FI73697B

FI73697B - Foerfarande foer framstaellning av individuella faktorer 1, 2, 3, 4 och 5 av teikomysin a2.

Info

Publication number: FI73697B
Application number: FI831660A
Authority: FI
Inventors: Angelo Borghi; Giovanni Cassani; Rosa Pallanza; Carolina Coronelli
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1982-06-08
Filing date: 1983-05-12
Publication date: 1987-07-31
Also published as: JPH02291278A; AU560966B2; DK159117C; FI831660L; JPH0224278B2; US4542018A; FI73697C; DK245883D0; BE896993A; JPH02288887A; FR2528050B1; DK159117B; ES8503689A1; MY8700002A; GB2121401B; ES536770A0; IL68819A0; DE3320342C2; GB8315003D0; SE8303211D0

Description

1 73697

MENETELMÄ TEIKOMYSIINI A2:n YKSITTÄISTEN TEKIJÖIDEN 1 , 2, 3, 4 JA 5 VALMISTAMISEKSI

Tämä keksintö koskee menetelmää yksilöllisen antibiootin, joka on teikomysiini tekijä 1, teikomysiini A„ 5 tekijä 2, teikomysiini A^ tekijä 3, teikomysiini A? tekijä 4 tai teikomysiini A2 tekijä 5, valmistamiseksi puhtaassa muodossa.

Teikomysiini A^ on yksi monista erilaisista antibiooteista, jotka saadaan viljeltäessä kantaa Actinoplanes Teichomyco-10 ticus nov.sp. ATCC 31121 vi1jelyväliaineessa, joka sisältöä assimiloituvan hiililähteen, typpeä ja epäorgaanisia suoloja (kts. belgialainen patentti No 839,259). Edellä mainitussa patentissa esitetyn menetelmän mukaisesti antibioottinen seos, joka sisältää teikomysiinin A^, A^ ja A^ , saa-15 daan erotetusta käymisliemestä uuttamalla sopivalla, veteen sekoittamattomalla, orgaanisella liuottimena ja seostamalla uuttoliuottimesta yleisillä menetelmillä. Sen jälkeen teikomysiini A„ erotetaan näin saadusta antibioottien seok-2 /jT\ sesta pylväskromatografisesti käyttäen SephadexV_y -pylväs- 20 tä, Sen jälkeen kun teikomysiini A^ on edelleen puhdistettu laskemalla se läpi sulfonoidusta polystyrcenihartsista, se on tunnistettu useilla erilaisilla kemiallis-fys ikaalis il.l.a parametreillä mukaan lukien R^-arvot paperi- ja ohutkerror;- kromatografia-systeemeissä, joissa tämä yhdiste käyttäytyy 25 kuin todellinen, yhtenäinen tuote.

Nyt on yllättäen havaittu, että teikomysiini A? itse asiassa koostuu useiden yhdessä muodostuneiden, läheistä sukua olevien antibioottien seoksesta, jonka päätekijät on nimetty teikomysiini A^ tekijä 1, teikomysiini A? tekijä 2, tei-30 komysiini A^ tekijä 3, teikomysiini A2 tekijä 4 ja teikomysiini A^ tekijä 5. On myös havaittu, että nämä pelkät, yksittäiset tekijät ovat biologisesti eroavia teikomysiini A^-kompleksista siinä, että niillä on suurempi antibioottinen aktiviteetti herkkiä mikro-organismeja vastaan.

2 73697 Tämän keksinnön mukaiset antibiootit valmistetaan lähtemällä teikonys iini A^'.s ta, joka on kuvattu edellä mainitussa belgialaisessa patentissa, erottamalla antibioottinen kompleksi yksittäisiin tekijöihin suuren erotuskyvyn 5 omaavilla, kromatografisilla menetelmillä ja ottamalla päätekijät talteen.

Termit "teikomysiini A2”» "teikomysiini A^-kompleksi" tai "antibioottinen kompleksi", joita käytetään tässä selityksessä, tarkoittavat seosta, joka sisältää edellä mai-10 nitut viisi, yhdessä muodostunutta antibioottista tekijää, jotka saadaan esimerkiksi belgialaisessa patentissa 839,259, joka on liitetty tähän referenssillä, esitetyllä tavalla ja jota seosta mainitussa patentissa kutsutaan teikomysiini Akiksi.

15 Kompleksin erottaminen pelkkiin yksittäisiin päätekijöihin voidaan suorittaa käänteisfaasi erotuksella tai ioninvaih-tokromatografiällä. Edellisessä tapauksessa käytetään tavallisesti inaktiivista piihappogeeliä pylvään pakkaamiseen ja kehittimenä asetonitriilin ja vesipitoisen ammo-20 niunformiaatin gradienttieluointia, kun taas viineksi mainitussa tapauksessa heikko, geeli-tyyppinen anioninvaih-taja on sopivaa käytettäväksi stationäärifaasina ja clu-ointisysteemeinä sopivia ovat vesipitoiset puskurit tai vesipitoisten puskurien ja ei-vesipitoisten liuottimien 25 seokset. Erityisesti optimierotustuloksia on saatu laske malla liuos, jossa teikomysiini A£ on liuotettu laimean, vesipitoisen ammoniumformiaatin ja asetonitriilin seokseen, läpi silanoidusta piihappogeelipylväästä ja pylväs on kehitetty gradientti eluoinnilla samassa liuotinsys-30 teemissä. Hyviä tuloksia on saatu myös käytettäessä agar-oosin dietyyliaminoetyylijohdannaista stationäärifaasina ja erottaminen on suoritettu eluoimalla jatkuvasti puskuriliuoksilla tai puskuriliuosten ja ei-vesipitoisten veden kanssa sekoittuvien liuottimien seoksilla.

35 Erottumista tarkkaillaan HPLC:llä.

Il 73697

Fraktiot, joilla on samanlainen HPLC-profiili , yhdistetään, haluttaessa puhdistetaan edelleen preparatiivisella HPLC: llä ja vapautetaan suolas’a, Tästä liuoksesta saadaan yksittäiset tekijät sen jälkeen talteen haihdut tama 11 a orgaa-5 niset liuottimet, poistamalla vesi pieneen tilavuuteen ja lisäämällä ylimäärin orgaanista liuotinta, johon yhdisteet eivät liukene, jolloin saadut tuotteet saostuvat.

Seuraavat , erityiset: esimerkit kuvaavat paremmin tämän keksinnön mukaista menetelmää. Mainitut esimerkit eivät kui-10 tenkaan mitenkään rajoita keksintöä niissä erityisesti esitettyihin. olosuhteisiin.

TEIKOMYSIINI A?:N TEKIJÖIDEN 1, 2, 3, 4 ja 5 EROTTAMINEN

10 g teikomysiini A^-kompleksia, joka saacaan 3E-patentis-sa 839,259 esitetyn menetelmän mukaan, liuotetaan 1 litraan 15 0,2% ammoniumformiaatti-acetonitriili(9:D-seosta ja pH

säädetään arvoon 7,5 IN NaOH:lla. Tämä liuos lasketaan läpi pylväästä, jossa on 500 g silanoitua piihappoge,e] ia 50 (Merck).

Sen jälkeen pylväs kehitetään lineaarisella gradienti11 a, 20 jossa on 10 % : sta 20 % : ttiin asetönitrii li ·"> 0,2 % : ssa am-moniunforrniaatt iliuoksessa , kokonaistilavuuden ollessa 10 litraa.

Fraktiot, jotka ovat ou 20 ml, kerätään ja tarkistetaan HPLC:llä.

25 Seuraavassa taulukossa I on esitetty retentioajat (tn) teikomysiini Λ^'.η tekijöille 1, 2, 3, 4 ja 5 tyypillisessä HPLC-erotuksessa (ajo-olosuhteet on esitetty taulukon j älkeen): 1+ 73697

TAULUKKO I

Teikomysiini A?:n tekijät retentioaika (Minuutissa) 1 21,2 2 22 ,6 5 3 23,3 4 25,8 5 26,4 3,5-dihydroksitolueeni (sisäinen standardi) 8,84 10 pylväs: 5 μ Zorbax ® ODS (Du Pont); liikkuva faasi: lineaarinen gradientti, joka sisältää 0 %:sta 50 %:ttiin B:tä A:ssa, 40 minuutissa; A) 25 mM Nat^PO^/asetonitriili (9:1) pus- 15 kuroitu pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:lla; B) 25 mM NaH2P04/asetonitriili (3:7) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,IN NaOH:lla; virtaus: 2 ml/minuutti; detektori: UV-fotometri 254 nm.

20 Fraktiot, joilla on samanlainen HPLC-profiili, yhdistetään ja orgaaninen liuotin haihdutetaan alennetussa paineessa. Jäljelle jäävät, vesipitoiset liuokset lasketaan läpi pylväästä, joka sisältää 10 g silanoitua piihappogeeliä (60) (Merck). Pylväs pestään tislatulla vedellä ammoniumformiaa-25 tin poistamiseksi, jonka jälkeen eluoidaan 50 % vesipitoisella asetonitriilillä. Eluaatti konsentroidaan pieneen tilavuuteen, lisäämällä butanolia joudutetaan veden haihtumista ja sen jälkeen saostetaan asetoni-etyylieetteriseok-sella (1:1). Puhtaat teikomysiini A2 tekijä 1 (410 mg) ja 30 tekijä 2 (770 mg) saadaan edellä esitetyllä menetelmällä.

Teikomysiini A2:n tekijä 3, joka on l:l-seoksena teikomysiini A2:n tekijä 2 kanssa, puhdistetaan edelleen HPLC:llä semipreparatiivisessa pylväässä seuraavissa ajo-olosuhteissa: II: 5 73697 . . ' R) pylväs: Whatman Partisxl ' ODS M 9 10/50 ; liikkuva faasi: 0,2 % ammoniumformiaatti H^O:ssa/asotonit- riili (76:24); virtaus: 4,5 ml/minuutti; 5 detektori: UV-fotometri 254 nm; kuorma: 20 mg.

Myös tässä tapauksessa puhdistamista seurataan tarkista malla jokainen fraktio HPLC:llä.

Fraktiot, jotka sisältävät pelkkää teikomysiini : n telo kijää 2 yhdistetään samoin fräktiot, jotka sisältävät pelkkää teikomysiini A^:n tekijää 3, yhdistetään, vapautetaan suolasta ja saostetaan kuten edellä on esitetty. (Saanto: 510 mg tekomysiini A^'-n tekijää 2 ja 520 mg tei-komysiini A^:n tekijää 3).

15 Ensimmäisestä pylväästä saadut fraktiot, jotka sisältävät tekijät 4 ja 5 suhteessa 1:1 (noin 500 mg), yhdistetään toisen fraktioerän kanssa, joka sisältää tekijöiden 4 ja 5 seoksen (noin 490 mg) ja joka saadaan samalla tavalla toisesta rinnakkaisesta erotuksesta, ja erotetaan semipre-20 paratiivisella HPLC:llä, käyttäen samoja ajo-olosuhteita kuin edellä esitettiin teikomysiini A^:n tekijä 3 puhdis tuksen yhteydessä, saadaan 350 mg teikomysiini A^:n tekijää 4 ja 300 mg teikomysiini A^:n tekijää 5.

TEIKOMYSIINI A2:N PELKKIEN YKSITTÄISTEN TEKIJÖIDEN FYSIKO-25 -KEMIALLISET TUNNUSMERKIT

Teikomysiini A2 tekijä 1 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka kuumennettaessa alkaa tummua noin 220°C:ssa ja on täysin hajonnut 255°C:ssa, sillä on seuraavat tunnusmerkit: a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa >7,0 tai pH:ssa 30 -*^2, dimetyyliformamidiin , dimetyylisu lf oksidiin ja propyleeniglykoliin; 6 73697 heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja glyseroliin ’, huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin, melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-5 -heksaaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, ase toniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, joka esitetty li itteenä kuvio 1, jossa esiintyy seuraavat ab-sorptiomaksimit: 10 - 0,1N kloorivetyhapossa: X , 278 nm (E?-% = 49,5) maks lcm ’ - fosfaattipuskurissa pH 7,4: \ , 2 78 nm (E*% = 50,0); maks lcm - 0,1N natriumhydroksidissä:

15 Amaks 297 ™ <Εϊ\=π, = «UU

c) infrapunaspektri nujolissa, esitetty liitteenä kuvio 2, seuraavat absorptiomaksimit: 3700-3100, 2960--2840 (nujoli), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujoli), 1375, (nujoli), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 970, 20 890, 845, 815, 720 (nujoli); d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kuivattu 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (% A w = 8,5), antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset prosentti-koostumukset (keskiarvo): 25 hiiltä 56,70 %, vetyä 4,90 %, typpeä 6,65 %, klooria 3,80 %, happea (saatu erotuksena) 27,95 %; e) retentioaika (t^) 21,2 minuuttia saadaan, kun yhdiste analysoidaan käänteisfaasi HPLC:llä käyttäen 5 μ

Zorbax ® ODS-pylvästä, ja eluointi tapahtuu lineaa-

II

73697 risella gradient!11a, joka sisältää 0 %:sta 50 %: ttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaH^kO^/asetonitriili (9/1) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0 . IN NaOH:lla; 5 liuos B: 25 mM NaH„P0./asetonitriili (3/7) puskuroi- L· 4 tuna pH-arvoon 6,0 0, IN NaOHrlla); virtausnopeus on 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueoni, tR 8,84 minuuttia); f) seuraavat signaaliryhmät rekisteröitiin 270 MKz:n 10 J'H-XMR-spektrissä (koko spektri esitetty liitteenä, kuvio 3) DMSO-dgtssa, johon lisätty muutama tippa D 2 0: t a (kons. 2 5 mg/0,5 ml) (TMS sisäisen;! standardina ö = 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m); 1,7-7,3 (m); 2,7--4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m); g) happofunktio pystyy muodostamaan suoloja; h) suolaa muodostava emäsfunktio; i) molekyylipaino noin 1875, joka määritetty massaspektri- analyysillä käyttäen ionilähteenä nopea-atomista-pom-mitusta (FAB) (FAB-massaspektroskopia: kts. esimerkik- 20 si M, Barber et ai., Nature, 293, No 5830, 270-275 (1981)).

Teikomysiini A^ tekijä 2 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka alkaa tummua kuumennettaessa 210uC:een ja on täysin hajonnut 250°:ssa, sillä on seuraavat tunnusmerkit: 25 a) se on hyvin liukenava veteen pH:ssa >7,0 tai pH: ssa <1 2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksi-diin ja propyleeniglykoliin; heikosti liukenva metyylisellosolveen ja glyseo-roliin; 30 huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n--heksaaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, ase- 73697 8 toniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettispektri, joka esitetty liitteenä (kuvio 4), jossa esiintyy seuraavat absorp-tiomaksimit: 5 - 0,1N kloorivetyhapossa: X . „ 278 nm (E^% = 48) maks lcm - fosfaattipuskurissa, pH 7,4: Λ , 278 nm (E?-% = 49,0) maks lcm * - 0,1N natriumhydroksidissa: 10 > 297 nm (E,% = 70,0); /V maks lcm ’ * c) infrapunaspektri nujolissa, esitetty liitteenä (kuvio S), seuraavat havaittavat absorptiomaksimit: 3700-3100, 2960-2860 (nujoli), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujoli), 1375 (nujoli), 1300, 1260, 1230, 15 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujoli).

d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun yhdiste on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (% A w = 9,8), antaa tulokseksi seuraavat likimää-20 räiset prosenttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,15 %, vetyä 5,15 %, typpeä 6,30 %, klooria 3,90 %, happea (saatu erotuksena) 28,50 %; e) retentioaika (t-,) 22,6 minuuttia saadaan, kun analy-soidaan käänteisfaasi HPLCrllä käyttäen 5 μ Zorbax ^ 25 ODS-pylvästä ja eluointi tapahtuu lineaarisella gra- dientilla, joka sisältää 0 %:sta 50 %:ttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaH2P0l+/asetonitriili (9/1) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,IN NaOH:11a; 30 liuos B: 25 mM Na^PO^/asetonitriili (3/7) puskuroi tuna pH-arvoon 6,0 0,IN NaOH:11a;

II

9 73697 virtausnopeus on 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni , tp 8,84 minuuttia); f) seuraavat signaaliryhmät rekisteröitiin 270 MHz:n 5 ^H-NMR-spektrissä (koko spektri esitetty liitteenä, kuvio 6) DMS0-dc:ssa, johon on lisätty muutama tippa

O

D^Orta (kons. 25 mg/0,5 ml) (TMS sisäisenä standardina δ = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,2 (m); 2,7--4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,1 (m); 10 g) happofunktio pystyy muodostamaan suoloja; h) suolaa muodostava emäs funktio; i) molekyylipaino noin 1877 määritetty FAB-massaspektrc-inetrillä.

Teikomysiini A^ tekijä 3 on valkoinen, amorfinen jauhe, jo-15 ka kuumennettaessa alkaa hajota 205°C:ssa ja on täysin hajonnut 250°C:ssa, sillä on seuraavat tunnusmerkit: a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa >7,0 tai pK:ssa <12, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja propyleeniglykoliin; 20 heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja glyseroliin; huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-hek-saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; 25 b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, joka esitetty liitteenä, kuvio 7, jossa esiintyy seuraavat absorp-tiomaksimit: - 0,1N kloorivetyhapossa: ^ . 278 nm (E^% = 49,2) maks lcm 30 - fosfaattipuskurissa, pH 7,4: Λ . 278 nm (E~% =50,8) maks lcm 10 73697 - 0,IN natriumhydroksidissä: A 297 nm (E*% = 72,7); maks lcm * * c) infrapuna-absorptiospektri nujolissa, esitetty liitteenä, kuvio 8, seuraavat havaittavat absorptLomaksi- 5 mit: 3700-3100, 2960-2850 (nujoli); 1645 , 1590 , 1510 , 1460 (nujoli), 1375 (nujoli), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujoli) i d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kui- 10 vattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (% Δ. w = 12,0) antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset prosent-tikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,26 %, vetyä 5,20 %, typpeä 6,69 %, klooria 3,95 %, happea (saatu erotuksena) 27,90 %; 15 e) retentioaika (t0) 23,3 minuuttia, saadaan analysoi-

K (D

taessa käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen 5 μ Zorbax ^ ODS-pylvästä ja suorittamalla eluointi lineaarisella

gradientilla, jossa on 0 %:sta 50 %:ttiin liuosta B

liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaH^PO^/

20 asetonitriili (9/1) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,1N

NaOHilla, liuos B: 25 mM NaH^PO^/asetonitriili (3/7) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:lla)·, virtausnopeus on 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni, tR 25 8,84 minuuttia); f) seuraavat signaaliryhmät rekisteröitiin 270 MHz:n ^H--NMR-spektrissä (koko spektri esitetty liitteenä, kuvio 9) DMSO-dgissa, johon on lisätty muutama tippa D20:ta (kons. 25 mg/0,5 ml) (TMS sisäisenä standardi- 30 na S = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,0 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,0 (m); g) happofunktio pystyy muodostamaan suoloja; I! 7369 7 h) suolaa muodostava emäsfunktio; i) molekyylipaino noin 1877 määritetty FAB-massaspektro-metrillä.

Teikomysiini tekijä 4 on valkoinen, amorfinen jauhe, 5 joka kuumennettaessa alkaa tummua noin 210°C:ssa ja on täysin hajonnut 250°C:ssa, sillä on seuraavat tunnusmerkit: a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa >7,0 tai pH:ssa <2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja propyleeniglykoliin; 10 heikosti liukeneva motyylisellosolveen ja glyseroliin; huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-hek-saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; 15 b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, joka on esitetty liitteenä, kuvio 10, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: - 0,1N kloorivetyhapossa: ^ . 278 nm (T,}% = 52,5) maks icm 20 - fosfaattipuskurissa, pH 7,4: λ . 278 nm (E*% = 52,5) maks lcm ’ - 0,IN natriumhydroksidissä: λ , 797 nm = 75,5); 7 vmaks 1 cm ’ ’ c) infrapuna-absorptiospektri nujolissa, esitetty liit- 25 teenä, kuvio 11, seuraavat absorptiomaksimit: 3700- -3100, 2960-2840 (nujoli), 1645, 1590, 1510, 1460 (nu-joli), 1375 (nujoli), 1300 , 1230 , 1175 , 1140 , 1060 . 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujoli); d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kui- 30 vattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä 73697 (% Λ w = 9,8), antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset prosenttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,50 %, vetyä 5,10 %, typpeä 6,50 %, klooria 3,80 %, happea (saatu erotuksena) 28,10 %; 5 e) retentioaika (t0) 25,8 minuuttia saadaan analysoitaes-

K

sa käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen 5 μ Zorbax ^ ODS--pylvästä ja eluoimalla lineaarisella gradientilla, jossa on 0 %:sta 50 %:ttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM Nal^PO^/asetonitriili 10 (9/1) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH: 11a·, liuos B: 25 mM NaH^PO^/asetonitriili (3/7) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:11a); virtausnopeus 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni t^ 8,84 15 minuuttia); f) happofunktio kykenee muodostamaan suoloja; g) suolaa muodostava emäsfunktio; h) molekyylipaino noin 1891 määritetty FAB-massaspektro-metrillä.

20 Teikomysiini k^ tekijä 5 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka alkaa tummua kuumennettaessa 210°C:een ja on täysin hajonnut 250°C:ssa, sillä on seuraavat tunnusmerkit: a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa >7 tai pH:ssa <2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja 25 propyleeniglykoliin; heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja glyseroliin; huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-hek-saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, 30 etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, joka on esi tetty liitteenä, kuvio 12, jossa esiintyy seuraavat 11.

13 73697 absorptiomaksimit: - 0, IN kloorivetyhapossa: X 1% Λ . 278 nm (E^ = 49,6) maks 1cm * - fosfaattipuskurissa, pH 7,4: 5 X . 278 nm (E^% = 51,8) - 0,1N natriumhydroksidissa: X . 297 nm (E*% = 78,8)·, maks 1cm * * c) infrapuna-absorptiospektri nujolissa, esitetty liitteenä, kuvio 13, seuraavat havaittavat absorptiomak- 10 simit: 3700-3100, 2960-2840 (nujoli), 1645, 1590, 3510, 1460 (nujoli), 1375 (nujoli), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujoli); d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (% Δ w 15 = 10,1) antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset pro- senttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,50 %, vetyä 5,05 %, typpeä 6,63 %, klooria 3,85 %, happea (saatu erotuksena) 27,87 %; e) retentioaika (tD) 26,4 minuuttia saadaan analysoitaes- 20 sa käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen 5 μ Zorbax ^ ODS- -pylvästä ja suorittamalla eluointi lineaarisella gra-dientilla, jossa on 0 %:sta 50 %:ttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaH^PO^/ asetonitriili (9/1) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,1N 25 NaOH:lla, liuos B: 25 mM NaH^PO^/asetonitriili (3/7) puskuroituna pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:lla); virtausnopeus 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni t^ 8,84 minuuttia); 30 f) happofunktio kykenee muodostamaan suoloja; 14 73697 e) suolaa muodostava emäsfunktio; h) molekyylipaino noin 1891 määritetty FAB-massaspektro-metrillä.

Jokainen teikonysiini :n tekijä 1, 2, 3, 4 ja 5 sisäl-5 tävät happofunktion, joka kykenee muodostamaan suoloja.

Teikomysiini A2:n tekijöiden 1, 2, 3, 4 ja 5 alkaiimetalli-, maa-alkalimetalli- ja farmaseuttisesti hyväksyttävät ammoniumsuolat ovat myös tämän keksinnön erityisenä kohteena .

10 Edullisia alkaiimetalli- ja maa-alkalimetallisuoloja ovat natrium-, kalium-, litium-, kalsium- ja magnesiumsuolat. Ammoniumsuoloja ovat ammonium- ja primääriset, sekundääriset tai tertiääriset (CC^)alkyyli ammonium- ja hydrok-si-(C^-C^)alkyyliammoniumsuolat.

15 Alkali- ja maa-alkalimetallisuolat valmistetaan tavallisten menetelmien mukaan, joita yleisesti käytetään metalli-suolojen valmistuksessa. Esimerkiksi teikomysiini A^:n tekijä 1, 2, 3, 4 tai 5 liuotetaan vapaan hapon muodossa sopivaan liuottimeen kuten propyleeniglykoliin ja tähän, 20 näin saatuun liuokseen lisätään vähitellen noin stökiömet-rinen määrä sopivaa, valittua mineraaliemästä.

Muodostuva alkaiimetalli- tai maa-alkalimetallisuola otetaan sen jälkeen talteen saostamalla ei-liuottimella ja suodatetaan.

25 Vaihtoehtoisesti nämä suolat voidaan valmistaa suhteellisen vedettömässä muodossa lyofilisoimalla; tässä tapauksessa halutut suolat sisältävät vesipitoiset liuokset, jotka saadaan vapaan hapon muodostaessa suolan sopivasti valitun alkaiimetalli- tai maa-alkalimetallikarbonaatin 30 tai -hydroksidin kanssa sellaisessa määrässä kuin saadaan pH:ssa 7-8, suodatetaan liukenematon aine pois ja lyofilisoidaan.

li 15 73697

Orgaaniset ammoniumsuolat voidaan valmistaa joko lisäämällä sopivasti valittu amiini teikomysiini A2:n tekijöiden 1, 2, 3, 4 tai 5 vapaan hapon liuokseen sopivassa liuottimessa kuten propyleeniglykolissa ja sen jälkeen 5 haihduttamalla liuotin ja ylimääräinen amiinireagenssi pois, tai vaihtoehtoisesti saattamalla nämä kaksi reagens-sia reagoimaan mahdollisimman pienessä määrässä vettä, jonka jälkeen saadut suolat saostetaan lisäämällä ei--liuotinta.

10 Kuten edellä esitettiin, jokainen teikomysiini A2:n tekijä 1, 2, 3, 4 ja 5 sisältää myös emäsfunktion, joka kykenee muodostamaan suolan. Näiden farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat, jotka valmistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, saattamalla pelkät, yksittäiset te-15 kijät kosketukseen melko vahvan hapon, mieluimmin mine-raalihapon kanssa, ovat myös tämän keksinnön kohteena.

TEIKOMYSIINI A2:N TEKIJÄN 2 NATRIUMSUOLAN VALMISTUS

Teikomysiini A2:n tekijän 2 vesipitoisen liuoksen (150 mg, 15 ml) pH säädetään arvoon 8,0 lisäämällä tipoittain 0,1N 20 NaOH. Saatu liuos suodatetaan, muutetaan jäädytyskuivaus-systeemin kammioon ja jäädytetään. Kun jäädytys on tapahtunut täydellisesti, kammioon vedetään vakuumi 0,1 tornia ja jää sublimoidaan säätämällä kuumentuva levy 0°C:ecn. Menettelyä jatketaan kunnes tuote on melkein kuiva (kos-25 teutta noin 1%). Titraamalla näin saadun tekomysiin A2:n tekijän 2 natriumsuolaliuos 25 ml:ssa metyylisellosolve/ H20:ta (3/1) 0, IN HCl:llä, voidaan todeta, että läsnä on kaksi tiirattavissa olevaa funktiota, joilla tunnusmerkkeinä seuraavat pK-arvot: 7,03 ja 4,78.

30 Käyttäen edellä esitettyä menetelmää, mutta lähtemällä teikomysiini A2:n tekijöistä 1, 3, 4 ja 5 saadaan vastaavat natriumsuolat. Määrittämällä natriumin määrä loppu-suoloissa, voidaan todeta, että muodostuneet suolat ovat mononatriumsuoloj a.

16 73697

Teikomysiini A2*.n tekijöiden 1, 2, 3, 4 ja 5, jotka osoittautuivat olevan pääasiassa aktiivisia ^ram-positiivisia bakteereja vastaan, in vitro, antibakteerinen aktiviteetti määritettiin kliinisesti eristettyjä stafylokokkeja ja 5 streptokokkeja vastaan käyttäen kaksinkertaista laimennus-menetelmää mikrotiitterisysteemissä, Penassay-lientä (Difco) ja Todd-Hewitt-lientä (Difco) käytettiin stafylokokeille ja vastaavasti streptokokeille. Yön yli kasvatetut liemiviljelmät laimennettiin niin, että lopullinen 3 10 ymppäys oli noin 10 kolonnia muodostavaa yksikköä /ml.

Pienin estävä konsentraatio (MIC) otettiin alhaisemmasta konsentraatiosta, jossa ei havaittu kasvua 18-24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa. Saadut tulokset on esitetty taulukossa II: li ___________________17__________________________ 7 3 6 9 7

III I

lit co I

I I I OO 00 O r-l -tj- I

I I LO| *> *» *> »> »> LO I

•H IIIOOOOOCMlOlO |

μ I I :rö I I I I I IOOOO-.-H I

4_) I ITI CM CM LO lo μ ·>·»·>*>»> t

0) I I -rA\ »> » O O »>0 0 0 0 0 I

a) I I χι σ ο ο »> σ I

μ I I tul " o I

•μ ι ι μι σ I

>11! I

•H I I---1---------------------------------------1

4-)111 I

III I

<X) III <J> I

I I I OO 00 O I—I I

C | | rf | »>»»>»>»' lo I

Q) IIIOOOOOOMLOLO I

C I t :mi itiiiooo-^.4 I

•H I I T~1 CM CM 140 LO μ *»«·'·'»' I

μ I I *r4l »> " O O »>000 0 0 I

a; I I xi o o o ·> o I

CL) I I CU I » O I

μ I I μι ο i

XIII I

a? I I---1---------------------------------------1

43 T> I II lo I

•Η μ I οι I oo oo ο μ cm I

μ E I < I co I » *> ·> « ·> lo I

C M. | ' | | o O O O O CM I

a) M I H I mi I I I I I μ LH I

I o I >rl ο-ΓΜίουομομμοοα I

O '— i 4—i I -μι »> *> cm co »> ·> »> »> - »> I

μ I μ I Xi ooo - oaoooo i μ · I go I m I »o i

•h o I >n I μι o I

> · I £; I I I

μ t o i___I_______________________________________I

c · I X I I I

•h S I μ I I co to μ μ 3- I

I u. I CM! »> *» *> *> ·> LO I

lo ι μ ι ι μ μ o o a cm I

I I :rd I I I I I I o cm μ j- μ ι

M id II *t—( ao μ lo lo μ » » » » I

μ ·μ II ·ΗΙ ·» ·> CM O »>00000 I

I I XI O O O «· O I

O J I I <1)1 *> o l X ι ι μι o i x ·> ι ι ι i 33 μ 1 1---1---------------------------------------1

J I I I I

33 ·> III I

<CM I I μ I LO CD μ CM I

C H 1 | | ··>·>·*»> Li) I

*> I I :n3l μ μ o o o CM ι μ ι ι -oi ι ι ι ι ι o cm μ j* μ ι I I >r4l oocMLoμcM »>»>·>»>*> l

C IIXl «'·>0'·'·'00000 I

ai ι ι a)i o o - o o ι x) ι ι μ ι o ι h --------n---------------------------------------1 :θ C I l

-I—> I CU I I

•H μ >o :rö I I

x m c o μ ι ι Q) μ a) μ :r3 ι ιο^ί-μοομμμμμ ι μ co ·μ c ι ι qj 3 cd E ι ι G μ μ x ι ι .. ---------1------en------------------------------1

CM I ·γ4 I

< ι rO a) ω a) ι ι -rl nj 3 :d ι •μ ι π ω ·η en -η -μ ι e ι co μ α> e ·μ μ co -μι •μ ι 3 Φ C Ο μ Ifl-μ Οι •μ id)"Cia)E<dco>ococd ι to ι μ ·μ οο G ο ·μ ·μ Μ ·μ μ ι >, ΐ3θ)θα)α)μμμ><τ( ι Ε ·μ ι ίηα)>,£Τπ3-μπ3ιτ!θ to ι

O E I IXCXH-lgtOtO-GiqJ I

X CO I CO CO I

• μ ·μ ι 33>cotococococococo ι

0) G I I

Η τ3 ι υοαοοοοουο ι ω ι οουουοοοοο ι μ ι ουοοοοοοοο ι ο ι OOOUOOOOOO ι ι ι μμοοοοοοοο ι ο ι >^>,μμμμμμμμ ι μ I X-CCXCLeXi^CLCLCLO. ι χ ι cxcuaiiDcyiDaioaia) ι •μ ι τ)<υμμμμμμμμ ι Τ. ι μμμμμμμμμμ ι ι οο οο en co οο co on oo oo oo ι

I I

18 73697

Yksittäisten tekijöiden 1, 2, 3, 4 ja 5 mikrobiologinen potenssisuhde määritettiin agar-diffuusio-menetelmällä käyttäen S.Aureus'ta ATCC 6538 itiötestinä ja te>ikomysii-ni A2-kompleksia standardina.

5 Erityisesti vastaava määrä teikomysiini A,,: n tekijää 1, teikomysiini A^ tekijää 2, teikomysiini A^ tekijää 3, teikomysiini A^ tekijää 4, teikomysiini A? tekijää 5 ja teikomysiini A0-kompleksia, jota käytettiin standar- c.

dina , liuotetaan dimetyy li f ormamidiin konse.ntraat ion 10 ollessa 2000 μg/ml. Nämä liuokset laimennetaan edelleen käyttäen 0,067 M fosfaattipuskuria pH 7,4, johon on lisätty 1 % naudan seerumia, jolloin saadaan seuraavat konsentraatiot: 2,5 ; 5 ; 10 ja 20 pg/ml.

Suocatinpaperikiekot kastetaan sen jälkeen näy to liuoksiin 15 ja asetetaan säännöllisin välein agarlevyjen pinnalle, jotka levyt on ympätty testattavalla mikro-organismisus-pensiolla. Levyjä inkuboidaan 37°C:ssa 18 tuntia, jonka jälkeen inhibiitiovyöhykkeiden halkaisijat mitataan. Saadut tulokset syötetään tietokoneeseen yksittäisten tekijöi-20 den potenssin laskemiseksi verrattuna kompleksiin.

Tulokset on esitetty seuraavassa.

Teikomysiini A? tekijä 1 841 u/mg

Teikomysiini A.., tekijä 2 1 0 86 U/mg

Teikomysiini A^ tekijä 3 1131 U/mg.

25 Teikomysiini A^ tekijä 4 1065 U/mg

Teikomysiini tekijä 5 954 U/mg

Teikomysiini A..-kompleksi 1000 U/kg c

II

19 7 369 7

Tekonysiini A^tn tekijät 2, 3, 4 ja 5 testattiin myös kokeellisissa infektioissa, jotka aiheutettiin S.pneumoniae' 11a ja S.pyogenes111a hiirissä. Kokeet suoritettiin vertaamalla teikomysiini A^-kompleksiin. Saadut tulokset on S esitetty taulukossa III.

TAULUKKO III

Antibakteerinen aktiviteetti in vivo ----------------------------------------------------------- 1 1 i | Yhdiste [ LD&Q (mg/kg/pä ivä ) , c . ' i i S.nneumoniae L 44 t L.oyopones L 49 !

! i > J

i Teikomysiini A„ ι i 1 J tekijä 2 J 0,28 (0,22-0,34) j ^,15 (o 13-C ]9) 1 i Teikomysiini A^ ! i · ! tekijä 3 I 0 ,27 (0,23-0 ,32 ) J 0,J3 (0,11-0,16) j

ι ι J

I Teikomysiini A? J ι t J tekijä 4 » 0,12(0,98-0,14) J 0 ,q98_( 0 07 3_0 11} ! li ι ; ! Teikomysiini A» ! ι ι | tekijä 5 J 0,13 (0,10-0,15) | 0 ,} q (0,098-0,13) · ι ι > ’ ’ | J Teikomysiini A„ | ι [kompleksi [ 0,35 (0,28-0,44) [ 0,χ3 (_) ! II I [ >----------------i--------------------L____________________!_ 20 7 2 6 9 7

Likimääräinen akuutti myrkyllisyys hiirissä (i.n.) teikomysiini :n tekijöille 1,2, 3, M ja 5 on esitetty taulukossa IV:

TAULUKKO IV

5 Akuutti myrkyllisyys hiirillä (i.p.) * — “ — — — — —— — — — -- - ------------— — — , — — — — —1

Yhdiste Likimääräinen LDr (mp/ke) 5 0

Teikomysi.ini A0 tekijä 1 %1500 2000

Teikomysiini tekijä 2 | N1500 T 2000

Teikomysiini i\ tekijä 3 J N1000 <j 1500 10 Teikomysiini A tekijä 4 j > 50 0 -0 100 0

Teikomysiini A tekijä 5 j j> 500 < 1000 _____________________________L_.__________________________

Edellä esitetyn perusteella tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä teikomysiini A? tekijää 1, teikomysiini h tekijää 2, teikomysiini A? tekijää 3, teikomysiini A? tekijää 4 ja 15 teikomysiini A^ tekijää 5 voidaan tehokkaasti käyttää aktiivisena aineosana antimikrobisissä valmisteissa, joita käytetään hoidettaessa näille aktiivisille aineosille herkkien patogeenisten bakteereiden aiheuttamia infektioita. Tällaisessa hoidossa näitä yhdisteitä voidaan käyttää joko 20 sellaisenaan tai yksittäisinä, yksilöllisinä tekijöinä, tai huomioon ottaen niiden aktiivisen osan samankaltaisuus, myös seosten muodossa, jossa on kaksi fai useampi näistä viidestä tekijästä missä suhteessa tahansa.

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan annostaa oraa-25 lisesti, topikaalisesti tai parenteraalisesti, jolloin kuitenkin parenteraalinen annostus on edullisin. Riippuen annostustavasta nämä yhdisteet voidaan valmistaa erilaisissa annosmuodoissa. Oraaliseen annostukseen tarkoitetut valmisteet voivat olla kapseleina, tabletteina, nestemäi-30 sinä liuoksina tai suspens Lo:na. Kuten on tunnettua kapselit ja tablet:.! voivat s isät! tää. aktiivisen aineosan lisäksi

II

73697 21 tavanomaisia täyteaineita, kuten laimennusaineita, esim. laktoosia, kalsiumfosfaattia, sorbitolia -ja vastaavia, voiteluaineita, esim. magnesiumstearaattia, talkkia, po-lyetyleeniglykolia, sideaineita, esim. polyvinyylipyrro-5 lidonia, liivatetta, sorbitolia, traganttia, akaasiaa, makuaineita ja hyväksyttäviä hajottavia ja kosteuttavia aineita. Nestemäiset valmisteet, jotka yleensä ovat. vesipitoisten tai öljy mä iston 1 x u o s t e n 1 a i suspensioin! e n muodossa, voivat sisältää tavallisia lisän I noita, kuten 10 susper.doi via aineita. Tämän keksinnön mukaiset tonikaa-liseen käyttöön tarkoitetut yhdisteet voidaan valmistaa myös sopivissa muodoissa, jolloin absorptio tapahtuu ihon, nenän ja kurkun limakalvon tai keuhkokudoksen läpi ja valmisteet ovat tavallisesti nestemäisiä suihkeita 15 tai inhaloitavia aineita, tabletteja tai kurkkunastoja.

Silmien tai korvien hoitoon valmisteet voivat oi la nestemäisessä tai puoli-nestemäisessä muodossa. Topikaa I. iset. valmisteet voidaan valmistaa hydrofoobiseen tai hydrofii-liseen perustilassaan, niiden ollessa voiteita, salvoja, 20 lotioneita, pastoja tai jauheita.

Injektoitavat koostumukset voivat olla suspensioina, liuoksina tai emulsioina cljymäisessä tai vesipitoisessa kantaja-aineessa ja ne voivat sisältää, formuloivia aineita, kuten suspendoivia, stabiloivia ja/tai dispergoi-25 via aineita.

Vaihtoehtoisesti aktiivinen aineosa voi olla jauheen muodossa, josta se annettaessa valmistetaan yhdistämällä sopivaan kantaja-aineeseen, kuten steriiliin veteen.

Annostettavan aktiivisen aineosan määrä riippuu monista 30 tekijöistä, kuten hoidettavan koosta ja olotilasta, an nostustavasta ja -tiheydestä ja aiheuttaneesta tekijästä.

Teikomysiini tekijät 1, 2, 3, M ja 5 ovat yleensä tehokkaita päivittäisen annoksen ollessa noin 0,1 - noin 20 mg aktiivista aineosaa oer kehon kg, mahdollisesti ? 2 73697 jaettuna 2 annokseen päivässä.

Erityisen edullisia koostumuksia ovat sellaiset, jotka valmistetaan yksikkeannosmuotoon ja sisältävät aktiivi-ainetta noin 50 - 250 mg per yksikkö.

5 Farmaseuttisten koostumusten valmistuksesta on seuraavas-sa esitetty eräitä edustavia esimerkkejä:

Parenteraalinen liuos injektiota varten valmistetaan siten, että 100 mg teikomysiini :n tekijän 2 natriumsuolaa 10 liuotetaan 2 mitään steriiliä vettä.

Parenteraalinen liuos injektiota varten valmistetaan siten, että 250 mg teikomysiini A^:n tekijän 3 natriumsuolaa liuotetaan 3 mitään steriiliä vettä.

15 Topikaalinen voide valmistetaan siten, että siihen käytetään t 250 mg teikomysiini A^:n tekijää 2 600 mg polyetyleeniglykolia 4000 U.P.E.

1,2 g polyetyleeniglykolia 400 U.P.S.

20 Paitsi, että tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat aktiivisia lääkeaineina, niitä voidaan käyttää eläinten kasvua edistävinä aineina.

Tätä tarkoitusta varten annostetaan yhtä tai useampaa tämän keksinnön mukaista yhdistettä oraalisesti sopivassa 25 ravintoaineessa. Tarkka käyttökonsentraatio on sellainen, joka on tarpeen kasvun edistämiseksi tehokkaasti käytettäessä normaaleja määriä ravintoa.

Tämän keksinnön mukaisten aktiivisten yhdisteiden lisääminen eläinten ravintoon suoritetaan mieluimmin valmista-30 maila sopiva ennalta sekoitettu ravinto, joka sisältää aktiiviset yhdisteet tehokkaassa määrässä, ja yhdistämällä 11 73697 7 3 tämä ennalta sekoitettu ravinto valmiiseen päivän ravintoannokseen .

Vaihtoehtoisesti välituote väkevöitynä tai ravintoväli-aine, joka sisältää aktiiviset aineet, voidaan sekoittaa δ ravintoon.

Tapa, jolla tällaiset ravintosekoituksct ja valmiit päivän ravintoannokset voidaan valmistaa ja annostaa on esitetty viitekirjoissa (kuten "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman ja Co., S.Francisco, USA, 1969 tai "Livestock 10 Feeds and Feeding", 0. ja B. Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) ja liittyvät tähän selitykseen kirjallisuusviitteenä .

Claims

73697

1. Menetelmä puhtaan, yksilöllisen antibiootin, joka on teikomysiini A? tekijä 1, teikomysiini A? tekijä 2, tei-komysiini tekijä 3, teikomysiini tekijä 4 tai tei- 5 komysiini A^ tekijä 5, jotka on identifioitu vastaavasti seuraavilla fysiko-kemiallisilla tunnusmerkeillä: teikomysiini A^ tekijä 1 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka kuumennettaessa alkaa tummua noin 220°C:ssa ja on täysin hajonnut 255°C:ssa 10 a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa >7,0 tai pH:ssa <2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja propyleeniglykoliin; heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja glyseroliin:, huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; 15 melkein liukenamaton kloroformiin, bentseeniin, n-hek- saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: 20 - 0,1N kloorivetyhapossa λ . 278 nm (E^ = 49,5) maks lcm ’ - fosfaattipuskurissa pH 7,4 >Ws 278 nra (Elcm ’ 50-0) - 0,1N natriumhydroksidissa 25 ^maks 297 nm (E“m = 72>1) c) infrapunaspektri nujOlissa, esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: 3700-3100, 2960-2840 (nujoli), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujoli), 1375 (nujo3i), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nu- 30. oli); II 7 3 6 9 7 d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kuivattu 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (%Δ.νι = 8,5), antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset pro-senttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,70 %, ve- 5 tyä 4,90 %, typpeä 6,65 %, klooria 3,80 %, happea (saatu erotuksena) 27,95 %; e) retentioaika (t^) 21,2 minuuttia saadaan, kun yhdiste analysoidaan kääteisfaasi HPLCrllä käyttäen (R)

5. Zorbax ^ ODS-pylvästä ja eluointi suoritetaan 10 lineaarisella gradientilla, joka sisältää 0 pro sentista 50 prosenttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaH P0U/asetonitrii-li (9/1) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,1N NaOHtlla; liuos B: 25 mM Naf^PO^/asetonitrii li (3/7) pusku-15 roitu pH-arvoon 6,0 0,IN NaOH:lla); virtausnopeus on 2 ml/minuutti (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni, t^ 8,84 minuuttia); f) seuraavat signaaliryhmät rekisteröitiin 270 MHz:n ^H-NMR-spektrissä, DMSO-dgissa, johon lisätty muu- 20 tama tippa D^Orta (kons. 25 mg/0,5 ml) (TMS sisäi senä standardina S - 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m); 1,7--2,3 (m); 2,7-4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m); g) happofunktio pystyy muodostamaan suoloja; 25 h) suolaa muodostava emäsfunktio; i) molekyylipaino noin 1875, joka määritetty FAB-massa-spektrometrillä; teikomysiini A^ tekijä 2 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka alkaa tummua kuumennettaessa 210°C:een ja on täysin 30 hajonnut 250°C:ssa a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa >7,0 tai pH:ssa <2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoks icliin ja 73697 propyleeniglykoliin; heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja plyseroliin; huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliini melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-hek-5 saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: - 0,1N kloorivetyhapossa 10 λ 278 nm (E?-% = 48) maks lcm - fosfaattipuskurissa pH 7,4 ) , 278 nm (E,% = 49,0) ' 1 maks lcm - 0,1N natriumhydroksidissa /\ . 297 nm (E*% = 70,0) κ maks lcm * 15 c) infrapunaspektri nujolissa esiintyy seuraavat havaittavat absorptiomaksimit: 3700-3100, 2960-2860 (nujoli) , 1645 , 1590 , 1510 , 1460 (nujoli), 1375 (nujoli), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujoli); 20 d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun yhdiste on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (% A w = 9,8), antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset prosenttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,15 %, vetyä 5,15 %, typpeä 6,30 %, klooria 3,90 %, 25 happea (saatu erotuksena) 28,50 % ·, e) retentioaika (tD) 22,6 minuuttia saadaan, kun analy- ^ · (r) soidaan käänteisfaasi HPLC:llä käyttäen 5 μ Zorbax Viy ODS-pylvästä ja eluointi tapahtuu lineaarisella gra-dientilla, joka sisältää 0 prosentista 50 prosent-30 tiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM Na^PO^/asetonitriili (9/1) puskuroitu pH--arvoon 6,0 0,IN NaOK:lla; liuos B: 25 mM NaH^PO^/ il 73697 asetonitriili (3/7) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:11a); virtausnopeus on 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroks 1 - tolueeni., ty 5 8,84 minuuttia); f) seuraavat signaaliryhmät rekisteröitiin 270 MHz:n ^H-NMR-spektrissä DMCO-dg:ssa, johon on lisätty muutama tippa D^O^a (kons. 25 mg/0,5 ml) (TMS sisäisenä standardina 6 = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m), 1,8-2,2 10 (m), 2,7-4,5 (m), 4,6-5,7 (m), 6,2-8,1 (m); g) happofunktio pystyy muodostamaan suoloja; h) suolaa muodostava emäsfunktio; i) molekyylipaino noin 1877 määritetty FAB-massaspektro-metrillä; 15 teikomysiini tekijä 3 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka kuumennettaessa alkaa hajota 205°C:ssa ja on täysin hajonnut 250°C:ssa a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa.m> 7,0 ja pll:ssa •<2, dimetyyliformamidiin , dimetyylisul foksi diin ja 20 propyleeniglykoliin; heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja glyseroliin; huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-hek-saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, 25 etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: - 0,IN kloorivetyhapossa X . 278 nm (L^ = 49,2) maks lcm ’ 30. fosfaattipuskurissa pH 7,4 Λ , 278 nm (E^% = 50,8) make lcm 28 73697 - O,IN natriumhydroksidissa λ 297 nm (Ε,% = 72,7) maks 1cm * c) infrapunaspektri nujolissa esiintyy seuraavat havaittavat absorptiomaksimit: 3700-3100 , 2960-2850 (nujo- 5 li)» 1645, 1590, 1510, 1460 (nujoli), 1375 (nujoli), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujoli); d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä UÄw = 10 12,0) antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset pro- senttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,26 %, vetyä 5,20 %, typpeä 6,69 %, klooria 3,95 %, happea (saatu erotuksena) 27,90 %; e) retentioaika (t0) 23,3 minuuttia, saadaan analysoi- K (S) 15 taessa kääteisfaasi HPLCrllä käyttäen 5 μ Zorbax ^ OSD-pylvästä ja suorittamalla eluointi lineaarisella gradient!11a, jossa on 0 prosentista 50 prosenttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaF^PO^/asetonitriili (9/1) puskuroitu pH:ar-20 voon 6,0 0,1N NaOH:lla, liuos B: 25 mM NaH^PC^/ase- tonitriili (3/7) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:11a); virtausnopeus on 2 ml/ minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni tp 25 8,84 minuuttia); f) seuraavat signaaliryhmät rekisteröitiin 270 MH/.:n 1H-NMR-snektrissä DMS0-de:ssa, johon on lisättu muu- b tama tippa D^Oita (kons. 25 ng/0,5 ml) (TMS sisäisenä standardina S = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m), 1,8-30 -2,0 (m), 2,7-4,5 (m), 4,6-5,7 (m), 6,2-8,0 (m); g) happofunktio pystyy muodostamaan suoloja; h) suolaa muodostava emäs funktio; tl 2q 7 3697 i) molckyylipaino noin 1877 määritetty FAB-massaspektro-metr.Lllä; teikonysiini tekijä 4 on valkoinen, amorfinen jauhe, joka kuumennettaessa alkaa tummua noin 210 C:ssa ja on täysin 5 hajonnut ?50°C:ssa a) se on hyvin liukeneva veteen p!!:ssa 7,0 tai pH:ssa <2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja propyleeniglyköliin; heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja plysoroliIn; 10 huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; melkein liukenematon kloroformiin, bent seeniin , r.-hek-saaniin, asetonitriiliin, etyyli eetteriin, asetoniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridi in; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, jossa csiin- 15 tyy seuraavat absorptiomaksimit: - 0,1N kloorivetyhapossa λ , 278 nm (E*% = 52,5) maks lcm ’ - fosfaattipuskurissa pH 7,4 A . 278 nm (E^ = 52,5) ' v naks lcm ’ 20 - 0,IN natriumhydroksidissa A . 297 nm = 75,5) Am.aks lcm c) infrapuna-absorptiospektri nujolissa esiintyy seuraa vat absorptiomaksimit: 3700-3100, 2960-2840 (nujoli), 1645, 1590 , 1510 , 1460 (nujoli), 1375 (nujoli) , 1 300 , 25 1230, 1175 , 1140 , 1060 , 1025 , 970 , 890 , 84Q, B15 , 720 (nujoli); d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (k Δ w = 9,8), antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset nro-30 senttikoostumukset (keskiarvo): hiiltä 56,50 °c, vetyä 5,10 %, typpeä 6,50 %, klooria 3,80 λ, happea (saatu 73697 erotuksena) 28,10 %; e) retentioaika (tD) 25,8 minuuttia saadaan analysoi- K ® taessa käänteisfaasi HPLC:llä käyttäen 5 μ Zorbax ODS-pylvästä ja eluoimalla lineaarisella gradientil-5 la, jossa on 0 prosentista 50 prosenttiin liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 25 mM NaH^PO^/ asetonitriili (9/1) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:lla; liuos B: 25 mM NaH^PO^/asetonitriili (3/7) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,IN NaOH:lla); 10 virtausnopeus 2 ml/minuuttia; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni 8,84 minuuttia); f) happofunktio kykenee muodostamaan suoloja; g) suolaa muodostava emäsfunktio; 15 h) molekyylipaino noin 1891 määritetty FAB-massaspektro-metrillä; teikomysiini tekijä 5 on valkoinen amorfinen jauhe, joka alkaa tummua kuumennettaessa 21Q°C:een ja on täysin hajonnut 250°C:ssa 20 a) se on hyvin liukeneva veteen pH:ssa j> 7 tai ph:ssa ^2, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja propyleeniglykoliin; heikosti liukeneva metyylisellosolveen ja glyseroliin; huonosti liukeneva metanoliin ja etanoliin; 25 melkein liukenematon kloroformiin, bentseeniin, n-hek- saaniin, asetonitriiliin, etyylieetteriin, asetoniin, etyyliasetaattiin, hiilitetrakloridiin; b) sillä on ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat äbsorptiomaksimit: 30 - 0,1N kloorivetyhapossa X . 278 nm (E^% = 49,6) maks Icm ’ II: 73697 -fosfaattipuskurissa pH 7,4 λ , 278 nm (E** = 51,8) maks lem - 0,IN natriumhydroksidissa XmakS 297 ™ (Elcm = 78·8)·> 5 c) infrapuna-absorptiospektri nujolissa esiintyy seu-raavat havaittavat absorptiomaksimit: 3700-3100, 2960-2840 (nujoli), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujoli), 1375 (nujoli), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujoli); 10 d) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näyte on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inertissä atmosfäärissä (% Δ w = 10,1) antaa tulokseksi seuraavat likimääräiset pro-senttikoostunukset (keskiarvo): hiiltä 56,60 %, vetyä 5,05 %, typpeä 6,63 %, klooria 3,85.%, happea 15 (saatu erotuksena) 27,87 %; e) retentioaika (tD) 26,4 minuuttia saadaan analysoi-taessa käänteisfaasi KPLC:llä käyttäen 5 μ Zorbax ^ ODS-pylvästä ja suorittamalla eluointi lineaarisella gradientilla, jossa on 0 prosentista 50 prosenttiin 20 liuosta B liuoksessa A, 40 minuutissa (liuos A: 2. mM NaK^POt(/asetonitriili (9/1) puskuroitu pK-ar-voon 6,0 0,1N NaOH:lla, liuos B: 25 mM NaH^PO^/356' tonitriili (3/7) puskuroitu pH-arvoon 6,0 0,1N NaOH:11a); 25 virtausnopeus 2 ml/minuutti; (sisäinen standardi: 3,5-dihydroksi-tolueeni tR 8,84 minuuttia) ·, f) happpofunktio kykenee muodostamaan suoloja; suolaa muodostava emäsfunktio; 30 h) molekyylipaino noin 1891 määritetty FAB-massaspektro-metrillä; sekä ser farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen 73697 valmistamiseksi, t u n n e t t u siitä, että erotetaan teikomysiini yksittäisiin tekijöihin käänteisfaasi-erotuksella tai ioninvaihtokromatografialla ja mahdollisesti saadut yhdisteet muutetaan vastaaviksi, farmaseut-5 tisesti hyväksyttäviksi suoloiksi sinänsä tunnetuilla menetelmi 11ä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä puhtaan, yksilöllisen antibiootin, joka on teikomysiini A2 tekijä 1, teikomysiini tekijä 2 tai teikomys siini 10 A2 tekijä 3, jotka on identifioitu patenttivaatimuksessa 1 esitetyillä tunnusmerkeillä, tai sen ai kai imetä!1i-, maa-alkai imetä!1i- ja farmaseuttisesti hyväksyttävän am-moniumsuolan valmistamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 15 puhtaan, yksilöllisen antibiootin, joka on teikomysiini A2 tekijä 1 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, valmi stami seksi. il. 73697