DK159117B

DK159117B - Fremgangsmaade til fremstilling af de rene enkeltfaktorer 1, 2, 3, 4 og 5 af teichomycin a2 eller farmaceutisk acceptable salte deraf

Info

Publication number: DK159117B
Application number: DK245883A
Authority: DK
Inventors: Angelo Borghi; Rosa Pallanza; Carolina Coronelli; Giovanni Cassani
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1982-06-08
Filing date: 1983-05-31
Publication date: 1990-09-03
Also published as: IE831329L; ZA833607B; IT8321432A0; KR900008246B1; FR2528050A1; JPH02288887A; HU193538B; FR2528050B1; NO159104C; NZ204480A; ES522941A0; ES8503689A1; JPH0517237B2; MY8700002A; SE8303211D0; PT76831B; FI831660A0; GR78267B; GB2121401B; JPH0224278B2

Description

i

DK 159117 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af de rene enkeltfaktorer 1, 2, 3, 4 og 5 af teichomycin Ag eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

5 Teichomycin Ag er et blandt flere forskellige antibio tiske stoffer der vindes ved dyrkning af arten Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte (se dansk patentskrift nr. 141.022). Ved den 10 fremgangsmåde der er beskrevet i det nævnte patentskrift udvindes en antibiotisk virksom blanding indeholdende teichomycin A^, Ag og Ag fra den fraskilte gæringssuppe ved ekstraktion med et passende organisk opløsningsmiddel som er ublandbart med vand og udfældning fra ekstraktions-opløsnings-15 midlet ved sædvanlige procedurer..Teichomycin Ag skilles derefter fra den således vundne antibiotiske blanding ved hjælp af søjlekromatografering på "Sephadex" ® . Efter at være blevet yderligere renset ved passage gennem en sulfoneret polystyrenharpiks karakteriseres teichomycin Ag ved 20 en lang række forskellige kemisk-fysiske parametre, herunder R^-værdier, i et sæt papir- og tyndlagskromatografiske systemer hvor denne forbindelse opførte sig som et sandt enhedsprodukt .

Det har imidlertid nu uventet vist sig at teichomycin 25 Ag faktisk indeholder en blanding af flere coproducerede, nær beslægtede antibiotiske materialer hvis hovedfaktorer har fået betegnelserne henholdsvis teichomycin Ag faktor 1, teichomycin Ag faktor 2, teichomycin Ag faktor 3, teichomycin Ag faktor 4 og teichomycin Ag faktor 5. Det har også vist 30 sig at disse rene enkeltfaktorer er biologisk skélnelige fra teichomycin Ag-komplekset ved at de har højere grad af antibiotisk aktivitet mod følsomme mikroorganismer.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af de nævnte fem enkeltfaktorer, der har 35 de i krav 1's indledning angivne egenskaber, eller farmaceutisk acceptable salte deraf, er ejendommelig ved at teichomycin Ag, der er beskrevet i ovennævnte danske patentskrift, 2

DK 159117B

adskilles i de enkelte faktorer ved reversfase-fordelings-gaskromatografering eller ionbytterkromatografering, hvorpå man om ønsket omdanner de vundne forbindelser til farmaceutisk acceptable salte deraf på i og for sig kendt måde.

5 Med betegnelserne "teichomycin ' "teichomycin A2- kompleks" eller "antibiotikumkompleks" sigtes i nærværende beskrivelse til den blanding som indeholder de ovennævnte fem coproducerede antibiotiske faktorer, opnåelig fx ud fra angivelser i dansk patentskrift nr. 141.022 og som der er 10 benævnt teichomycin A2.

Adskillelse af komplekset i de rene hovedenkeltfaktorer kan opnås ved reversfase-fordelings-kromatografering eller ionbytterkromatografering. I førstnævnte tilfælde bruges inaktiveret silika-15 gel hensigtsmæssigt som kolonnepakning og en gradient-elue- ringsvæske af acetonitril og vandigt ammoniumformiat som fremkalder, mens der i sidstnævnte tilfælde hensigtsmæssigt bruges en geltype-anionbytter som den stationære fase og vandige puffere eller blandinger af vandige puffere og ikke-vandige 20 opløsningsmidler som elueringssystemer. Specielt er der opnået optimale adskillelsesresultater ved at føre en opløsning af · teichomycin A2 i en blanding af fortyndet vandigt ammoniumfor-miat og acetonitril gennem en silaniseret silikagelkolonne j og fremkalde kolonnen ved en gradient-eluering i samme opløs- ; 25 ningsmiddelsystem. Der opnås også gode resultater ved at ^ anvende diætylaminoætylderivatet af agarose som den stationære fase og udføre adskillelsen ved progressiv eluering med pufferopløsninger eller blandinger af pufferopløsninger og ikke-vandige vandblandbare opløsningsmidler.

30 Adskillelsesproceduren overvåges ved hjælp af HPLC.

Fraktioner med indbyrdes lignende HPLC-profil kombineres eventuelt og renses yderligere ved præparativ HPLC og afsaltes.

Fra disse opløsninger udvindes de enkelte faktorer derefter ved afdampning af de organiske opløsningsmidler, inddampning ;

35 af vandindholdet til et lille rumfang og tilsætning af overskud af et organisk opløsningsmiddel i hvilket forbindelserne I

ikke er opløselige for at udfælde de vundne produkter. i i ! f

DK 159117B

3 I det følgende gives der et specifikt eksempel for bedre at belyse fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

Eksempel

Adskillelse af teichomycin A^-faktorerne 1, 2, 3, 4 og 5 5 10 g teichomycin A2~kompleksf vundet ved den fremgangs måde som er angivet i dansk patentskrift nr. 141.022, opløses i 1 liter 0,2%s ammoniumformiat/acetonitril-blanding 9:1 og reguleres til pH 7,5 med IN NaOH. Denne opløsning føres gennem en kolonne indeholdende 500 g silaniseret silikagel 10 60 ("Merck"® ).

Derefter elueres kolonnen med en lineær gradient fra 10% til 20% acetonitril i en 0,2%s ammoniumformiatopløsning i et samlet rumfang på 10 liter.

Der opsamles fraktioner på λ* 20 ml og kontrolleres ved 15 hjælp af HPLC.

I nedentående tabel I angives retentionstiderne (t^) for teichomycin A2~faktorerne 1, 2, 3, 4 og 5 ved en repræsentativ HPLC-adskillelse. Arbejdsbetingelserne var:

Kolonne: 5μ "Zorbax"®ODS (du Pont)..

20 Mobil fase: Lineær gradient fra 0%B til 50%B i A i 40 minutter, idet A: 25 mM NaH2P04/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; B: 25 mM NaH2P04/acetonitril 3:7, pufret til pH 6,0 med 0,1N 25 NaOH.

Strømning: 2 ml/min.

Detektor: UV-fotometer ved 254 nm.

Tabel I

30 Teichomycin A2, faktor Retentionstid (minutter) 1 21,2 2 22,6 3 23,3 35 4 25,8 5 26,4 3,5-dihydroxytoluen (intern standard) 8,84

DK 159117 B

4

Fraktioner med ensartet HPLC-profil forenes og det organiske opløsningsmiddel afdampes under nedsat tryk. De tilbageværende vandige opløsninger føres gennem en kolonne indeholdende 10 g silaniseret silikagel (60) ( Merck ). Kolonnen _ vaskes med destilleret vand for at eliminere ammoniumformia-tet og elueres derpå med 50%s vandigt acetonitril.

Eluatet koncentreredes til et lille rumfang ved tilsætning af butanol for at lette afdampningen af vandet, og derefter udfældes der med en 1:1 blanding af acetone og ætylæter.

^ g Rent teichomycin faktor 1 (410 mg) og faktor 2 (770 mg) vindes ved denne fremgangsmåde.

Teichomycin faktor 3 som en 1:1 blanding med teichomycin A2 faktor 2 renses yderligere ved HPLC på en semipræpa-rativ kolonne under følgende behandlingsbetingelser: , _ Kolonne: Whatman "Partisil" ® ODS M 9 10/50 1 5

Mobil fase: 0,2% ammoniumformiat i I^O/acetonitril 76:24 Strømning: 4,5 ml/min.

Detektor: UV-fotometer ved 254 nm Belastning: 20 mg

Også i dette tilfælde overvåges rensningen ved undersøgelse af hver af fraktionerne ved HPLC.

Fraktioner indeholdende ren teichomycin A2 faktor 2 såvel som fraktioner indeholdende ren teichomycin A2 faktor 3 forenes, afsaltes og udfældes som beskrevet foran (udbytte: 2^ 510 mg teichomycin A2 faktor 2 og 520 mg teichomycin A2 fak tor 3) .

Fraktioner indeholdende faktorerne 4 og 5 i mængdeforholdet 1:1 (ca. 500 mg), vundet fra den første kolonne, forenes med en anden portion af fraktioner indeholdende en blan-2Q ding af faktorerne 4 og 5 (ca. 490 mg) vundet på samme måde fra en anden, parallel adskillelse, og adskillelse indbyrdes ved semipræparativ HPLC under anvendelse af samme arbejdsbetingelser som beskrevet ovenfor til rensning af teichomycin A2 faktor 3, hvorved der vindes 350 mg teichomycin A2 faktor 4 og 300 mg teichomycin A2 faktor 5.

DK 159117B

5

Kemisk-fysisk karakterisering af de rene enkeltfaktorer af teichomycin A2

Teichomycin A^ faktor 1 er et hvidt amorft pulver som ved opvarmning begynder at blive mørkt ved ca. 220°C og helt 5 nedbrydes ved 255°C, og som har følgende egenskaber: a) Det er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH <2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; det er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; det er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten 10 uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid.

b) Det har et ultraviolet absorptionsspektrum, vist i tegningens figur 1, som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,IN saltsyre: λ 278 nm (E^* = 49,5), max lem * 0 15 (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm (E, = 50,0), max lem (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: Xmax 297 nm (E^cm = 72,1).

c) Et infrarødt absorptionsspektrum i nujol, vist i tegningens figur 2, med følgende absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nu- 20 jol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol).

d) Elementæranalyse efter at prøven i forvejen er blevet tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (% Aw = 8,5) viste følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gen- 25 nemsnit): kulstof 56,70%, hydrogen 4,90%, nitrogen 6,65%, klor 3,80% og oxygen (som differens) 27,95%.

e) En retentionstid (t„) på 21,2 minutter ved analyse K (S) ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax"^ ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 30 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 25 mM Na^PO^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; opløsning B: 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7 pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med strømningshastigheden 2 ml/min (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen t_ = 8,84 minutter).

K 1 35 f) Følgende grupper signaler i 270 MHz H NMR-spektrum (hele spektret er vist på tegningens figur 3), registreret i DMSO-dg med tilsætning af nogle få dråber D2O (koncentrat!-

DK 159117B

6 on 25 mg/0,5 ml) (TMS som intern standard: δ = 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m), 1,7-2,3 (m), 2,7-4,0 (m), 4,0-4,7 (m), 4,8-5,8 (m) og 6,2-8,1 (m).

g) En sur funktion med evne til at danne salte.

h) En saltdannende basisk funktion.

5 i) En molekylvægt på ca. 1875, bestemt ved massespektro-metrisk analyse under anvendelse af hurtigt atombombardement (FAB) som ionkilde (med hensyn til redegørelse for FAB-masse-spektrometri se fx M. Barber et al., Nature 293, nr. 5830, 270-275 (1981)).

10

Teichomycin A2 faktor 2 er et hvidt amorft pulver som begynder at blive mørkt ved opvarmning til 210°C og som nedbrydes fuldstændigt ved 250°C og som har følgende egenskaber: a) Det er letopløseligt i vand ved pH > 7,0 eller pH < 2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; det er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; det er dårligt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid.

2 0 ^ b) Det har ultraviolet absorptionsspektrum som vist pa tegningens figur 4 og udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: X 278 nm (E^ =48), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: Xmax 278 nm (E^° = 49,0), (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: Xmax 297 nm (E^m = 70,0).

c) Det infrarøde absorptionsspektrum i nujol, vist på tegningens figur 5, har følgende iagttagelige absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815 og 720 (nujol).

30 d) Elementæranalysen efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 9,8) som viste følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 56,15%, hydrogen 5,15%, nitrogen 6,30%, klor 3,90% og oxygen (som differens) 28,50%.

35 0 e) En retentionstid (t_) på 22,6 minutter ved analyse ·**- ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax" w ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til

DK 159117 B

7 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A:

25 mM Nai^PO^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N

NaOH; opløsning B: 25 mM NaH2P04/acetonitril 3:7, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighed 2 ml/min _ (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen t„ = 8,84 minutter).

5 R 1 f) Følgende grupper signaler i 270 MHz H NMR-spektrum (hele spektret er vist på tegningens figur 6), registreret i DMSO-dg med tilsætning af nogle få dråber D20 (koncentration 25 mg/0,5 ml) (TMS som intern standard δ = 0,00 ppm): 1Q 0,7-1,5 (m), 1,8-2,2 (m), 2,7-4,5 (m), 4,6-5,7 (m), 6,2-8,1 (m) .

g) En sur funktion med evne til at danne salte.

h) En saltdannende basisk funktion.

i) En molekylvægt på ca. 1877, bestemt ved FAB-massespek-trometri.

Teichomycin A2 faktor 3 er et hvidt amorft pulver som ved opvarmning begynder at sønderdeles ved 205°C og er helt nedbrudt ved 250°C og som har følgende egenskaber:

2Q a) Det er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH

<2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; det er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; det er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid.

25 b) Det ultraviolette absorptionsspektrum, vist på tegningens figur 7, udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 nm (E^"° = 49,2), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λπ13χ 278 nm (E^ = 50,8), (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: λ 297 nm (E^ = 72,7).

3Q lUcLX XOItl c) Det infrarøde absorptionsspektrum i nujol, vist på tegningens figur 8, har følgende konstaterbare absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2850 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol).

35 d) Elementæranalysen efter at prøven er tørret i forvejen ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%4w = 12,0) viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit):

DK 159117 B

8 kulstof 56,26%, hydrogen 5,20%, nitrogen 6,69%, klor 3,95%, oxygen (som differens) 27,90%.

e) En retentionstid (t-) på 23,3 minutter ved analyse ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax" ^ ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 25 mM NaH2PO^/acetonitril 9:1 pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH, opløsning B: 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7 pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighed på 2 ml/min. (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen t^, = 8,84 minutter).

10 ^1 f) Følgende grupper signaler i 270 MHz H NMR-spektret (hele spektret er vist på tegningens figur 9), registreret i DMSO-dg med tilsætning af nogle få dråber D2O (koncentration 25 mg/0,5 ml) (TMS som intern standard, S = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m), 1,8-2,0 (m), 2,7-4,5 (m), 4,,6-5,7 (m)., 6·,2-&,0· · 15 ' (m) .

g) En sur funktion med evne til at danne salte.

h) En saltdannende basisk funktion.

i) En molekylvægt på ca. 1877, bestemt ved FAB-massespek-trornetri.

20

Teichomycin faktor 4 er et hvidt amorft pulver som ved opvarmning begynder at blive mørkt ved ca. 210°C og er helt nedbrudt ved ca. 250°C, og som har følgende egenskaber: a) Det er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH 25 <2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol;.

det er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; det er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid.

30 ' b) Det har et ultraviolet absorptionsspektrum, vist pa tegningens figur 10, som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,IN saltsyre: λ 278 nm (E^° = 52,5), max -Lem o.

(ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm (EI\ = 52,5) og max -Lem (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: λ 297 nm (E7 = 75,5).

25 max lem c) Et infrarødt absorptionsspektrum i nujol, vist på tegningens figur 11, med følgende absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nu-

DK 159117B

9 jol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol).

d) Elementæranalyse efter at prøven er tørret i forvejen ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 9,8) viste følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kul- 5 stof 56,50%, hydrogen 5,10%, nitrogen 6,50%, klor 3,80%, oxygen (som differens) 28,10%.

e) En retentionstid (t^) på 25,8 minutter ved analyse K (S) ved reversfase· HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax" w ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% 10 opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 25 mM NaE^PO^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH;

opløsning B: 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7, pufret til pH

6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighed på 2 ml/min.

(intern standard: 3,5-dihydroxytoluen tD = 8,84 minutter).

15 , , K

f) En sur funktion med evne til at danne salte.

g) En saltdannende basisk funktion.

h) En molekylvægt på ca. 1891, bestemt ved FAB-massespek-trometri.

20

Teichomycin A2 faktor 5 er et hvidt amorft pulver som begynder at blive mørkt ved opvarmning til 210°C og er fuldstændigt nedbrudt ved 250°C og som har følgende egenskaber:

a) Det er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH

<2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; 25 det er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; det er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid.

b) Det har et ultraviolet absorptionsspektrum, vist på 30 tegningens figur 12, som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 nm (E^° = 49,6), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ x 278 nm (E^-6 = 51,8), (iii) i 0,IN natriumhydroxyd: λ 297 nm (E^ = 78,8).

max lem c) Et infrarødt absorptionsspektrum i nujol, vist på tegningens figur 13, med følgende konstaterbare absorptionsmaxima: 3700-3100, 2060-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol).

DK 159117 B

10 d) Elementæranalysen viser, efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 10,1), udviser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit) : kulstof 56,60%, hydrogen 5,05%, nitrogen 6,63%, 5 klor 3,85% og oxygen (som differens) 27,87%.

e) En retentionstid (tn) på 26,4 minutter ved analyse ^ (S) ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax" ^ ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 25 •jq mM Nal^PO^/acetonitril 9:1, puf ret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; opløsning B: 25 mM NaH2P0^/acetonitril 3:7, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH); med en strømningshastighed på 2 ml/minut (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen, tR = 8,84 minutter).

f) En sur funktion med evne til at danne salte.

15 g) En saltdannende basisk funktion.

h) En molekylvægt på ca. 1891, bestemt ved FAB-massespek-trometri.

Hver af teichomycin A2 faktorerne 1, 2, 3, 4 og 5 inde-2Q holder en sur funktion som har evne til at danne salte. Opfindelsen tager også sigte på fremstilling af farmaceutisk acceptable alkalimetalsalte, jordalkalimetalsalte og ammoniumsalte af teichomycin A2 faktorerne 1, 2, 3, 4 og 5.

Repræsentative alkalimetalsalte og jordalkalimetalsal-25 te er bl.a. salte med natrium, kalium, litium, kalcium og magnium. Med udtrykket ammoniumsalte sigtes til ammoniumsalte og salte med primære, sekundære og tertiære C^-C^-alkyl-ammonium- og hydroxy-(C^-C^)-alkylammoniumsalte.

Alkalimetal- og jordalkalimetalsaltene fremstilles 5Q ved sædvanlige fremgangsmåder der er almindeligt anvendt til fremstilling af metalsalte. Som eksempel kan man opløse tei- j chomycin A2 faktor 1, 2, 3, 4 eller 5 i fri syreform i et passende opløsningsmiddel såsom propylenglykol og gradvis tilsætte den støkiometriske mængde af en passende mineralbase 25 til den dannede opløsning.

De derved dannede alkalimetal- eller jordalkalimetal- i salte kan derefter udvindes ved udfældning med et ikke-opløs- j !

DK 159117 B

11 ningsmiddel og filtrering.

Disse salte kan også fremstilles i i det væsentlige vandfri form ved frysetørring; i dette tilfælde filtrerer man en vandig opløsning indeholdende det ønskede salt, stam-5 mende fra saltdannelse af den fri syreform med et passende alkalimetal- eller jordalkalimetalkarbonat eller -hydroxyd i en sådan mængde at der opnås en pH-værdi mellem 7 og 8, fri for uopløseligt materiale og frysetørres.

De organiske ammoniumsalte kan fremstilles enten ved 1q at sætte en passende valgt amin til en opløsning af den fri sure form af teichomycin A2 faktorerne 1, 2, 3, 4 eller 5 i et passende opløsningsmiddel såsom propylenglykol, hvorefter man afdamper opløsningsmiddel og overskud af aminreagenset; eller ved at bringe de to reagenser i kontakt med hinan-] g den i den mindst mulige mængde vand og derefter udfælde det dannede salt ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel.

Som nævnt foran indeholder hver af teichomycin A2's faktorer 1, 2,3, 4 og 5 også en basisk funktion med evne til saltdannelse. Deres farmaceutisk acceptable syreadditions-2Q salt, der fremstilles på i og for sig kendt måde ved at bringe de rene enkeltfaktorer i kontakt med en forholdsvis stærk syre, fortrinsvis en mineralsyre, omfattes også af den omhandlede fremgangsmåde.

25 Fremstilling af natriumsaltet af teichomycin A2 faktor 2

En vandig opløsning af teichomycin A2 faktor 2 (150 mg, 15 ml) bringes til pH 8,0 ved dråbevis tilsætning af 0,1N NaOH. Den dannede opløsning filtreres, overføres til kammeret i et frysetørringssystem og fryses. Efter at frysningen er 30 fuldført evakueres kammeret til 0,1 Torr og sublimeres ved at man bringer varmepladen til en temperatur på 0°C. Denne proces fortsætter indtil produktet er næsten tørt (ca.

1% vand). Titrering af en opløsning af teichomycin A2 faktor 2's natriumsalt, vundet på denne måde, i 25 ml metylcellosol-35 ve/H20 3:1 med 0,1N HC1 beviste tilstedeværelse af to titrer-bare funktioner, kendetegnet ved pK-værdierne henholdsvis

DK 159117 B

12 7,03 og 4,78.

Ved at gå frem på den ovenfor beskrevne måde, men ud fra teichomycin A2 faktorerne 1, 3, 4 eller 5 kan man vinde de tilsvarende natriumsalte. Bestemmelsen af natrium i 5 de sluttelige salte bekræfter dannelse af et mononatriumsalt.

Biologisk prøvning

Den antibakterielle aktivtet in vitro af teichomycin Ά2 faktorer 1, 2, 3, 4 og 5, der viste sig at være i hovedsa-10 gen virksomme mod grampositive bakterier, bestemtes mod kliniske isolater af stafylokokker og streptokokker under anvendelse af en dobbelt fortyndingsmetode i et mikrotitersystem.

Til stafylokokkerne og streptokokkerne bruges der henholdsvis Penassay næringssuppe ("Difco") og Todd-Hewitt nærings-15 suppe ("Difco"). Kulturer der havde levet natten over blev fortyndet på en sådan måde at det endelige inokulum indeholdt 3 ca. 10 kolonidannende enheder pr. ml. Den mindste inhiberende koncentration (MIC) aflæstes som den laveste koncentration der ikke udviste nogen synlig vækst efter 18-24 timers inkube-20 ring ved 37°C. De vundne resultater fremgår af nedenstående tabel II.

25 30 35

DK 159117 B

13 ti m Η m U M o

>1 O - rH

g .p 00 00 O - ^

o mi - » l O

Fj cd o o cd I o m om i i o m i cm m in

-H CMCMOOHOOO'tfH

0 CM - " - - - -

Eh<! oooooooooo ti -ri m . OM o m >i 0 ^ h g .p 00 00 o < ^ .

tn 0Λ - - 1 ? ' „ O x: d o o cd l o m O m I i o m i cm in in 3* -H cmcmoo-hooo^th

0 CM - - - - - - - _T J" _T

„ Eh<! OOOOOOOOOO

_______ - d ro

cm H

ϋ Vi H

*. >1 0 - H

H ^ g -p OOOOO ^ CM

H 0 m *· * I o «.in

MgmidooinlocM

O \ ΟΉ i i cMinii-l in

_p tn-rl ^CMOOHOHHCMO

X i (1) (N - - - - - ‘ ~ ~ (0 oooooooooo m-----—--

U

CM H d CM

C S -H

O V H

d >i o * 1-1 _ H-H g -p CO CO O - Ηϋ 0ri4 ^ - I ° >, £ cd HHiniom

Hg om I I ni m I n) , _ , (U O -Η cohoohocmh^h n £ ø cm - - - - - " ' ' (CO EH<! oooooooooo B -H -—-----—- (1)

-p d H

•H

m om d >i o h

g 4J VO CO » CM eT

-P OM * ** o * (i) f; id HH i o o m m om i i lo i i cm

-Η -Η cOCMOHCMOCMH’i’H

> 1) CM

-ri gi < OOOOOOOOOO

-P ___________——

cd 0) M

Ό O

Η H 0 g , , , 0 Id-Pc ΙΟ'^Γ'ΟίηΗΗΗΗΗ •h mød

M d 0 -P

ø ed m 0 m______—-—- m: id Γη g rjHøøøøøøØØ m ø oodddddddd ti -H 00000000000 (0 ti 0 OHO oøo o oøo O 00 cd o o 'ti o o cd o o odo o o d

o td 0 OH 00 OH 00 0 0H0 O OH

S-, Li H Hg 00 Od OH O OM 0 0 O 0-P

m o >10 >i m -Pd mo mm m -p d -p "ri « ,n « h o Ædmøftøftgftdftøp^fttiftø ft d

t> H n.øØi'CiØCr'ØdØOØHØHØO'ØHØH

mi dMdHMOMØM<UM-PMHMdM>Md ti h mdmftm>imdmdmHmdmdmomft h g oh) mid uiftwftwm rag m« w»i ΜΛ wd

DK 159117 B

14

Relationen mellem den mikrobiologiske styrke af de enkelte faktorer 1, 2, 3, 4 og 5 bestemtes ved agardiffusionsmetoden under anvendelse af Staphylococcus aureus ATCC 6538 som kimtest og teichomycin A2~kompleks som standard. Nærmere 5 betegnet opløses en passende mængde teichomycin A2 faktor 1, teichomycin A2 faktor 2, teichomycin A2 faktor 3, teichomycin A2 faktor 4, teichomycin A2 faktor 5 og teichomycin A2~kompleks, anvendt som standard, i dimetylformamid til en koncentration på 2000 μρ/πιΐ. Disse opløsninger fortyndes 1Q yderligere under anvendelse af fosfatpuffer 0,067M pH 7,4 suppleret med 1% okseserum for at give følgende koncentrationer: 2,5, 5, 10 og 20 μg/ml.

Derefter mættes filtrerpapirskiver med prøveopløsningerne og anbringes med regelmæssige mellemrum på overfladen 1 g af agarplader "tilsået" med en suspension af testorganismen. Pladerne inkuberes ved 37°C i 18 timer hvorpå man måler diameteren af inhiberingszonerne. De opnåede data fødes i en computer til beregning af styrken af de individuelle faktorer i forhold til komplekset.

2Q Resultaterne af disse prøver er som følger: teichomycin A2 faktor 1 841 U/mg teichomycin A2 faktor 2 1086 U/mg teichomycin A2 faktor 3 1131 U/mg teichomycin A2 faktor 4 1066 U/mg 25 teichomycin A2 faktor 5 954 U/mg teichomycin A2-kompleks 1000 U/mg

Teichomycin A2 faktorerne 2, 3, 4 og 5 afprøvedes også ved forsøgsinfektioner fremkaldt af Streptococcus pneumoniae og Streptococcus pyogenes hos mus. Forsøgene udførtes 2q i sammenligning med teichomycin A2~komplekset. De opnåede resultater fremgår af nedenstående tabel III.

35

DK 159117B

15

Tabel III

In vivo antibakteriel aktivitet

Forbindelse ED50 (rog/kg/dag) s.c.

5__S. pneumoniae L 44 s. pyogenes L 49

Teichomycin A_ faktor 2 0,28 (0,22-0,34) 0,15 (0,13-0,18)

Teichomycin A« faktor 3 0,27 (0,23-0,32) 0,13 (0,11-0,16) 10 Teichomycin A2 faktor 4 0,12 (0,98-0,14) 0,098-(0,073-0,11)

Teichomycin A„ faktor 5 0,13 (0,10-0,15) 0,10 (0,098-0,13)

Teichomycin A_ kompleks 0,35 (0,28-0,44) 0,18 (-) 15

Den tilnærmede akutte toxicitet hos mus (intraperitone-al) for teichomycin A2 faktorerne 1, 2, 3, 4 og 5 fremgår af nedenstående tabel IV.

20 Tabel IV

Akut toxicitet hos mus (i.p.)

Forbindelse Tilnærmet LD50 (mg/kg)

Teichomycin A2 faktor 1 >1500 <2000 25 Teichomycin A2 faktor 2 >1500 <2000

Teichomycin A2 faktor 3 >1000 <1500

Teichomycin A2 faktor 4 > 500 <1000

Teichomycin A2 faktor 5 > 500 <1000 30 Det fremgår af det foregående at de omhandlede forbin delser teichomycin A2 faktor 1, teichomycin A2 faktor 2, teichomycin A2 faktor 3, teichomycin A2 faktor 4 og teichomycin A2 faktor 5 effektivt kan anvendes som virksom bestanddel i antimikrobielle præparater til brug i human- og veterinærme-35 dicinen til forebyggelse og behandling af infektionssygdomme fremkaldt af patogene bakterier der er følsomme for de omhandlede virksomme bestanddele. I sådanne behandlinger kan disse forbindelser anvendes som sådanne eller bruges som

DK 159117 B

16 enkelte individuelle faktorer eller, i betragtning af ens-hartethed af deres aktivitetsmønster, også i form af blandinger af to eller flere af de fem faktorer i et hvilket som helst mængdeforhold.

5 Disse forbindelser kan administreres oralt, lokalt eller parenteralt, men parenteral indgift foretrækkes. I afhængighed af indgiftsvejen kan forbindelserne oparbejdes til forskellige dosisformer. Præparater til oral indgift kan have form af kapsler, tabletter, flydende opløsninger 10 eller suspensioner. Som kendt i farmacien kan kapsler og tabletter foruden det virksomme stof indeholde konventionelle excipienter såsom fortyndingsmidler, fx laktose, kalciumfosfat, sorbitol eller lignende, smøremidler såsom magniumstea-rat eller talkum eller polyætylenglykol, bindemidler såsom 15 polyvinylpyrrolidon, gelatine, sorbitol, tragant eller akaciegummi, aromastoffer og acceptable desintegrerings- og be-fugtningsmidler. Flydende præparater, i almindelighed i form af vandige eller olieagtige opløsninger eller suspensioner, kan indeholde konventionelle additiver' såsom suspenderings-20 midler. Til lokal anvendelse kan de omhandlede forbindelser også oparbejdes i passende former til absorption gennem huden, slimhinder i næse eller svælg eller bronkialvævene, og de kan hensigtsmæssigt have form af flydende sprøjtepræparater eller inhalationspræparater, pastiller eller svælgpenslings-25 præparater. Til behandling af øjne eller øren kan præparaterne have flydende eller halvflydende form. Præparater til lokal påføring kan oparbejdes med hydrofobe eller hydrofile grundlag såsom salver, cremer, lotioner, penslingspræparater eller pulvere.

30 Præparater til injektion kan have sådanne former som suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olieagtige eller vandige bærematerialer og kan indeholde hjælpemidler såsom suspenderings-, stabiliserings- og/eller dispergerings-midler. Det virksomme stof kan også have pulverform til re-35 konstituering på anvendelsestidspunktet med et passende bærestof såsom sterilt vand.

Mængden af virksomt stof til indgift afhænger af forskellige faktorer såsom størrelsen og tilstanden af patienten,

DK 159117 B

17 indgiftvejen og indgifthyppigheden samt sygdommens årsag.

Teichomycin A^ faktorer 1, 2, 3, 4 og 5 er i almindelighed effektive ved daglige doser mellem ca. 0,1 og ca.

20 mg virksomt stof pr. kg legemsvægt, eventuelt opdelt i to deldoser om dagen. Særlig hensigtsmæssige præparater er sådanne fremstillet i form af dosisenheder indeholdende fra ca. 50 til ca. 250 mg pr. enhed.

Foruden til anvendelse som medikamenter kan de omhandlede forbindelser også bruges som vækstfremmende midler til dyr.

10 J

Til dette formål kan en eller flere af de omhandlede forbindelser indgives oralt i et passende foder. Den præcist anvendte koncentration er den som behøves til at tilvejebringe det virksomme stof i en vækstfremmende effektiv mængde når der fortæres normale fodermængder.

Tilsætningen af de omhandlede forbindelser til et dyrefoder sker fortrinsvis ved at man fremstiller en passende foder-forblanding indeholdende det virksomme stof i en effektiv mængde og derefter inkorporerer denne forblanding i hele foderrationen.

20

Man kan også indblande et mellemkraftigt koncentrat eller fodersupplement indeholdende det virksomme stof i foderet.

Den måde på hvilken sådanne foder-forblandinger eller ^ fuldstædige rationer kan fremstilles og indgives er beskrevet i sådanne referencebøger som "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., San Francisco, USA 1969 eller "Livestock Feeds and Feeding", 0 and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977.

30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling i i det væsentlige ren tilstand af et antibiotisk stof udvalgt blandt 5 teichomycin A2 faktor 1, teichomycin A2 faktor 2, teichomy-cin A2 faktor 3, teichomycin A2 faktor 4 og teichomycin A2 faktor 5, der identificeres ved nedenstående fysiske egenskaber: Teichomycin A2 faktor 1: et hvidt amorft pulver der 10 ved opvarmning begynder at blive mørkt ved ca. 220°C og helt sønderdeles ved 255°C og som a) er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH <2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; dårligt oplø- · 15 seligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid; b) har et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 1 ΙΕ13.Λ 20 nm (E,0 = 49,5), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm η ø xcm max (ΕΓ-0 = 50,0), og (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: λ 297 lem- Q max ™ <Elom “ 72'1); c) har et infrarødt absorptionsspektrum i nujol med følgende absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 25 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol); d) har en elementæranalyse efter at prøven i forvejen er blevet tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (% Aw = 8,5), der viste følgende tilnærmede procentvise sammen- 50 sætning (gennemsnit): kulstof 56,70%, hydrogen 4,90%, nitrogen 6,65%, klor 3,80% og oxygen (som differens) 27,95%. e) har en retentionstid (t„) på 21,2 minutter ved analyse ^ (r) ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax"^ ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 35 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 25 mM Na^PO^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; opløsning B: 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7 pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med strømningshastigheden 2 ml/min DK 159117 B (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen tn = 8,84 minutter); K 1 f) har følgende grupper signaler i 270 MHz H NMR-spektrum registreret i DMSO-dg med tilsætning af nogle få dråber D2O (koncentration 25 mg/0,5 ml) (TMS som intern standard: δ = 5 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m), 1,7-2,3 (m), 2,7-4,0 (m), 4,0-4,7 (m), 4,8-5,8 (m) og 6,2-8,1 (m); g) har en sur funktion med evne til at danne salte; h) har en saltdannende basisk funktion; og i) har en molekylvægt på ca. 1875, bestemt ved FAB-masse-1 q spektrometri. Teichomycin A2 faktor 2: et hvidt amorft pulver som begynder at blive mørkt ved opvarmning til 210°C og som nedbrydes fuldstændigt ved 250°C og som a) er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH <2, .jj- i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; er dårligt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid; 2g b) har et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 ·» o ItlcLX nm (E,° = 48), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm η 0 lem iticix (E ° = 49,0), (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: λ 297 nm «t-Qul ItlcLX (Elom = 70'°>! 2^ c) har et infrarødt absorptionsspektrum i nujol med føl gende iagttagelige absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815 og 720 (nujol); d) har en elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 9,8) som viste følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 56,15%, hydrogen 5,15%, nitrogen 6,30%, klor 3,90% og oxygen (som differens) 28,50%; _r e) har en retentionstid (tn) på 22,6 minutter ved analyse k (r) ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax" ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: DK 159117 B 25 mM Na^PC^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; opløsning B; 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighed på 2 ml/min (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen tR = 8,84 c minutter); D 1 f) har følgende grupper signaler i 270 MHz H NMR-spek- trum, registreret i DMSO-dg med tilsætning af nogle få dråber D2O (koncentration 25 mg/0,5 ml) (TMS som intern standard δ = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m), 1,8-2,2 (m), 2,7-4,5 (m), 4,6-1Q 5,7 (m), 6,2-8.,1 (m); g) har en sur funktion med evne til at danne salte; h) har en saltdannende basisk funktion; og i) har en molekylvægt på ca. 1877, bestemt ved FAB-masse-spektrometri.

15 Teichomycin A2 faktor 3: et hvidt amorft pulver som ved opvarmning begynder at sønderdeles ved 205°C og er helt nedbrudt ved 250°C og som a) er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH <2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; er 2Q svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid; b) har et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser „c følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 ^j i0 max nm (Ε!Γ0 = 49,2), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm 1. icm max (E:t0 = 50,8), (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: λ 297 nm •iQm max <EIcm = 72'7>; c) har et infrarødt absorptionsspektrum i nujol med følgen-2Q de konstaterbare absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2850 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol); d) har en elementæranalyse efter at prøven er tørret 25 i forvejen ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 12,0) der viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 56,26%, hydrogen 5,20%, nitrogen 6,69%, klor 3,95%, oxygen (som differens) 27,90%; DK 159117B e) har en retentionstid (t„) på 23,3 minutter ved analy- ^ (r) se ved revers fase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax"^ ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 5 25 mM NaH^PO^/acetonitril 9:1 pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH, opløsning B: 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7 pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighed på 2 ml/min (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen t„ = 8,84 minutter); K 1 f) har følgende grupper signaler i 270 MHz H NMR-spek-10 tret, registreret i DMSO-dg med tilsætning af nogle få dråber D2O (koncentration 25 mg/0,5 ml (TMS som intern standard, δ = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m), 1,8-2,0 (m), 2,7-4,5 (m), 4,6-5,7 (m), 6,2-8,0 (m); g) har en sur funktion med evne til at danne salte; 15 h) har en saltdannende basisk funktion; og i) har en molekylvægt på ca. 1877, bestemt ved FAB-masse- spektrometri. Teichomycin A2 faktor 4: et hvidt amorft pulver som ved opvarmning begynder at blive mørkt ved ca. 210°C og er 2o helt nedbrudt ved ca. 250°C og som a) er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH <2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; er svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloro- 25 form, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid; b) har et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 -j ^ ΪΪ13.Χ nm (E^° = 52,5), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm

10 -Lcinn iiicix ολ (E7° = 52,5) og (iii) i 0,IN natriumhydroxyd: λ 297 nm lgm max <EIcm= 75'5)i c) har et infrarødt absorptionsspektrum i nujol med følgende absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 35 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol); d) har en elementæranalyse efter at prøven er tørret i forvejen ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 9,8) der viste følgende tilnærmede procentvise sammensætning DK 159117B (gennemsnit.): kulstof 56/50%, hydrogen 5,10%, nitrogen 6,50%, klor 3,80%, oxygen (som differens) 28,10%? e) har en retentionstid (t_) på 25,8 minutter ved analyse K (r) ved reversfase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax" ^

5 ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 25 mM NaH^PC^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; opløsning B: 25 mM Na^PC^/acetonitril 3:7, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighed på 2 ml/min. 1 q (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen tR = 8,84 minutter); f) har en sur funktion med evne til at danne salte; g) har en saltdannende basisk funktion; og h) har en molekylvægt på ca. 1891, bestemt ved FAB-masse-spektrornetri.

15 Teichomycin A2 faktor 5: et hvidt amorft pulver som begynder at blive mørkt ved opvarmning til 210°C og er fuldstændigt nedbrudt ved 250°C og som a) er letopløseligt i vand ved pH >7,0 eller pH <2, i dimetylformamid, dimetylsulfoxyd og propylenglykol; er 2Q svagt opløseligt i metylcellosolve og glycerol; er tungt opløseligt i metanol og ætanol og næsten uopløseligt i kloroform, benzen, n-hexan, acetonitril, ætylæter, acetone, ætylacetat og kulstoftetraklorid; b) har et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: (i) i 0,1N saltsyre: λ 278 nm (E,° = 49,6), (ii) i fosfatpuffer pH 7,4: λ 278 nm (Εη = 51,8), (iii) i 0,1N natriumhydroxyd: λ 297 nm IpIU IU3.X (E^m. 78,8); c) har et infrarødt absorptionsspektrum i nujol med føl-3Q gende konstaterbare absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol); d) har en elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (%Aw = 10,1), 25 der viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit) : kulstof 56,60%, hydrogen 5,05%, nitrogen 6,63%, klor 3,85% og oxygen (som differens) 27,87%; DK 159117B e) har en retentionstid (tR) på 26,4 minutter ved analy se ved revers fase HPLC under anvendelse af en 5μ "Zorbax"® ODS-kolonne og eluering med en lineær gradient fra 0% til 50% opløsning B i opløsning A i 40 minutter (opløsning A: 2 25 mM NaE^PO^/acetonitril 9:1, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH; opløsning B: 25 mM Na^PO^/acetonitril 3:7, pufret til pH 6,0 med 0,1N NaOH); med en strømningshastighed på 2 ml/minut (intern standard: 3,5-dihydroxytoluen, t„ = 8,34 minutter); 1Q f) har en sur funktion med evne til at danne salte; g) har en saltdannende basisk funktion; og h) har en molekylvægt på ca. 1891, bestemt ved FAB-masse-spektrometri, eller farmaceutisk acceptable salte deraf, kende-^ tegnet ved at teichomycin adskilles i de enkelte faktorer ved reversfase-fordelingskromatografering eller ion-bytterkromatografering, hvorpå man om ønsket omdanner de vund-ne forbindelser til farmaceutisk acceptable salte deraf på i og for sig kendt måde. 2Q 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at adskillelsen sker ved søjlekromatografering under anvendelse af en silaniseret silikagelkolonne og en gradientelue-ring med acetonitril i fortyndet vandigt ammoniumformiat som fremkalder.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 25 ved at kolonnen fremkaldes i en lineær gradient af fra 10% til 20% acetonitril i en 0,2%s ammoniumformiatopløsning.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved at man, når en blanding af to faktorer er udvundet fra kolonnen, adskiller den i de enkelte faktorer ved reversfase-30 søjlekromatografering under anvendelse af en oktadecylsilan-kolonne og en blanding af acetonitril/0,2%s vandigt ammoniumformiat 24:76 som fremkalder.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 til fremstilling af teichomycin A9 faktor 2, kendetegnet ved at man opløser 35 Δ teichomycin A2_kompleks i en 0,2%s ammoniumformiat/acetoni-tril-blanding 9:1, regulerer pH til ca. 7,5 ved tilsætning af NaOH, fører den dannede opløsning gennem en silaniseret DK 159117 B silikagelkolonne, fremkalder kolonnen med en lineær gradient fra 10% til 20% acetonitril i en 0,2%s ammoniumformiatopløs- ning, opsamler de fraktioner som har den samme HPLC-profil karakteristisk for teichomycin A2 faktor 2, afdamper det organiske opløsningsmiddel under nedsat tryk, afsalter den 5 tilbageværende vandige opløsning ved at føre den gennem en silaniseret silikagelkolonne, vasker kolonnen med vand, elue-rer den med 50%s vandig acetonitril, koncentrerer eluatet til et ringe rumfang og udfælder ren teichomycin A2 faktor 2 derfra ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at adskillelsen sker ved søjlekromatografering under anvendelse af diætylaminoætylderivatet af agarose som den stationære fase og pufferopløsninger eller blandinger af pufferopløsninger og ikke-vandige vandblandbare opløsningsmidler som elueringsmidler.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der fremstilles en af de antibiotisk virksomme forbindelser teichomycin A2 faktor 1, teichomycin A2 faktor 2 og teichomycin A2 faktor 3 eller et farmaceutisk acceptabelt alkalimetal-, jordalkalimetal- eller ammoniumsalt deraf.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der fremstilles teichomycin A2 faktor 2 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 25 30 35