral einzustellen. Die Inkubationstemperatur kann vorzugsweise bei einer für das Wachstum des, die Substanz IT-62-B herstellenden, Stamms guten Temperatur aufrechterhalten werden, in der Regel 20-3 7ºC, besonders bevorzugt etwa 25-30ºC. Die Inkubationszeit kann vorzugsweise 4-7 Tage betragen, sowohl für die Flüssigschüttelkultivierung als auch die Aufrührkultivierung an Luft. Wie oben beschrieben, können die verschiedenen Inkubationsbedingungen zweckdienlich geändert werden gemäß der Art und Natur des verwendeten Mikroorganismus, äußere Bedingungen und dergleichen sowie optimale Bedingungen können aus den obigen von diesen abhängigen Bereichen ausgewählt und kontrolliert werden.
Die Abscheidung des Rohextrakts, das die Substanz IT-62-B enthält, aus der Liquorkultur kann gemäß dem allgemeinen Verfahren zur Gewinnung von Fermentationsprodukten ausgeführt werden. Verfahren, wie z. B. die Lösungsmittelextraktion, Säulen- und Absorptionschromatographie und Kristallisation können entweder einzeln oder in Kombination in jeder zweckdienlichen Reihenfolge verwendet werden. Da die Substanz IT-62-B, die durch die obige Kultivierung hergestellt wird, prinzipiell in der Myzelkultur vorliegt, wird noch spezieller zuerst eine Filtration, Zentrifugation oder dergleichen durchgeführt, um ein Filtrat der Liquorkultur und feste Myzelien von einander abzuscheiden. Die sich ergebenden festen Myzelien, die die Substanz IT-62-B enthalten, werden mit einem Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder Aceton, extrahiert, um die Substanz IT-62-B aus den Myzelien zu lösen. Dann wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt, wobei ein Rohkonzentrat, das die Substanz IT-62-B enthält, erhalten werden kann. Ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie z. B. Ethylacetat, Chloroform oder Bütanol, wird zu diesem Rohkonzentrat gegeben, um die Substanz IT-62-B mit dem organischen Lösungsmittel zu extrahieren. Nachdem die, auf diese Weise erhaltene, Lösungsmittelphase mit Glauber-Salz versetzt wird, um zu dehydratisieren, wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein Rohextrakt, der die Substanz IT-62-B enthält, erhalten werden kann. Wenn es notwendig ist, können Mittel angewendet werden derart, dass mit Natriumhydroxid oder Chlorwasserstoffsäure der pH eingestellt wird, dass technisches Natriumchlorid zugegeben wird, um die Wirksamkeit der Extraktion zu erhöhen, und dass die Bildung einer Emulsion verhindert wird. Um die Substanz IT-62-B aus dem Rohextrakt zu isolieren und zu reinigen, können gewöhnliche Maßnahmen zur Isolierung und Reinigung einer fettlöslichen niedermolekularen Substanz angewandt werden, z. B. eine Vielzahl der Absorptionschromatographien an Adsorbenzien, wie z. B. Kieselgel, Aluminiumoxid und makroporösen und nichtionischen Absorptionsharzen sowie Umkehrphasenchromatographie unter Ausnutzung von ÖD S-gebundenem Kieselgel oder dergleichen. Von diesen sind insbesondere die Chromatographie an Kieselgel unter der Verwendung von Chloroform oder eines gemischten Lösungsmittelsystems, wie z. B. Chloroform/Methanol, Chloroform/Methanol/Benzol oder Toluol/Methanol als Eluenten und die Umkehrphasenchromatographie unter der Verwendung eines gemischten Lösungsmittelsystems, wie z. B. Acetonitril/Wasser oder Methanol/Wasser bei der Elution bevorzugt. Wenn eine weitere Reinigung notwendig ist, kann die oben beschriebene Chromatographie wiederholt durchgeführt werden oder in zweckdienlicher Kombination mit einer Gelfiltrationschromatographie an Sephadex LH-20 (Produkt von Pharmacia AB) unter der Verwendung von Chloroform, Methanol oder dergleichen als Eluenten, oder dergleichen, wodurch die Substanz IT-62-B mit hoher Reinheit erhalten wird.
Der Nachweis der Substanz IT-62-B während des Reinigungsverfahrens kann vorzugsweise durchgeführt werden durch einen Bioassay unter der Verwendung eines Mikroorganismus, an welchem ein Wachstums-inhibierender Effekt von dieser Substanz nachgewiesen wird, z. B. Mikrococcus luteus ATCC 9341, einem Verfahren zur Bestimmung der zytotoxischen Wirksamkeit auf eine gebildete Kulturzelllinie (KB-Zelllinie), abgeleitet von menschlichem Nasopharyngeal-Karzinom und einem Nachweisverfahren unter der Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination.
Hinsichtlich der pharmakologischen Verabreichungsform in dem Fall, wo die Substanz IT-62-B, die nach der oben beschriebenen Weise gereinigt wurde, als ein medizinisches Mittel verwendet wird, kann jede der oralen Zubereitungen verwendet werden, wie z. B. Tabletten, Kapseln, Pulver, Körner, feine Körner, Lösungen, Pillen, Emulsionen und Suspensionen; und parenterale Zubereitungen, wie z. B. Injektionen, Suppositorien, Salben, Pflaster, Packungen, Aerosole und ophthalmische Lösungen. Die Zubereitungen dieser Verabreichungsformen können jeweils gemäß den herkömmlichen Formulierungsmethoden formuliert werden, die den Leuten vom Fach bekannt sind.
In dem Fall, wo eine feste orale Zubereitung formuliert wird, ist es nur notwendig, einen Träger und gegebenenfalls einen Binder, ein Aufschlussmittel, ein Gleitmittel, einen Farbstoff, einen Geschmack und/oder dergleichen zu dem wirksamen Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung zu geben, und dann die Mischung in Tabletten, Kapseln, Pulver, Körner, feine Körner oder dergleichen, gemäß einem Verfahren, das per se aus dem Stand der Technik bekannt ist, zu formen. Beispiele des Trägers schließen Lactose, Sucrose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat, kristalline Cellulose, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Glycerol, Natriumalginat und Gummiarabikum ein. Beispiele des Binders schließen Polyvinylalkohol, Polyvinylether, Ethylcellulose, Gummiarabikum, Schellack und Sucrose ein. Beispiele des Gleitmittels schließen Magnesiumstearat und Talk ein. Neben diesen können herkömmlich bekannte als Farbstoff und Aufschlußmittel und dergleichen verwendet werden. Die Tabletten können nach dem herkömmlichen Verfahren beschichtet werden.
In dem Fall, wo eine Injektion zubereitet wird, ist es nur notwendig, einen pH-Regler, einen Puffer, einen Stabilisator, einen Isotonie verleihenden Wirkstoff, ein Lokal- Anästhetikum und/oder dergleichen zu dem wirksamen Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung zu geben und die Mischung zu einer intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intrakutanen und intraperitonealen Injektion zu bereiten. Als pH-Regler und Puffer können Natriumcitrat, Natriumacetat, Natriumphosphat und dergleichen verwendet werden. Als Stabilisator können Natriumpyrosulfit, Ethylendiamintetraessigsäure, Thioglykolsäure, Thiomilchsäure und dergleichen verwendet werden.
Ein Suppositorium kann zubereitet werden durch Zugabe eines Grundstoffs und gegebenenfalls eines oberflächenaktiven Mittels und/oder dergleichen zu dem wirksamen Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung und dann dem Befolgen eines Verfahrens, das per se aus dem Stand der Technik bekannt ist. Als Grundstoff können z. B. Ölgrundstoffe, wie z. B. Makrogol, Lanolin, Kakaobutter, Fettsäure, Triglyceride und Witepsol (Produkt von Dynamit Nobel Co.) verwendet werden.
Die Menge des wirksamen Bestandteils gemäß der vorliegenden Erfindung, die den oben beschriebenen Zubereitungen der verschiedenen Verabreichungsformen einverleibt wird, kann zweckdienlich ausgewählt werden gemäß des Applikationswegs, des Alters, des Geschlechts, des Krankheitsstadiums des Patienten, dem das Arzneimittel verabreicht wird, dem Typ der Verbindungen, die einverleibt werden, sowie anderen Bedingungen. Der wirksame Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch in einer Menge von in der Regel 0,005-20 mg/Tag auf einmal verabreicht werden oder in 2-4 Teilgaben.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden noch spezieller durch die folgenden Beispiele und Testbeispiele beschrieben. Die Erfindung wird jedoch nicht auf und durch diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1: Herstellung der Substanz IT-62-B der vorliegenden Erfindung:
(a) Kultivierungsverfahren:
100 ml eines Mediums (pH 7,2), umfassend 0,5% Glucose, 2,4% löslicher Stärke, 0,3% Rinderextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,4% Maisquellflüssigkeit, 0,002% Kobaltchlorid und 0,4% Calciumcarbonat wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen, sterilisiert und dann mit einer vollen Platinschlaufe eines Streptomyces srx-Stamms IT-62 (Hinterlegungsnr. PERM BP-4666) beimpft, um eine Rotationsschüttelkultivierung 2 Tage bei 27ºC (220 UpM, 7 cm Weg) durchzuführen. Dann wurden 100 ml eines Mediums (pH 7,2), umfassend 0,5% Glucose, 2,5% Dextrin, 2,0% Sesammehl, 0,5% Maisquellflüssigkeit, 0,05% Monokaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,03% Kaliumchlorid und 0,3% Calciumcarbonat in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und sterilisiert. Danach wurde die obige Impfkultur in einem Verhältnis von 2% zugegeben, um eine Rotationsschüttelkultivierung 5 Tage bei 27ºC (220 UpM, 7 cm Weg) durchzuführen.
(b) Abscheideverfahren:
Nachdem die Liquorkultur (40 Liter, pH 7,6), die nach dem obigen Verfahren erhalten wurde, gesammelt, zentrifugiert und filtriert wurde, wurden die Kulturmyzelien zweimal mit Aceton (5 Liter) extrahiert. Das sich ergebende Acetonextrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und das resultierende Konzentrat wurde mit einer verdünnten wässerigen Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und dann zweimal mit Ethylacetat (2 Liter) extrahiert. Die Fraktion, die mit Ethylacetat extrahiert wurde, wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und die resultierende ölige Substanz (11 g) wurde in Chloroform (40 ml) aufgelöst. Das Präzipitat, das durch weitere Zugabe von n-Hexan (120 ml) zu der Lösung erhalten wurde, wurde mit n-Hexan gewaschen und dann getrocknet, wobei 2,7 g eines Rohextrakts erhalten wurden.
(c) Isolierungs- und Reinigungsverfahren:
Der oben erhaltene Rohextrakt wurde in Chloroform aufgelöst und einer Säulenchromatographie an Kieselgel (Kieselgel 60, 4,1 cm Innendurchmesser · 25 cm Länge, Produkt der Merck AG) unterworfen, um eine schrittweise Elution zuerst mit Chloroform und dann mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol (50 : 1 und 25 : 1 v/v (Volumen /Volumen)) zu bewirken. Die eluierten aktiven Fraktionen wurden durch einen Bioassay nachgewiesen unter Verwendung von Mikrococcus luteus ATCC 9341, um aktive Fraktionen, die die Substanz IT-62-B enthalten, zu sammeln. Die auf diese Weise gesammelten aktiven Fraktionen wurden destilliert, und der Rückstand wurde getrocknet, um 155 mg einer öligen Substanz zu erhalten.
75 mg der, auf diese Weise erhaltenen, öligen Substanz wurden in Chloroform/Methanol (1 : 1 v/v) aufgelöst, um die Lösung einer Gelfiltrationschromatographie (an Sephadex LH-20 (2,0 cm Innendurchmesser · 92 cm Länge, ein Produkt von Pharmacia AB) zu unterwerfen, um es mit Chloroform/Methanol (1 : 1 v/v) zu eluieren. Aktive Fraktionen, die die Substanz IT-62-B enthielten, wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde von der auf diese Weise gesammelten aktiven Fraktion entfernt, wobei 26 mg einer öligen Substanz erhalten wurde. Die auf diese Weise erhaltene ölige Substanz wurde in Acetonitril/Wasser (2 : 3 v/v) aufgelöst, einer Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer ODSgebundenen Kiéselgelsäule auf Ultrapack ODS (30 bis 50 um, 1,0 cm Innendurchmesser · 50 cm Länge, Produkt von Yamazen-Co., Ltd.) unterworfen, um so bei einem Fluß von 1,5 ml/min unter der Verwendung von Acetonitril/Wasser (2 : 3 v/v) als Eleunten zu eluieren. Die eluierten aktiven Fraktionen wurden durch den Bioassay und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie nachgewiesen, um die aktiven Fraktionen zu sammeln, die die Substanz IT- 62-B enthielten. Das organische Lösungsmittel wurde entfernt, um die so gesammelte wirksame Fraktion zu bekommen, und der Rückstand wurde dann lyophilisiert, um dadurch 12 mg der Substanz IT-62-B als rotes Pulver zu erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen Substanz IT-62- B werden im Folgenden beschrieben.
(1) Aussehen: rotes Pulver
(2) Molekularformel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub7;NO&sub1;&sub5; (gemessen mit hochauflösender FAB-Massenspektrometrie (FAB = fast atomic bombardment)). Als C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub7;NO&sub1;&sub5;Na, gefunden: 792,294; berechnet: 792,284).
(3) Molekulargewicht: 769 (gemessen mit FAB-Massenspektrometrie).
(4) Optische Drehung: [α]D²³ + 360º (c = 0,015, Methanol).
(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum, in Methanollösung, λmax(nm) (&epsi;): 233 (33100), 251 (23400), 289 (6600), 480 (11300), 495 (11400), 530 (6200, sh) (vgl. Fig. 1).
(6) Infrarotabsorptionsspektrum, KBr-Presslingsverfahren, λmax (cm&supmin;¹): 3435, 2970, 2935, 1710, 1620, 1580, 1415, 1285, 1210, 1120, 1035, 995 (vgl. Fig. 2).
(7) NMR-Spektrum:
Die Werte der chemischen Verschiebungen in einem 400 MHz ¹H-NMR-Spektrum (Fig. 3) und einem 100 MHz ¹³C-NMR-Spektrum, gemessen in einer Deuteriochloroformlösung, sind in Tabelle 2 bzw. 3 gezeigt.

Tabelle 2

Position ¹H (δ)
1 8.01,d,8Hz
2 7.77,t,8Hz
3 7.38,d,8Hz
7 5.27,dd,4,lHz
8 2.12,dd,15,4 Hz, 2. 36,dt,15,lHz
10 2.91,d,19Hzf 3.22,dd,19,1.5Hz
14 2.44,s
OCH&sub3;-4 4.07,s
OH-6 13.94,s
OH-9 4.49,br.s
OH-11 13.23,s
1' 5.60,d,4Hz
2' 1.61,dd,13.5,4 Hz, 2.64,td,13.5,4Hz
3' 4.61,dd,13.5,4Hz
4' 3.61,s
5' 4.29,q,6.5Hz
6' 1.26,d,6.5Hz
1" 4.74,dd,7,4Hz
2" 1.78,ddd,14,9.5,4 Hz,1.85,ddd,14,7,3Hz
3" 4.03,m
4" 1.23,d,6Hz
5" 3.48,dq,8,6.5Hz
6" 4.70.,d,8Hz
7" 1.31,d,6.5Hz
9" 4.15,d,4.5Hz
10" 2.12,m
11" 3.58,dd,11,7.5 Hz, 3.65,dd, 11,4.5Hz
12" 0.98,d,7Hz Tabelle 3
Die obigen Positionen bedeuten Protonen, die jeweils an den folgenden Positionen sitzen.
(8) Löslichkeit:
Leicht löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform und Dimethylsulfoxid, aber schwer löslich in n-Hexan, Ether und Wasser.
(9) Schmelzpunkt: 153-155ºC
(10) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:
Ein Peak findet sich bei einer Retentionszeit (tR) von 6,9 Minuten unter den folgenden analytischen Bedingungen.
Säule: Inertsil ODS-2,5 um (4,6 mm Innendurchmesser · 150 mm Länge, Produkt von GL Science Co., Ltd.)
Mobile Phase: Acetonitril/0,05% wässerige Lösung von Trifluoressigsäure (50 : 50 v/v). Fluß: 1 ml/min
Detektion: 210 nm, 0,04 a. u. f. s.

Testbeispiel 1:

(1) Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit der Substanz IT-62-B:
Die Minimum-Inhibitor-Konzentrationen (MIC) der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung gegen verschiedene Bakterien wurden gemäß dem MIC-Messverfahren der "Japan Society of Chemotherapy" (vgl. Journal of Chemotherapy, Band 29, Nr. 1, S. 76-79, 1981) bestimmt. Insbesondere wurden Muller-Hinton-Agar-Medien (Produkt von Difco Co.), welche die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Konzentrationen enthielten, verwendet. Die Testorganismen, die auf jeweils 10&sup6; Zellen/ml verdünnt wurden, wurden beimpft, wobei diese Testorganismen auf demselben Medium, das oben beschrieben wurde, gezüchtet wurden. Nach der Inkubation bei 37ºC während 18 Stunden, wurde das Wachstumsstadium der Testorganismen bestimmt, um eine Minimum-Inhibitor-Konzentration (MIC, ug/ml) aufzunehmen, bei welcher das Wachstum des Testorganismus vollständig inhibiert war (bei der Beobachtung wurde angenommen, daß das Wachstum des Testorganismus inhibiert war, wenn die Anzahl der Kolonien 5 oder weniger betrug). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Getesteter Stamm MIC (ug/ml)
Staphylococcus aureus Smith 6,25
Staphylococcus aureus (MRSA) 70 12,5
Staphylococcus aureus (MRSA) 92-1 192 12,5
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 25
Enterococcus faecalis IFO 12968 50
Micrococcus luteus ATCC 9341 3,13
Micrococcus luteus ATCC 10240 1,56
Bacillus subtilis ATCC 6633 3,13
Bacillus subtilis ATCC (rec&spplus;) 6,25
Bacillus subtilis ATCC (rec&supmin;) 0,39
Bacillus cereus IFO 3001 12,5
Escherichia coli NIHJ 100
Escherichia coli IAM 1268 50
Proteus vulearis HD OX-19 > 100
Klebstella pneumoniae ATCC 29665 > 100
Serratia marcescens IFO 12648 > 100
Salmonella typhymurium G-46 > 100
Alcaligejies faecalis IAM 1015 12,5
Pseudomonas aeruginosa NCTC 10490 > 100

Testbeispiel 2:

Bestimmung der Antitumor-Wirksamkeiten der Substanz IT-62-B:
A. Bestimmung der 50% Inhibitor-Konzentration gegen die eingestellte Kulturzelllinie, abgeleitet vom menschlichen Nasopharyngeal-Karzinom:
Eine 50% Inhibitor-Konzentration (IC&sub5;&sub0;) der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung gegen eine eingestellte Kulturzelllinie (KB-Zelllmie), abgeleitet vom menschlichen Nasopharyngeal-Karzinom, wurde bestimmt. Insbesondere wurde die KB-Zelllinie (2 · 10³ Zellen/ml Medium) in einem Eagle's Minimalmedium, das mit 10% Kalbserum ergänzt wurde, kultiviert, und 3 ml dieses Kulturmediums wurden in einer Plastik-Petrischale inkubiert, um es bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator (5% CO&sub2;) zu inkubieren. Nach der Inkubation über Nacht wurde die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zugegeben mit der Verbindung, die von einer Konzentration von 1 ug/ml auf eine Konzentration von 1 · 10&supmin;&sup6; ug/ml durch 10-fache Verdünnung verdünnt wurde. Nach der Inkubation von 3 Tagen, wurden die Zellen von der Oberfläche der Petrischale mit Trypsin entfernt, um lebensfähige Zellzahlen unter einem optischen Mikroskop zu zählen, durch ein Farb-Ausschließungsverfahren unter Verwendung von Trypanblau, wodurch eine Konzentration (IC&sub5;&sub0;) berechnet wurde, die im Wesentlichen eine 50%-Wachstumsinhibierung im Vergleich mit einer Kontrolle zeigte. Als Ergebnis wurde IC&sub5;&sub0; zu 0,006 ug/ml bestimmt.
B. Überlebenseffekt gegen Murin-Leukämie-PS88-Zellen, die intraperitoneal implantiert wurden:
Die Antitumor-Wirksamkeit der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde durch den Überlebenseffekt gegen Murin-Leukämie (p388-Zellen) beurteilt. Drei männliche CDF&sub1;-Mäuse (im Alter von 6 Wochen) wurden als Versuchstiere für eine Gruppe, an die etwas verabreicht wurde, verwendet, und 10 Mäuse für eine Kontrollgruppe, die nicht behandelt wurde. Murin-Leukämie-PS88-Zellen (1 · 10 Zellen) wurden intraperitoneal in jede Maus implantiert. Nach Ablauf eines Zeitraums von 1 Tag (der erste Tag) nach der Implantierung, wurde die Substanz IT-62-B, die in einer 3,5%igen Lösung von Dimethylsulfoxid in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst wurde, intraperitoneal den Mäusen der Gruppe, der etwas verabreicht wurde, in einer Dosis von 0,25 mg/kg verabreicht, um so die Überlebenstage der Mäuse zu beobachten. Der prozentuale Zuwachs des Überlebens wurde berechnet aus den jeweiligen Überlebenstagen, die gemäß der folgenden Gleichung erhalten wurden und ergab 119%.
Prozentualer Zuwachs des Überlebens = [(Durchschnittliche Überlebenstage der Gruppe, der etwas verabreicht wurde/- Durchschnittliche Überlebenstage der Kontrollegruppe, der nichts verabreicht wurde) - 1] · 100(%)

Ergebnisse:

Wie in Testbeispiel 1 gezeigt, zeigte die Substanz IT-62-B gemäß der vorliegenden Erfindung gute antibakterielle Wirksamkeiten gegen Gram-positive Bakterien und einige Gramnegative Bakterien. Daneben, wie in Testbeispiel 2 gezeigt, hatte die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung die 50% Inhibitor-Konzentration (IC&sub5;&sub0;) von 0,006 ug/ml gegen die eingestellte Kulturzelllinie (KB-Zelllinie), abgeleitet vom menschlichen Nasopharyngeal- Karzinom, und zeigte den prozentualen Zuwachs von 119% bei dem Überleben der Mäuse, welchen die Murin-Leukämie-P388-Zellen intrapertitoneal implantiert wurden. Die Verbindung zeigte daher starke Antitumor-Wirksamkeiten, sowohl in in vitro als auch in in vivo Tests.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Die Substanz IT-62-B gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt gute antibakterielle Wirksamkeiten gegen Gram-positive Bakterien und einige Gramnegative Bakterien und besitzt ebenso hervorragende Antitumor-Wirksamkeiten gegen Tumore, wie z. B. das menschliche Nasopharyngeal-Karzinom, und ist daher als Medikament geeignet.

Claims

1. Substanz IT-62-B der folgenden Formel (1):

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz IT-62-B gemäß Anspruch 1, das die Kultivierung eines die Substanz IT-62-B gemäß Anspruch 1 erzeugenden und der Gattung Streptomyces angehörenden Mikroorganismus, um eine derartige Verbindung in der Liquorkultur herzustellen und anzureichern, sowie die Abscheidung der Verbindung, beinhaltet.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung der Substanz IT-62-B, wobei der Mikroorganismus aus dem Stamm PERM BP-4666 (Streptomyces sp. Stamm IT-62) ist, der beim National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan niedergelegt ist, oder eine Variante davon.

4. Medikament, das die Substanz IT-62-B als aktiven Bestandteil umfasst.

5. Das Medikament gemäß Anspruch 4, wobei das Medikament ein Heilmittel bei der Behandlung durch Bakterieninfektion hervorgerufener Krankheiten oder eines Tumors ist.

6. Medizinisches Mittel, das eine effektive Menge der Substanz IT-62-B gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch zulässigen Träger aufweist.

7. Medizinisches Mittel nach Anspruch 6, das bei der Behandlung durch Bakterieninfektion hervorgerufener Krankheiten oder eines Tumors brauchbar ist.

8. Verwendung der Substanz IT-62-B gemäß Anspruch 1 bei der Bereitung eines Medikaments.

9. Die Verwendung bei der Bereitung eines Medikaments gemäß Anspruch 8, wobei das Medikament ein Heilmittel bei der Behandlung einer durch Bakterieninfektion hervorgerufenen Krankheit oder eines Tumors ist.