LU84853A1 - Facteurs 1,2,3,4 et 5 individuels purs de la teichomycine a2 et leur procede de preparation - Google Patents

Description

Facteurs 1«2,3*4 et 5 individuels purs de la Teicho-mycine A£ et leur procédé de préparation.

La présente invention concerne une substance antibiotique individuelle choisie parmi le groupe 5 comprenant le facteur 1 de la Teichomycine A0 , le facteur 2 de la Teichomycine A0 , le facteur 3 de la Teichomycine A0, le facteur 4 de la Teichomycine A0 et le facteur 5 de la Teichomycine A0 sous forme • ·»* '* pratiquement pure, ainsi que le procédé de prépara- 10 tion de' cette substance.

La Teichomycine A9 est une des différentes substances antibiotiques obtenues en cultivant la souche Actinoplanes Teichomyceticus nov, sp. ATCC 31121 dans un milieu de culture contenant des sources 15 assimilables de carbone, d'azote et de sels inorganiques (voir brevet belge n° 839.-59). Suivant le procédé décrit dans ce brevet, on récupère un mélange antibiotique contenant les Teichomycines A^, A0 et A^ du bouillon de fermentation séparé^par extraction 20 avec un solvant organique approprié non miscible à l'eau et par précipitation hors du solvarr. d'extraction conformément aux procédés habituels. On sépare » ensuite la Teichomycine A^ du mélange antibiotique ainsi obtenu moyennant une chromatographie en colonne 25 sur du "Sephadex" (marque commerciale déposée).

Après avoir été purifiée davantage par passage à travers une résine de polystyrène sulfoné, la Teichomycine A2 est ensuite caractérisée par une large série de différents paramètres chimico-physiques, 30 notamment les valeurs dans une série de systèmes de chromatographie sur papier et sur couche mince dans lesquels ce composé se comporte comme un vrai produit unitaire.

A présent, de façon inattendue, on a trouvé 35 que la Teichomycine A2 comprenait réellement un mé- i ο Α< lange de différentes matières antibiotiques étroitement apparentées et produites simultanément dont les facteurs principaux ont été appelés facteur 1 de la Teichomycine A2, fact eur 2 de la Teichoir.ycine A0, 5 facteur 3 de la Teichomycine An, facteur 4 de la

Teichomycine A0 et facteur 5 de la Teichomycine A0.

On a également trouvé que ces facteurs individuels purs pouvaient être distingués biologiquement- du *18.

complexe de Teichomycine A2 du fait qu'ils exercent 10 une acti\rité antibiotique à un degré supérieur contre des micro-organismes susceptibles.

On prépare les substances antibiotiques de la présente invention à partir de la Teichomycine A2 qui est décrite dans le brevet belge précité, en 15 séparant le complexe antibiotique en facteurs individuels moyennant des procédés de chromatographie de haute efficacité et en récupérant les facteurs principaux.

Les expressions "Teichomycine A0", "complexe 20 de Teichomycine A0,! ou "complexe antibiotique", utilisées dans la présente spécification, désignent le mélange contenant les cinq facteurs antibiotiques . * ci-dessus qui sont produits simultanément et qui peuvent être obtenus, par exemple, conformément aux v " 25 enseignements du brevet belge &39«259 qui est men tionné ici à titre de référence, ces facteurs y étant désignés par l'appellation "Teichomycine A0 ",

La séparation du complexe en facteurs individuels purs principaux peut être effectuée par 30 chromatographie de partage à phases inversées ou par chromatographie d'échange d'ions. Dans le premier cas, on utilise avantageusement du gel de silice rendu inactif comme garnissage de la colonne et une élufion à gradient d'acétonitrile/formiate d'ammo-35 nium aqueux comme révélateur tandis que, dans le 3 second cas, on emploie avantageusement un échangeur d1anions du type en gel faible comme phase fixe, ainsi que des tampons aqueux ou des mélanges de tampons aqueux et de solvants non aqueux comme sys-5 tèmes d'élution. En particulier, on a obtenu des résultats optima de séparation en faisant passer une solution de Teichomycine dissoute dans un mélange de formiate d'ammonium aqueux dilué et d'acétonitrile à travers une colonne de gel de silice traité au 10 silane et en développant la colonne avec un gradient ; d'élution dans le même système solvant. On obtient également de bons résultats en utilisant le dérivé diéthylaminoéthyle d'agarose comme phase fixe et en effectuant la séparation par élution progressive 15 avec des solutions tampons ou des mélanges de solutions tampons et de solvants non aqueux miscibles à 11 eau.

Le procédé de séparation est contrôlé par chromatographie liquide à haut rendement. On combine 20 les fractions ayant un profil semblable à la chromatographie liquide à haut rendement, on les purifie éventuellement davantage par chromatographie liquide à haut rendement et on en élimine les sels. De ces solutions, on r-écupère ensuite les facteurs indivi— 25 duels en évaporant les solvants organiques, en extrayant l’eau à un faible volume et en ajoutant un excès d'un solvant organique dans lequel les composés ne sont pas solubles, pour précipiter les produits obtenus.

30 L'exemple spécifique ci-après est donné afin de mieux illustrer le procédé de la présente invention. Il est toutefois entendu que cet exemple ne limite nullement l'invention aux conditions particulières qui y sont décrites.

/ ! 4 Séparation des facteurs 1» 2, 3? 4 et 5 de la Teicho-mycine A^ Ôn dissout 10 g du complexe de Teichomycine A0 obtenu par le procédé décrit dans le brevet belge 5 £39.259* dans un litre d'un mélange Ç:1 de formiate d1 ammonium à 0,2% et d1acétonitrile et on règle la solution obtenue à un pH de 7*5 avec du NaOH IN. On fait passer cette solution à travers une colonne contenant 500 g de gel de silice 60 traité au silane 10 (1,Merckn ) ,

Ensuite, on élue la colonne avec un gradient linéaire de ÎO à 20% d’acétonitrile dans une solution de formiate d’ammonium à 0,2£ à un volume total de ÎO litres.

15 On recueille les fractions d’environ 20 ml et on les contrôle par chromatographie liquide à haut rendement.

Le tableau I ci-après indique les temps de rétention (t ) pouf les facteurs l, 2, 3, 4 et 5 de 20 la Teichomycine A^ dans une séparation représentative par chromatographie liquide à haut rendement (les conditions opératoires sont indiquées dans le tableau ci-dessous) :

TABLEAU I

, ' 25 Facteur de la Teichomycine A9 Temps de rétention (minutes) 1 21,2 2 22,6 3 23,3 30 4 25,8 5 26,4 3,5-dihydroxytoluène 8,84 (étalon interne)

Colonne : 5 jx "Zorbax ODS" (marque commerciale dépo-35 sée de "Du Pont").

/ / 5

Phase mobile : gradient linéaire de 0 à 50/i de B dans A pendant 40 minutes : A) NaH^PO^ 25 mM/acétonitrile (9:1) tamponné à un pH de 6 avec du 5 Na OH 0,1N.

B) NaHoP0^ 25 mM/acétonitrile (3-7) tamponné à un pH de 6 avec du

Na OH 0, IN.

Débit : 2 ml/minute.

-, 10 Détecteur : Photomètre à l'ultraviolet à 254 nm.

On combine les fractions présentant un profil semblable à la chromatographie liquide à haut rendement et· l’on évapore le solvant organique sous pression réduite. On fait passer les solutions 15 aqueuses restantes à travers une colonne contenant 10 g de gel de silice (60) traité au silane ("Merck")· On lave 3a colonne avec de l'eau distillée afin d'éliminer le formiate d'ammonium, puis on l'élue avec de 1 *acétonitrile aqueux à 50%, 20 On concentre 1·éluat à un faible volume en ajoutant du butanol pour faciliter l'évaporation de l'eau, puis on précipite avec un mélange 1:1 d'acétone et d'éther éthylique. Par le procédé ci-dessus, on obtient le facteur 1 de la Teichomycine A0 25 (4IO mg) et le facteur 2 de la Teichomycine An (770 mg) à l'état pur.

On purifie davantage le facteur 3 de la Teichomycine A2 sous forme d'un mélange 1:1 avec le facteur 2 de la Teichomycine A2 moyennant une chro-30 matographie liquide à haut rendement dans une colonne de semi-préparation dans les conditions opératoires suivantes :

Colonne : "Whatman Partisil ODS M 9 10/50" (marque w 6

Phase.mobile : formiate d’ammonium à 0,2£l dans H^O/acétonitrile (76:24).

Débit : 4,5 ml/minute.

Détecteur : Photomètre à l’ultraviolet à 254 nir., 5 Charge : 20 mg.

Dans ce cas également, on contrôle la purification en vérifiant chaque fraction par chromatographie liquide à haut rendement.

On combine les fractions contenant le fac-„, 10 teur 2 de la Teichomycine à l’état pur, ainsi que des fractions contenant le facteur 3 de la Teicho-mycine A„ à l’état pur, on en élimine les sels, puis on précipite comme décrit précédemment (rendement : 510 mg du facteur 2 de la Teichomvcine A0 et 15 520 mg du facteur 3 de la Teichomvcine A2).

On combine les fractions contenant les facteurs 4 et 5 dans le rapport de 1:1 (environ 500 mg) que l’on obtient dans la première colonne, avec une autre collecte de fractions contenant un mélange des 20 facteurs 4 et 5 (environ 490 mg) obtenu de la même manière par une deuxième séparation parallèle, puis on les sépare par chromatographie liquide à haut rendement de semi-préparation en adoptant les mêmes conditions opératoires que celles indiquées ci-dessus - =’ 25 pour la purification du facteur 3 de la Teichomycine A2 > on obtient 350 mg du facteur 4 de la Teichomycine A2 et 300 mg du facteur 5 de la Teichomycine A2· Caractéristiques chimico-physiques des facteurs in-dividuels purs de la Teichomycine A^ 30 Le facteur 1 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, lors du chauffage, commence à prendre une couleur foncée à environ 220°C et qui est complètement décomposée à 255°Cj ce facteur ayant les caractéristiques suivantes : / 7 a) Il est librement soluble dans l’eau à un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le dimé*: hylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propj'-lène-glvcol 3 5 légèrement soluble dans le mét-hyl—cellosolve et le glycérol 3 faiblement soluble dans le méthanol et l’éthanol, presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, le n-hexane, l’acétonitrile, l’éther éthylique, 10 l'acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone.

b) Il a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets (qui est indiqué dans la figure 1 des dessins annexés) présentant les maxima d’absorption 15 suivants : - dans l’acide chlorhydrique 0,1K : *max 2?S “ = «»S) - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7*4 : λ 278 nm (e}a' = 50,0) max 1cm 9 ' 20 - dans 1*hydroxyde de sodium 0,1K : λ«* ™ 72-l).

c) Un spectre d’absorption des rayons infrarouges dans du nujol (représenté en figure 2 des dessins annexés) avec les maxima d’absorption sui- :: 25 vants : 3700-3100, 296O-2S40 (nujol), 1045* 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, ll80, 1155* 1060, 1025, 970, 890, 845* 815* 720 (nujol) 3 d) après avoir préalablement séché l’échantillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte 30 (% Δ P = 8*5)* une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (moyens) ci—après de la composition : carbone 56,70/; 3 hydrogène : 4*90a * azote : 6,65a * chlore : 3*80a 3 oxygène (par différence) : 27,95%.

/ . t

I

8 e) Un temps de rétention (tD) de 21,2 mi-nutes à l’analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colonne de "Zorbax ODS" 5ya (marque commerciale 5 déposée) et en éluant avec un gradient linéaire de 0/1 à 50% de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : Na^PO^ 25 m>'/acétonitrile (9/l) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N ; "-s solution B : Na^PO^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tam- 10 · ponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1 N) à un débit de 2 ml/minute ; (étalon interne : 3,5-dihydroxy-toluène, t,, : 8,84 minutes)· f) Les groupes ci-après de signaux au spectre de résonance magnétique nucléaire à 270 MHz (tout 15 le spectre est indiqué dans la figure 3 des dessins annexés), enregistré dans du diméthylsulfoxyde-d^ avec addition de quelques gouttes de D2O (concentration : 25 mg/0,5 ml) (tétraméthyl-silane comme étalon interne : <5 = 0,0 partie par million) : 0,8-l,5(m) ; 20 1,7-2,3 (m) ; 2,7-4,0 (m) ; 4,0-4,7 (m) ; 4,8-5,8 (m) ; 6,2-8,1 (m).

g) Une fonction acide capable de former des sels, h) une fonction basique salifiable.

25 i) un poids moléculaire d’environ 1.875 déterminé par analyse spectrométrique de masse en utilisant un bombardement rapide d’atomes comme source d’ions (pour une description de la spectrométrie de masse à bombardement rapide d’atomes, 30 voir, par exemple, M. Barber et al., "Nature", 293, N° 5830, 270-275 (I98I)).

Le facteur 2 de la Teichomycine A^ est une poudre amorphe blanche qui commence à prendre une couleur foncée lorsqu’elle est chauffée à 210°C et 35 qui est complètement décomposée à 250°C, ce facteur / t 9 ayant les caractéristiques suivantes : a) Il est librement soluble dans l'eau à un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le ciméthu-lform.amide, le diméthylsulfoxyde et le pro- 5 pylène-glycol ; légèrement soluble dans le méthyl-cellosolve et le glvcérol ; faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol ; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, 10 le n-hexane, 1'acétonitrile, l1éther éthylique, l’acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone.

b) Il a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets (qui est donné en figure 4 des dessins 15 annexés) présentant les ir.axima d'absorption suivants : - dans l’acide chlorhydrique 0,1N : 7| 278 nni (eJ^ = 48) max 1cm - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7,4 :

λ β 27δ nm (eJ/c = 49,0) max ' ' 1cm * J

20 — dans 1'hydroxyde de sodium 0,1N : ™ 7°>0)· c) Un spectre d'absorption des rayons infrarouges dans du nujol (indiqué en figure 5 des dessins annexés) avec 1-es maxima d'absorption ci-après que 25 l'on peut observer : 3700-3100, 2900-2800 (nujol), 1645, 1590, 1510, I46O (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol).

d) Après avoir préalablement séché l’échan-30 tillon a environ 140°C sous une atmosphère inerte (/» Δ P = 9,8), une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone î 56,15a l hydrogène : 5,15a > azote : 6,30¾ ; chlore : 3,90a ; oxygène (par diffé-35 rence) : 28,50¾.

/ 10 e) Un -temps de rétention (t^) de 22,6 minutes à l'analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colonne de "Zorbax 0DS,! 5 ji (marque commerciale déposée) 5 et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : KaH^PO^ 25 mM/acét-onitrile (9/l) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N 5 -5 solution B : Na^PO^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tam- 10 ponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N) avec un débit de 2 ml/minute (étalon interne : 3*5—dihydroxy— toluène, t r 8,54 minutes).

f) Les groupes de signaux ci-après au spectre de résonance magnétique nucléaire à 270 MHz (tout 15 le spectre est indiqué en figure 6 des dessins annexés), enregistré dans du diméthylsulfoxyde-d^ avec addition de quelques gouttes de ϋ£θ (concentration : 25 mg/0,5 ml) (tétraméthyl-silane comme étalon interne, ci = 0,0 partie par million) : 0,7”! <>5 (m) ; 20 1,8-2,2 (m); 2,7-4,5 (m) ; 4,6-5,7 (m) ; 6,2-8,1 (m).

g) Une fonction acide capable de former des sels.

h) Une fonction basique salifiable.

i) Un poids moléculaire d'environ 1.877 dé- 25 terminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d’atomes.

Le facteur 3 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, lors du chauffage, commence à se décomposer à 205°C et est complète-30 ment décomposée à 250°C, ce facteur ayant les caractéristiques suivantes : a) XI est librement soluble dans l'eau à un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le pro-35 pvlène-glycol ; i f 11 légèrement soluble dans le mét-hvl—cfellosolve et le glycérol 5 faiblement soluble dans le méthanol et 1*éthanol ; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, 5 le n-hexane, 1’acétonitrile, l'éther éthylique, l’acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone.

b) Un spectre d’absorption des rayons ultra— 5 violets (qui est donné dans la figure 7 des dessins 10 annexés) présentant les maxima d’absorption ci-après : - dans l’acide chlorhydrique 0.1N : Ä „ 27S nir, (E-J* = 4Q,2) ir.ax lcir. 9 - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7,4 ‘ 15 2?S ™ 50,5) - dans 1’hydroxyde de sodium 0,1K : λ a 297 nm (E-J^ = 72,7).

c) Un spectre d’absorption des iayons infrarouges dans du nujol (indiqué dans la figure δ des 20 dessins annexés) avec les maxima d’absorption ci- après que l’on peut observer : 3700-3100, 2960-2850 (nujol) ; I645, 1590, 1510, I46O (nujol), 1375 (nujol) ; 1300, 1230, II80, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845,-820, 800, 720 (nujol).

25 d) Ap rès avoir préalablement séché l’échan tillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte (% Δρ = 12), une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone : 5à,26% ; hydrogène : 30 5,20^ ; azote : 6,09/c J chlore : 3,957c S oxygène (par différence) : 27,90^.

e) Un temps de rétention (t,,) de 23,3 minu-tes à l’analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colon-35 ne de ”Zorbax ODS” 5 jx (marque commerciale déposée) 12 et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50^ de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : NaH9P0^ 25 mM/acétonitrile (9/l) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N; 5 solution B : ΝεΗοΡ0, 25 mM/acétonitrile (3/7) tam- 4 ponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/minute ; (étalon interne : 3,5-dihydroxy-toluène, tD : 8,84 minutes).

4 f) Les groupes de signaux ci-après au spec- 10 tre de résonance magnétique nucléaire *H à 270 MHz (tout le spectre est indiqué dans la figure 9 des dessins annexés), enregistré dans du diméthylsulfo-xyde-dß avec addition de quelques gouttes de Do0 (concentration : 25 mg/0,5 ml) (tétraméthyl-silane 15 comme étalon interne,, b = 0,0 partie par million) : 0,7-1,5 (m) ; 1,8-2,0 (m) j 2,7-4,5 (m) 5 4,6-5,7 (m) ,· 6,2-8,0 (m).

g) Une fonction acide capable de former des s els.

20 h) Une fonction basique salifiable.

i) Un poids moléculaire c1 environ 1.877, déterminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d'atomes.

Le facteur 4 de la Teichomycine A£ est une 25 poudre amorphe blanche qui, lors du chauffage, commence à prendre une couleur foncée à environ 210°C et qui est complètement décomposée à 250°C, ce facteur ayant les caractéristiques suivantes : a) Il est librement soluble dans l'eau à 30 un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le diméthvlsulfoxyde et le propylène-glycol ; légèrement soluble dans le méthyl-cellosolve et le glycérol ; 35 faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol, 13 presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, le n-hexane, 1 *acétonitrile, l’éther éthylique, l’acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone.

5 b) Il a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets (qui est donné dans la figure 10 des dessins annexés) présentant les maxinsa d’absorption ci-après : - dans l’acide chlorhydrique 0,1N : 10 λ · 27S nm = 52,5) '•max ' 1cm 3 - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7?4 î K™278 nm (eîL = s2-5) - dans 1’hydroxyde de sodium 0,1N : 2?7 ™ - «,5).

15 c) Un spectre d’absorption des rayons infra rouges dans du nujol (indiqué dans la figure 11 des dessins annexés) avec les maxima d’absorption suivants : 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, I5IO, I46O (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 20 1140, 1060, 1025, 970, 890, 540, Sl5, 720 (nujol).

d) Après avoir préalablement séché l’échantillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte {% Δ P = 9 * S), une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (mojTens) ci—après ’ · 25 de la composition : carbone : 56,50/£ ; hydrogène : 5,10/ί -, azote : 6,50% î chlore : 3>δθ£ $ oxygène ” = (par différence) : 28,10/0.

e) Un temps de rétention (tR) de 25,8 minu-tes a l’analyse par chromatographie liquide à haut 30 rendement à phases inversées en utilisant une colonne de "Zorbax ODS" 5 JP (marque commerciale déposée) et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : Na^PO^ 25 mM/acétonitrile (9/l) tam-35 ponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1K. Solution B : / / « 14 r

Nal^PO^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N) avec un débit de 2 ml/minute ; (étalon interne : 3*5-dihydroxy-toluène, t^ : 8,84 minutes).

5 f) Une fonction acide capable de former des sels .

g) Une fonction basique salifiable.

h) Un poids moléculaire d’environ l.Sçij déterminé par spectrométrie de masse à bombardement 10 rapide d'atomes.

Le facteur 5 de la Teichomvcine A0 est une a. * poudre amorphe blanche qui commence à prendre une couleur foncée lorsqu’elle est chauffée à 210°C et qui est complètement décomposée à 250°Cj ce facteur 15 ayant les caractéristiques suivantes : a) Il est librement soluble dans l’eau à un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxvde et le propy-lène-glycol ; 20 légèrement soluble dans le méthyl-cellosolve et le glycérol 5 faiblement soluble dans le méthanol et l’éthanol ; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, le n-hexane, 1’acétonitrile, l’éther éthylique, 25 l’acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone, b) Il a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets (qui est donné dans la figure 12 des dessins annexés) présentant les maxima d’absorption 30 ci-après : - dans l’acide chlorhydrique 0,1N : ^ 278 nm (eJ^ = 49,6) max 1cm 5 - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7?4 ’ λ 278 nm (eJ^ = 51,8) max 1cm 3 ' il 1 i 35 f 15 - dans 1*hydroxyde de sodium 0,1K : «x2”<Eicm = 78<8>· c) Un spectre d’absorption des rayons infrarouges dans du nujol (indiqué à la figure 13 des 5 dessins annexés) avec les maxima d’absorption ci- après que l’on peut observer : 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, I46O (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145j 1060, 1025, 970, 89Ο, 84Ο, 815, 720 (nujol).

10 d) Après avoir préalablement séché l’échan tillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte » (a Δ P = 10,1), une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone : 56,60/? ; hydrogène : 5*05 15 azote : 6,63^ ; chlore : 3,85a ; oxygène (par différence) : 27,87^.

e) Un temps de rétention (tj-J de 26,4 minutes à l’analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colonne 20 de ,!Zorbax ODS” 5 Jî (marque commerciale déposée) et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50^ de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : NaH^PO^ 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N ; solution B :

25 NaHoP0. 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponné à un pH

i. 4 de 6 avec du NaOH 0,1N) avec un débit de 2 ml/minute; ' - (étalon interne : 3,5-dihydroxy-toluène, t^ : 8,84 minutes).

f) Une fonction acide capable de former des 30 sels.

g) Une fonction basique salifiable.

h) Un poids moléculaire d’environ 1.891,déterminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d’atomes.

/ f 16

Chacun des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A0 contient une fonction acide capable de former des sels. Les sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux et d’ammonium pharmaceu-5 tiquement acceptables des facteurs 1, 2, 3* 4 et 5 de la Teichomycine A9 représentent un autre objet spécifique de la présente invention.

Parmi les sels représentatifs de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux, il y a les 10 sels de sodium, de potassium, de lithium, de calcium et de magnésium. Les sels d’ammonium englobent les sels d’ammonium, de même que les sels d’hydroxy- i alkyl(en C^-C^)ammonium et dIalkyl(en C^-C^)ammonium prima .res, secondaires ou tertiaires, 15 On prépare les sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux conformément aux procédés habituellement adoptés pour préparer des sels métalliques, A titre d’exemple, on dissout le facteur 1, 2, 3, 4 ou 5 de la Teichomycine A^ sous forme d’acide 20 libre dans un solvant approprié tel que le propylène-glvcol et, à la solution ainsi obtenue, on ajoute progressivement une quantité stoechiométrique d’une base minérale choisie appropriée.

Le sel *de métal alcalin ou de métal alcalino-25 terreux qui se forme, est ensuite récupéré par précipitation avec un produit non solvant et par fil- , tration.

En variante, on peut préparer ces sels sous une forme pratiquement anhydre par lyophilisation ; 30 dans ce cas, de l’un ou l'autre produit insoluble, on filtre des solutions aqueuses contenant les sels désirés provenant de la salification de la forme acide libre avec un hydroxyde ou un carbonate d’un métal alcalin ou d’un métal alcalino-terreux choisi 35 de manière appropriée en une quantité calculée de / { 17 ! façon à obtenir un pH se situant entre 7 8, puis on lyophilise.

On peut préparer les sels d’ammonium organiques en ajoutant l'amine judicieusement choisie 5 à une solution de la forme acide libre des facteurs 1* 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine An dans un solvant approprié tel que le propylène-glycol, puis on sépare le solvant et l'excès du réactif aminé par évaporation ou, en variante, on met les deux réac- a 10 tifs en contact dans la quantité minimum d'eau, puis on précipite les sels obtenus par addition d'un pro- ^ ' duit non solvant.

Comme on l’a indiqué ci—dessus, chacun des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A0 con-15 tient également une fonction basique pouvant être salifiée. Leurs sels d'addition d’acide pharmaceu-tiquement acceptables, que l’on prépare de façon connue dans la technique en mettant les facteurs individuels purs en contact avec un acide relative-20 ment fort, de préférence, avec un acide minéral, constituent un autre objet spécifique de la présente invention.

Préparation du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A

25 On porte une solution aqueuse du facteur 2 de la Teichomycine A2 (150 mg, 15 ml) à un pH de S par addition goutte à goutte de NaOH 0,1K, On filtre la solution obtenue, on la transfère dans la chambre d’un système de séchage par congélation et on la 30 congèle. Au terme de la congélation, on fait le vide dans la chambre jusqu’à 0,1 torr et on sublime de la glace en portant la plaque chauffante à 0°C.

On poursuit le procédé jusqu’à ce que le produit soit presque sec (teneur en humidité : environ 1%).

35 En titrant une solution du sel de sodium du facteur /· '( ιε 2 de la Teichomycine ainsi obtenu dans 25 ml de méthyl-cellosolve/H20 (3/l) av ec du HCl 0,1N, on observe la présence de deux fonctions titrables caractérisées par les valeurs pK suivantes : 7,03 5 et 4,78.

En suivant le procédé décrit ci—dessus, mais en partant des facteurs 1, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A^, on obtient les sels de sodium correspondants, La détermination de la quantité de sodium 10 · dans les sels finals confirme la formation d’un sel monosodique.

L’activité antibactérienne in vitro des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A,,, qui se sont avérés être principalement actifs contre les 15 bactéries gram-positives, a été déterminée vis-à-vis de produits d’isolation cliniques de staphylococci et streptococci en adoptant le procédé à dilution double dans un système de microtitrage. On a utilisé le bouillon de Penassay (Difco) et le bouillon de 20 Todd-Hewitt (Difco) respectivement pour les staphy— lococci et les streptococci. Pendant une nuit, on a dilué des cultures de bouillons de telle sorte que l’inoculum final soit constitué d’environ 10° unités formatrices de-colonies/ml, La concentration inhi-25 bitrice minimale a été lue par la plus faible concentration ne manifestant aucune croissance visible ’* , après incubation pendant 18-24 heures à 37°C. Les résultats obtenus sont repris dans le tableau XI ci-après, / .7 19 ! •η C ι ΟΟ 00 *\ CS P rH Ο Ο ·> * 1 Ο * *ί ιΗ Ο St tt Ο Ο ό I Ο io u-> *-π

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t ί 20

La relation de la puissance microbiologique des facteurs individuels 1, 2, 3j 4 et 5 a été déterminée par le procédé de diffusion dans l'agar-agar en utilisant S, aureus ATCC 653? comme germe 5 d'essai et le complexe de Teichomycine A0 , comme étalon. En particulier, on dissout une quantité adéquate du facteur 1 de la Teichomycine A0 , du facteur 2 de la Teichomycine kn , du facteur 3 de la Teichomycine A9 , du facteur 4 de la Teichomycine kn, 10 du facteur 5' de la Teichomycine A9 et du complexe de Teichomycine A0 utilisé comme étalon, dans du dimé-thylformamide à une concentration de 2.000 ^jg/ml.

On dilue davantage ces solutions en utilisant un tampon de phosphate Q,067M d'un pH de 7>4 additionné 15 de Sérum, bovin ( Ί 70 ) afin d'obtenir les concentrations suivantes : 2,5j 5> 10 et 20^ig/ml.

Ensuite, on plonge des disques de papier filtrant dans les solutions d'échantillons et on les dépose à intervalle régulier sur la surface de pla-20 ques d'agar-agar ensemencées avec une suspension du micro-organisme d'essai. On incube les plaques à 37°C pendant 18 heures, puis on mesure le diamètre des zones d'inhibition. Les résultats obtenus sont introduits dans un ordinateur afin de calculer la 2 .

25 puissance des facteurs individuels par rapport au complexe. ' *

Les résultats obtenus sont repris ci-après : / 21

Facteur 1 de la Teichomvcine An : 841 unités/mg

Facteur 2 de la Teichomvcine A9 : 1.086 unités/mg

Facteur 3 de la Teichomvcine A^ · 1*131 unités/mg

Facteur 4 de la Teichomvcine A9 : 1.066 unités/mg 5 Facteur 5 de la Teichomvcine kn : 954 unités/mg

Complexe de Teichomvcine A9 : 1.000 unités/mg.

Les facteurs 2, 3, 4 et 5 de la Teichomvcine A0 ont également· fait l'obi et d’essais dans des in-fections expérimentales provoquées par S. pneumoniae 10 et par 5. pyogenes chez la souris. Les expériences ont été effectuées en comparaison avec le complexe de Teichomvcine . Les résultats obtenus sont ' repris dans le tableau III ci-après.

TABLEAU III

15 Activité antibactérienne in vivo

Composé DEj* (mg/kg/jour) par voie 5 sous-cutanée S. pneumoniae L 44 S « pyogenes 20 L 49

Facteur 2 de la 0,28 (0,22-0,34) 0,15(0,13-0,18)

Teichomvcine A9

Facteur 3 de la 0,27 (0,23-0,32) 0,13(0,11-0,16) 25 1eichomycine A9

Facteur 4 de la 0,12 (0,98-0,14) 0,098 (0,073-

Teichomycine A9 0,11)

Facteur 5 de la 0,13 (0,10-0,15) 0,10 (0,098-

Teichomycine A2 0,13) 30 Complexe de 0,35 (0,28-0,44) 0,l8 (-)

Teichomycine A^ * D.E^q = Dose efficace à 50%, / 22 t i

La -toxicité aiguë approximative chez la souris (par voie intrapéritonéale) pour les facteurs 1) 2j 3, 4 et 5 de la Teichomvcine A0 est indiquée dans le tableau IV ci-après :

5 TABLEAU IV

Toxicité aiguë chez la souris (par voie intrapéritonéale)

Composé DL approximative * (me/kg) , ’

OU

10__

Facteur 1 de la > 1500 < 2000

^ J

Teichomycine A0

Facteur 2 de la >1500 < 2000

Teichomycine A0 à* 15 Facteur 3 de la > 1000 < 1500 T ei chomyc in e A2

Facteur 4 de la )> 500 < 1000

Teichomycine A2

Facteur 5 de la > 500 <( 1000 20 Teichomycine A2 * DL^-q = dose létale à 50%.

Compte tenu des résultats ci-dessus, les composés de la-présente invention, à savoir le fac-25 teur 1 de la Teichomycine A2, le facteur 2 de la

Teichomycine A2, le facteur 3 de la Teichomycine A0 , le facteur 4 de la Teichomycine A2 et le facteur 5 de la Teichomycine An peuvent être employés effica-cernent comme ingrédients actifs de préparations anti-30 microbiennes utilisées en médecine humaine et vétérinaire pour prévenir et traiter des maladies infectieuses provoquées par des bactéries pathogènes qui sont susceptibles aux ingrédients actifs. Dans ces trait-ements, ces composés peuvent être utilisés tels 35 quels ou sous forme de facteurs individuels ou, con- / Ί \ 23 sidérant la similitude de leur type d’activité, ils peuvent également être utilisés sous forme de mélanges de deux des cinq facteurs ou plus dans n'importe quelle proportion.

5 Les composés de la présente invention peu vent être administrés par voie orale, topique ou parentérale, l’administration par voie parentérale étant toutefois de loin préférée. Suivant le mode d'administration, ces composés peuvent être formulés 10 sous différentes formes de dosage. Les préparations pour administration par voie orale peuvent être sous forme de capsules, de comprimés, de suspensions ou de solutions liquides. Comme on le sait dans la technique, outre l'ingrédient actif, les capsules 15 et les comprimés peuvent contenir des excipients classiques tels que des diluants, par exemple, le lactose, le phosphate de calcium, le sorbitol et analogues, des lubrifiants, par exemple, le stéarate de magnésium, le talc, le polyéthylène-glycol, des 20 agents liants, par exemple, la polyvinylpvrrolidone, la gélatine, le sorbitol, la gomme adragante et la gomme arabique, des agents aromatisants, ainsi que des agents mouillants et désintégrants acceptables.

Les préparations liquides, généralement sous forme ; .

25 de suspensions ou de solutions aqueuses ou huileuses, peuvent contenir des additifs classiques tels que · , des agents de mise en suspension. Pour l'utilisation topique, les composés de la présente invention peuvent également être préparés sous des formes appro-30 priées pour l'absorption à travers la peau, les membranes muqueuses du nez et de la gorge ou les tissus bronchiques et ils peuvent être avantageusement sous forme de produits liquides pour pulvérisations ou inhalations, sous forme de pastilles ou encore sous 35 forme de produits pour le badigeonnage de la gorge.

a ;

V

24 !

Pour le traitement des yeux ou des oreilles, les préparations peuvent être présentées sous une forme liquide ou semi-liquide. Les applications topiques r euvent être formulées dans des bases hydrophobes 5 ou hydrophiles sous forme d’onguents, de crèmes, de lotions, de badigeons ou de poudres.

Les compositions pour injections peuvent être sous forme de suspensions, de solutions ou d’émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux et 10 elles peuvent contenir des agents de formulation tels que des agents de mise en suspension, des agents stabilisants et/ou des agents dispersants. En variante, l'ingrédient actif peut erre sous forme d’une poudre pour reconstitution, au moment de l'adminis-15 tration, avec un véhicule approprié tel que de l’eau stérile. La quantité du principe actif à administrer dépend de différents facteurs tels que la taille et l'état du sujet à traiter, le mode et la fréquence d'administration, ainsi que l'agent causatif en cause.

20 Les facteurs 1, 2, 2} 4 et 5 de la Teichomycine A2 sont généralement efficaces à un dosage quotidien se situant entre environ 0,1 et environ 20 mg d'ingrédient actif par kg du poids du corps, ce dosage étant éventuell-ement divisé en deux administrations ‘ ’ 25 par jour. Des compositions particulièrement souhaitables sont celles préparées sous forme d'unités de dosage contenant environ 50 à environ 250 mg par unité.

On donnera ci-après des exemples représenta— 30 tifs de la préparation de compositions pharmaceutiques .

On prépare une solution parentérale avec 100 mg du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A0 dissous dans 2 ml d'eau sté-35 rile pour injection.

/1 25

On prépare une solution parentérale avec 250 mg du sel de sodium du facteur 3 de la Teichomvcine A2 dissous dans 3 ml d’eau sté-rile pour injection, 5 On prépare un onguent topique avec 200 mg du facteur 2 de la Teichomycine A0, 600 mg de polyéthylène-glycol 4000 (Pharmacopée des Etats-Unis d’Amérique), 1,2 g de polyéthvlène—glycol 400 (Pharmaco-10 " pée des Etats-Unis d’Amérique),

Outre leur activité en tant que médicaments, les composés de la présente invention peuvent également être utilisés comme activeurs de croissance chez les animaux, 15 A cet effet, on administre un ou plusieurs des composés de l’invention par voie orale dans un aliment approprié, La concentration exacte utilisée est celle nécessaire pour fournir une quantité efficace de l'agent actif d’un activeur de croissance 20 lorsque des quantités normales de nourriture sont consommées· L'addition des composés actifs de l'invention à la nourriture animale est effectuée, de préférence, en préparant un prémélange approprié d’aliments con- .

25 tenant les composés actifs en une quantité efficace, puis en incorporant ce prémélange dans la ration corn- ’’ · plète.

En variante, on peut mélanger, dans la nourriture, un concentrât intermédiaire ou un supplément 30 de nourriture contenant l’ingrédient actif.

La façon dont on peut préparer et administrer ces prémélanges de nourriture et ces rations complètes, est décrite dans des manuels de référence (tels que "Applied Animal Nutrition’’, W.H. Freedman 35 et Co., S. Francisco, E.U.A., 1969 ou "Livestock /· ^ ___ ^ ! 26

Feeds and Feeding11, manuels 0 et B, Corvallis,

Oregon, E.U.A., 1977) qui sont mentionnés ici à titre de référence.

„ i «

Claims (11)

1· Composé antibiotique individuel essentiellement pur choisi parmi le groupe comprenant le facteur 1 de la Teichomvcine A2, le facteur 2 de 5 la Teichomvcine A0 , le facteur 3 de la Teichorr.ycine A2, le facteur 4 de la Teichomvcine A^ et le facteur 5 de la Teichomvcine A0 identifiés respectivement par les caractéristiques chimico-physiques suivantes : facteur 1 de la Teichomvcine A0 : poudre amorphe jL * 10 blanche qui, lors du chauffage, commence à prendre une couleur foncée à environ 220°C et qui est complètement décomposée à 255°C, ce facteur présentant les caractéristiques suivantes : a) il est librement soluble dans l'eau à un 15 pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propy-lène-glycol ; légèrement soluble dans le méthyl—cellosolve et le glycérol ; 20 faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol, presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, le n-hexane, 1'acétonitrile, l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone 1 25 b) il a un spectre d'absorption des rayons ultraviolets présentant les maxima d'absorption ’’ · suivants : - dans l'acide chlorhydrique 0,1N : λ 278 nm (E^/C = 49,5) max ' 1 cm * 30. dans un tampon de phosphate d'un pH de 7,4 : /1 278 nm (E?^ = 50,0) - dans 1'hydroxyde de sodium 0,1N : λ 297 nm = 72,1); max 1cm c) un spectre d'absorption des rayons infra- 35 rouges dans du nujol avec les maxima d'absorption / 28 ί ! suivants : 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, I5IO, I46O (nujol), 1375 (nujol), 1305* 1230, ll80, 1155, 1060, IO25, 970, 890, 845, 815, 72Ο (nujol) ; d) après avoir préalablement séché l'échan- 5 tillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte {% A p = 8,5), une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone : 56,70^ ; hydrogène : A ,90% azote : 6,65% chlore : 3,SO>7 ,· oxygène 10 (par différence) : 27,95/®; e) un temps de rétention (t^) de 21,2 minutes à l'analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colonne de "Zorbax ODS" 5 /U (marque commerciale /’ 15 déposée) et en éluant avec un gradient· linéaire de 0% à 50£ de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : NaH0P0^ 25 mM/acétonitrile (9/I) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N ; solution B : NaH^PO^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tam-20 ponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N) à un débit de 2 ml/minute ; (étalon interne : 3,5-dihydroxy-toluène, tD : 8,84 minutes) ; f) les groupes ci-après de signaux au spectre de résonance magnétique nucléaire à 270 MHz, enre- ; . 25 gistré dans du diméthylsulfoxyde-d^ avec addition de quelques gouttes de D20 (concentration : 25 mg/0,5 ml) * . (tétraméthyl-silane comme étalon interne : <£ = 0,0 partie par million) : 0,8-1,5 (m) ; 1,7-2,3 (m) ; 2,7-4,0 (m) ; 4,0-4,7 (m) 3 4,8-5,8 (m) ; 6,2-8,1 (m) ; 30 g) une fonction acide capable de former des sels ; h) une fonction basique salifiable j i) un poids moléculaire d'environ 1.875 déterminé par analyse spectrométrique de masse en 35 utilisant un bombardement rapide d'atomes 5 / / 29 le facteur 2 de la Teichomycine est une poudre amorphe blanche qui commence à prendre une couleur foncée lorsqu’elle est chauffée à 210°C et qui est complètement décomposée à 250°C, ce facteur présen-5 tant les caractéristiques suivantes : a) il est librement soluble dans l’eau à un pH supérieur à 7 oü à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le pro-pylène-glycol ; 10 légèrement soluble dans le méthyl—cellosolve et le glvcérol ; faiblement soluble dans le méthanol et l’éthanol j ' presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, le n-hexane, 1’acétonitrile, l’éther éthylique, 15 l’acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone : b) il a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets présentant les maxima d’absorption suivants : 20. dans l'acide chlorhydrique 0,1N : λ 27S nm = 45) max 1cm ' - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7,4 ï λ 278 nm (eJ^ = 49,0) - dans l’hydroxyde de sodium 0,1K : ) , 25 λ 297 nm (eJ/ü = 70,0) : c) un spectre d’absorption des rayons infra- »· . rouges dans du nujol avec les maxima d’absorption ci-après que l’on peut observer : 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, I46O (nujol), 30 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, llSO, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol) ; d) après avoir préalablement séché l’échantillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte Δ P = 9,8), une analyse élémentaire qui indique 35 les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de / /. 30 la composition : carbone : 56,15^= i hydrogène · 5,1S% i azote : 6,30^ ; chlore ; 3,90% ; oxygène (par différence) : 28,50£ ; e) un temps de rétention (t^) de 22,6 mi- 5 nutes à 1*analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colonne de "Zorbax ODS" 5 J* (marque commerciale déposée) et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de la solution B dans la solution A pendant 40 minu-10 · tes (solution A : KaHL^PO^ 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N ; solution B : NaHoP0 25 mM/acétonitrile (3/7) tam- ~ 4 ponné à un pH de 6 a\-ec du NaOH 0,1N) avec un débit de 2 ml/minute; (étalon interne : 3,5-dihydroxy-15 toluène, t : 8,84 minutes) ; f) les groupes de signaux ci-après au spectre de résonance magnétique nucléaire à 270 MHz, enregistré dans du diméthylsulfoxyde-d^ avec addition de quelques gouttes de Do0 (concentration : 25 mg/0,5 20 ml) (tétraméthyl-silane comme étalon interne, 6 = 0,0 partie par million) : 0,7-1,5 (m) J 1,8-2,2 (m) ; 2,7-4,5 (m) 5 4,6-5,7 (m) ·, 6,2-8,1 (m) ; g) une fonction acide capable de former des sels ; - 25 h) une fonction basique salifiable ; i) un poids moléculaire d1 environ 1.&77 dé- ’ ' terminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d'atomes ; le facteur 3 de la Teichomycine A0 est une poudre 30 amorphe blanche qui, lors du chauffage, commence à se décomposer à 205°C et est complètement décomposée à 250°C, ce facteur présentant les caractéristiques suivantes : a) il est librement soluble dans l’eau à un 35 pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le 31 diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le pro-pylène-glycol j légèrement soluble dans le méthyl-cellosolve et le glycérol $ 5 faiblement soluble dans le méthanol et 1*éthanol j presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, le n-hexane, 1’acétonitrile, l’éther éthylique, l’acétone, l’acétate d’éthvle et le tétrachlorure de carbone ; 10 b) un spectre d’absorption des rayons ultra violets présentant les maxima d’absorption ci-après : - dans l’acide chlorhydrique 0,1N : ^ a 27S nm (e}a = 49,2) - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7j>4 : · - dans 1’hydroxyde de sodium 0,1N ï L 297 “ (Eîcr. = 72>7) 5 c) un spectre d’absorption des rayons infrarouges dans du nujol avec les maxima d'absorption 20 ci-après que l’on peut observer : 3700-3100, 2960-2850 (nujol) : 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol) ; 1375 (nujol) ; 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol) ; d) apr ès avoir préalablement séché 1 ' échan- , 25 tillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte {% Δ P = 12), une analyse élémentaire qui indique ·* . les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone : 56,26^ ·, hydrogène : 5,20^ ; azote : 6,69a l chlore : 3s95a '> oxygène 30 (par différence) : 27,90^ ; e) un temps de rétention (tD) de 23,3 mi-nutes à l’analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colonne de "Zorbax ODS” 5 J*· (marque commerciale déposée) 35 et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50£ / 32 l· de la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : Na^PO^ 25 πίΜ/acétonitrile (9/l) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N ; solution B : NaH2P0^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tam-5 ponné à un pH de ό avec du NaOH 0,1N') avec un débit de 2 ml/minute ; (étalon interne : 3,5-dihydroxy-toluène, t^ : 8,84 minutes) 5 f) les groupes de signaux ci—après au spectre de résonance magnétique nucléaire 1H à 270 MHz, 10 enregistré dans du diméthylsulfoxvde-d^ avec addition de quelques gouttes de Do0 (concentration : 25 mg/0,5 ml) (tétraméthyl-silane comme étalon in-terne, é = 0,0 partie par million) : 0,7-1,5 (m) 5 1,8-2,0 (m) ,· 2,7-4,5 (m) ; 4,6-5,7 (m) : 6,2-8,0 15 (m) ; g) une fonction acide capable de former des sels ; h) une fonction basique salifiable ; i) un poids moléculaire d’environ 1.877, dé-20 terminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d’atomes ; le facteur 4 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, lors du chauffage, commence à prendre une couleur foncée à environ 210°C et qui est . ’ 25 complètement décomposée à 250°C, ce facteur présen tant les caractéristiques suivantes : a) il est librement soluble dans l’eau à un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxvde et le pro-30 pylène-glycol ; légèrement soluble dans le méthyl-cellosolve et le glycérol \ faiblement soluble dans le méthanol et l’éthanol ; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, 35 le n-hexane, 1‘acétonitrile, l’éther éthylique, / 33 1*acétone, l’acétate d’éthyle et le tétrachlorure de carbone ; b) il a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets présentant les maxima d’absorption 5 ci-après : - dans l’acide chlorhydrique 0,1N : λ 278 nm (eJ^ = 52,5) max 1cm - dans un tampon de phosphate d’un pH de 7,4 : λ 278 nm (E^ = 52,5) max 1 cm 10. dans 1’hydroxyde de sodium 0,1 N : \ax 2” nn, (E**, = 75,5) ; c) un spectre d’absorption des rayons infrarouges dans du nujol avec les maxima d’absorption suivants : 3700-3100, 296Ο-284Ο (nujol), 1045, 1590, 15 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 97Ο, 890, 84Ο, 815, 720 (nujol) ; d) après avoir préalablement séché l’échantillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte (% Δ p = 9,8), une analyse élémentaire qui indique 20 les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone : 56,50^ ; hydrogène : 5,10% 1 azote : 6,50% ; chlore : 3,So£ ; oxygène (par différence) : 28,10^ ; e) un temps de rétention (tR) de 25,S minu- . · 25 tes à l’analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases inversées en utilisant une colon- ' ’ ne de "Zorbax ODS" 5 (marque commerciale déposée) et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de la solution B dans la solution A pendant 40 mi-30 nutes (solution A : NaH2P0^ 25 niM/acétonitrile (9/1) tamponné à-un pH de 6 avec du NaOH 0,1N } solution B : NaH^PO^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N) avec un débit de 2 ml/minute ; (étalon interne : 3,5-dihvdroxy-35 toluène, tR : 8,84 minutes) ; i 34 f) une fonction acide capable de former des sels; g) une fonction basique salifiable ; h) un poids moléculaire d'environ 1.891j dé- 5 terminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d'atomes ; le facteur 5 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui commence à prendre une couleur foncée lorsqu'elle est chauffée à 210°C et qui est « 10 complètement décomposée à 250°C, ce facteur présentant les caractéristiques suivantes : a) il est librement soluble dans l'eau à un pH supérieur à 7 ou à un pH inférieur à 2, dans le diméthylformamide, le dimét-hylsulf oxyde et le pro- 15 pylène-glycol ; légèrement soluble dans le méthvl-cellosolve et le glycérol ; faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol j presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, 20 le n-hexane, 1'acétonitrile, l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone ; b) il a un spectre d'absorption des rayons ultraviolets présentant les maxima d'absorption » 25 ci-après : - dans l'acide chlorhydrique 0,1K : * 278 = 49’6) - dans un tampon de phosphate d'un pH de 7*4 î Kax 278 ™ (EÎL = 5l*S> 30. dans 1'hydroxyde de sodium 0,1N : Anax 297 nm (EîL = 78’S> 5 c) un spectre d'absorption des rayons infrarouges dans du nujol avec les maxima d'absorption ci-après que l'on peut observer : 3700-3100, 2960-2840 35 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 4 35 1300* 1230* 1175, 1145, 1060* 1025, 970* 890* 840, 815* 720 (nujol) ; d) après avoir préalablement séché l’échantillon à environ 140°C sous une atmosphère inerte 5 (a Δ p = 10*1)* une analyse élémentaire qui indique les pourcentages approximatifs (moyens) ci-après de la composition : carbone : 56*60/; * hydrogène : 5,05a ; azote : 6*63a î chlore : 3*85a 5 oxygène (par différence) : 27*87^ ; 10 e) un temps de rétention (tD) de 26*4 minu- K tes à l’analyse par chromatographie liquide à haut rendement à phases imrersées en utilisant une colonne de ”Zorbax ODS” 5 (marque commerciale déposée) et en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50a de 15 la solution B dans la solution A pendant 40 minutes (solution A : NaHoP0. 25 mM/acétonitrile (9/l) tam- * 4 ponné à un pH de 6 avec du NaOH 0*1K i solution B : Nal^PO^ 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponné à un pH de 6 avec du NaOH 0,1N) avec un débit de 2 ml/minute * 20 (étalon interne : 3,5-dihydroxy-toluène* t^ : S*&4 minutes) * f) une fonction acide capable de former des sels } g) une fonction basique salifiable ; . ' 25 h) un poids moléculaire d’environ 1.891* dé terminé par spectrométrie de masse à bombardement rapide d’atomes, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

2. Composé antibiotique individuel essen-30 tiellement pur choisi parmi le groupe comprenant le facteur 1 de la Teichomycine A0* le facteur 2 de la Teichomycine A2 et le facteur 3 de la Teichomycine A9 identifiés par les caractéristiques indi-quées dans la revendication 1, ainsi Que leurs sels 35 de métaux alcalins* de métaux alcalino-terreux et si 5 ^ 36 ! d'ammonium pharmaceutiquement acceptables.

3. Composé antibiotique individuel essentiellement pur choisi parmi le groupe comprenant le facteur 2 de la Teichomycine A9 et ses sels pharma- 5 ceutiquement acceptables.

4. Procédé de préparation d'un composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à séparer la Teichomycine A0 en facteurs indi\riduels par chroma— 10 tographie d'échange d'ions ou par chromatographie· de partage à phases inversées et éventuellement transformer les composés obtenus en sels correspondants pharmaceutiquement acceptables par des procédés connus en soi. 15

5· Procédé suivant la revendication 4j ca ractérisé en ce qu'on effectue la séparation par chromatographie en colonne en utilisant une colonne de gel de silice traité au silane, ainsi qu'une élu-tion a gradient d'acétonitrile dans du formiate 20 d'ammonium aqueux dilué comme révélateur.

6. Procédé suivant la revendication $> caractérisé en ce qu'on développe la colonne dans un gradient linéaire de 10 à 20% d'acétonitrile dans une solution de formiate d'ammonium à 0,2£.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que, lorsqu'on récupère des mélanges - de deux facteurs de la colonne, on les sépare en facteurs individuels par chromatographie en colonne à phases inversées en utilisant une colonne d'octa-30 décyl-silane et un mélange 24:76 d*acétonitrile et de formiate d'ammonium aqueux à 0,2% comme révélateur.

8. Procédé suivant la revendication 6 pour la préparation du facteur 2 de la Teichomycine A2, 35 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consis- / / 37 tent à dissoudre un complexe de Teichomycine A2 dans un mélange 9:1 de formiate d’ammonium à 0,2% et d1acétonitrile, régler le pH à environ 7 >5 Par addition de NaOH, faire passer la solution obtenue 5 à travers une colonne de gel de silice traité au silane, développer la colonne dans un gradient linéaire de 10 à 20% d'acétonitrile dans une solution de formiate d’ammonium à 0,2;^, recueillir les fractions qui, à la chromatographie liquide à haut 10 rendement, ont le même profil caractéristique que celui du facteur 2 de la Teichomycine A-,, séparer le solvant organique par évaporation sous pression réduite, dessaler la solution aqueuse subsistant après le passage à travers une colonne de gel de 15 silice traité au silane, laver la colonne avec de l’eau, l’éluer avec de 1’acétonitrile aqueux à 50%> concentrer l’éluat à un faible volume et en précipiter le facteur 2 de la Teichomycine Aj s l’état pur par addition d’un produit non solvant. 20

9· Procédé suivant la revendication 4j ca ractérisé en ce qu’on effectue la séparation par chromatographie en colonne en utilisant le dérivé diéthylaminoéthyle d'agarose comme phase fixe, ainsi que des solutions tampons ou des mélanges de solu- , . 25 tions tampons et de solvants non aqueux miscibles à l’eau comme éluents. " ’

10. Composition antibiotique comprenant deux, trois, quatre ou tous les cinq facteurs individuels de la revendication 1 dans n’importe quelle 30 proportion.

11. Composition pharmaceutique pour utilisation antibactérienne, caractérisée en ce qu’elle contient un composé suivant la revendication 1 comme ingrédient actif. / ! k \ \ · r "v_ V V \ k \ %