BG60529B2

BG60529B2 - Чисти единични фактори 1,2,3,4 и 5 на теихомицина долу 2 и метод за тяхното получаване

Info

Publication number: BG60529B2
Application number: BG98541A
Authority: BG
Inventors: Angelo Borghi; Rosa Pallanza; Carolina Coronelli; Giovanni Cassani
Original assignee: Gruppo Lepetit S.P.A.
Priority date: 1982-06-08
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 1995-07-28
Also published as: IE55025B1; IT1212085B; NZ204480A; GB8315003D0; FI73697B; IE831329L; PT76831A; BE896993A; DK245883A; DE3320342A1; NO159104B; ZA833607B; CA1208204A; SE8303211D0; FR2528050B1; JPH02291279A; AU1496883A; JPH0224278B2; NO159104C; HU193538B

Abstract

Изобретението се отнася до нови антибиотични вещества теихомицин а2 фактори 1,2,3,4 и 5, влизащи в състава на комплексен антибиотик теихомицин а2, получен съгласно gв 1496386. Единичните фактори се получават от комплексния антибиотик чрез разделяне с колонна хроматография, но имат по-висока антибиотична активност от него.

Description

(57) Изобретението се отнася до нови антибиотични вещества - теихомицин А₂ - фактори 1,2,3,4 и 5, влизащи в състава на комплексен антибиотик теихомицин А₂, получен съгласно GB 1496386. Единичните фактори се получават от комплексния антибиотик чрез разделяне с колонна хроматография, но имат по-висока антибиотична активност от него.

претенции, 13 фигури

ЧИСТИ ЕДИНИЧНИ ФАКТОРИ 1, 2, 3, 4 И 5 НА ТЕИХОМИЦИН А

И МЕТОД ЗА ТЯХНОТО ПОЛУЧАВАНЕ

GB-A1496386 се отнася до Теихомицин А - една от няколкото различни антибистични субстанции, получени чрез култизиране на щам Actinoplanes Teichumyceticus nov.sp. АТСС 31121 в хранителна среда, съдържаща усвоини източници на въглерод, азот и неорганични соли. Съгласно метода, описан в GB-A1496386, от отделената културална течност се получава антибиотична смес, съдържаща Теихоминини А , А и

2

А посредством екстракция с подходящ водонесмссваеи органичен разтворител и утаяване от екстрахиращия разтворител по обичайните методи. След това от антибиотичката смес се отделя Зеихомицин А посредством о

колонка хроматография със Sephadex. След по-нататъшно пречистване чрез прекарване през сулфонирана полистиролсва смола Теихомицин А е охарактеризиран с помощта на различни физико-химични параметри, в т.ч. стойностите на R от f

хартиена и тънкослойна хроматография, където съединението се проявява като същински еднороден продукт.

Неочаквано се установява, че всъщност Теихомицин

А представлява смес от няколко тясно свързани помежду си антибиотични субстанции, чиито основни фактори са назовани

Теихомицин	А 2	- фактор	1,	Теихомицин А 2	- фактор	2,
Теихомицин	А	- фактор	3,	Теихомицин А	- фактор	4 и
	2			2
Теихомицин	А 2	- фактор	5.	Установено е	също така	, че тези

чисти единични фактори се различават биологически от

Теихомицин А комплекс по това, че имат по-висока степен на 2 биологична активност срещу чувствителните микроорганизми.

Характеристиките на чистите по същество фактори на антибиотичния комплекс са:

Теихомицин А - фактор 1: бял който при нагряване започва да потъмнява аморфен прах, когато температурата достигне около о

255 Си който о

220 С и се разлага напълно при

а) е лесно разтворим във вода при pH диметилфорнамид диметил сулфоксид и пропиленгликол слабо разтворим в 2-метоксиетанол и глицерол; лошо разтворим в метанол и етанол; почти неразтворим в хлороформ, бензол, н-хексан, ацетонитрил, диетилов етер, ацетон, етилацетат и тетрахлорметан:

има ултравиолетов абсорбционен спектър със следните три максимални стойности на абсорбцията (вих Фиг. 1 от приложените чертежи

1%
278 nm (Е	= 49,5)
шах	1 cm
	1%
	278 nm (Е	= 50,0)
max	1 cm
	1%
	297 nm (E	= 72,1)
max	1 cm

в 0,1 N солна киселина във фосфатен буфер pH 7,4 в 0,1 N натриева основа;

в) има инфрачервен абсорбционен спектър (виж Фиг. 2) в течен парафин със следните максимални стойности на абсорбцията:

3700-3100, 2960-2840 (парафин), 1645, 1590, 1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1305, 1239, 1189, 1155, 1060.

970, 890, 845, 815, 720 (парафин);

1025, о

г) при елементния анализ при около 140 С и инертна атмосфера ( w - 8,5) показва следните приблизителни средни резултати: С - 56,7%; Н - 4,90%; N - 6,65%; С1 - 3,80%; О (чрез пресмятане на разликата) - 27,95%;

д) има време на задържане (t ) 21,2 минути при анализ чрез

R високоефективна течна хроматография (HPLC) с обърната фаза, с използуване на колона с 5 микрометра хидратирак силикагел и чрез елюиране с линеен градиент от 0-5и% разтвор В в разтвор

А за 40 минути (разтвор А: 25 mM NaH РО / ацетонитрил 24 (обемно съотношение 9:1), буфериран при pH 6,0 с 0,IN NaOH;

разтвор В: 25 mM NaH РО /ацетонитрил (обемно съотношение 24

3:7), буфериран при pH 6,0 с 0,lN NaON), с дебит 2 ml/min (вътрешен стандарт:

е) показва следните

3,5-дихидрокситолуол, t 8,84 минути); 1R сигнали в 270 MHz Н на ядреномагнитния резонанс (вих Фиг. 3), регистриран в DMSO-d (динетилсулф6 оксид - d ) с прибавени няколко капки D 0 (концентрация

2 mg/ (като вътрешен стандарт е използуван TMS (тетранетилсилан) при 0,00 б): 0,8-1,5 (m), 1,7-2,3 (т),

2,7-4,0 (т), 4,0-4,7 (т), 4,8-5,8 (т) , 6,2-8,1 (т);

х) има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

з) има основна функционална група, чрез която образува соли;

и

и) има молекулно тегло около 1875, определено с помощта на t'AB мас-спектронетрия .

Теихомицин A - фактор 2 е бял аморфен прах, 2 който при нагряване започва да потъмнява, когато о

температурата достигне около 210 С и се разлага напълно при о

250 С и който

а) притежава характеристиките за разтворимост, дефинирани за фактор 1 (а);

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (виж Фиг. 4) с три наксимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани за фактор 1(6), респективно 48, 49,0 и 70.0;

в) има инфрачервен абсорбционен спектър (виж Фиг. 5) в течен

парафин със следните наблюдавани наксинални стойности на абсорбпията: 3700-3100. 2960-2860 (парафин). 1645, 1590, 1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (парафин);

при елементния анализ, както е дефиниран за фактор 1 (г) w = 9,8): С - 56,15%; Н - 5,15%; N - 6,30%; С1 - 3,90%;

(чрез пресмятане на разликата) - 28,50%;

д) има време на задържане, както е определено за фактор 1 (д) равно на 22,6 минути;

е) показва следните сигнали в ядреномагнитния резонанс (виж за фактор 1 (е): 0,7-1,5 (т),

4,6-5,7 (т); 6,2-8,1 (т);

х) има киселинна функционална

270 MHz Н в спектъра на фиг. 6), както са дефинирани

1,8-2,2 (m) , 2,7-4,5 (т), група, чрез която образува соли;

з) има основна функционална група, чрез която образува соли (

и) има молекулно тегло около 1877, определено с помощта на FAB мас-спектрометрия.

Теихомицин А - фактор 3 е бял аморфен прах, който при нагряване започва да потъннява, когато о

температурата достигне около 205 С и се разлага напълно при о

250 С и който

а) притежава характеристиките за разтворимост, дефинирани за фактор 1 (а)

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (вих Фиг. 7' с три максимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани за фактор 1(6), респективно 49,2, 50,8 и 72,7;

в) яма инфрачервен абсорбционен спектър (вих Фиг. 8) в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100, 2960-2850 (парафин), 1645, 1590,

1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1300, 1230, 1180,

1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (парафин);

г) при елементния анализ, както е дефиниран за фактор 1 (г) (% w =12,0): С - 56,26%; Н - 5,20%; N - 6,69%; С1 - 3,95%;

О (чрез пресмятане на разликата) - 27 90%;

д) има време на задържане, както е определено за фактор 1 (д) равно на 23,3 минути;

е) показва следните сигнали в 270 MHz Н в спектъра на ядреномагнитния резонанс (виж фиг. 9), както са дефинирани за фактор 1 (е): 0,7-1,5 (m), 1,8-2,0 (m), 2,7-4,5 (ш),

4,6-5,7 (m) ; 6,2-8,0 (m) ;

x) има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

и

и) има молекулно тегло окопо 1877, определено с поношта на FAB мас-спектрометрия.

Теихомицин А - фактор 4 е бял аморфен прах, който при нагряване започва па потъмнява, когато о

250 С и който

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (вих Фиг.10) с три максимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани за фактор 1(6), респективно 52,5, 52,5 и 75,5;

в) има инфрачервен абсорбционен спектър в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията : 3700-3100, 2960-2840 (парафин)

1645, 1590,

1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1300,

1230, 1175,

1140, 1060,

970, 890, 840

815, 720 (парафин);

при елементния анализ както е дефиниран за фактор 1 (г) w = 9,8): С - 56,50%;

Н - 5,10%; N - 6,50%; С1 - 3,80%;

28,10%;

има време на задърхане, както е определено за фактор 1 , равно на 25,8 минути;

е) има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

ж) има основна функционална група, чрез която образува соли; и

з) има молекулно тегло около 1891, определено с помощта на FAB мас-спектрометрия.

Теихомицин А - фактор 5 е бял аморфен прах, който при нагряване започва да потъмнява, когато о

250 С и който

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (вих Фиг.12) с три максимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани за фактор 1(6), респективно 49,6, 51,8 и 78,8;

в) ина инфрачервен абсорбционен спектър (вих Фиг.13) в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100, 2960-2840 (парафин), 1645, 1590,

1510,	1460 (парафин),	1375	(парафин),	1300, 1230, 1175,
1145,	1060, 1025, 970,	890,	840, 815,	720 (парафин);
г) при елементния анализ,	както е дефиниран за фактор 1 (г)
(% W	= 10,1): С - 56,	60%;	Н - 5,05%;	N - 6,63%; С1 - 3,85%;

О (чрез пресмятане на разликата) - 27,87%;

д) има време на задържане, както е определено за фактор 1 (д), равно на 26,4 минути;

х) има основна функционална група, чрез която образува соли;

и

з) има молекулно тегло около 1891, определено с помошта на

FAB мас-спектрометрия.

Антибиотичните вещества от настоящото изобретение се получават от Теихомицин А , описан в GB-A1496386, чрез разделяне на антибиотичния комплекс ::а съставящите го отделни фактори с помошта на високоефективни хроматографски методи и извличане на основните фактори

комплекс описание

I*

Термините Теихомицин А антибиотичен комплекс, се

II антибиотични и Теихомицин А употребени в настоящето отнасят до сместа , която съдържа петте фактори, според настоящото изобретение, както са получени например чрез нетода, описан в GB-A1496386, и която смес там е назована Теихомицин А

Комплексът мохе да бъде разделен на основните чисти единични фактори чрез обръщане на фазите или йонообменна хроматография. Б първия случай инактивиран силикагел е уместно използуван като пълнех за колоната, а градиентно елюиране с ацетонитрил/ воден разтвор на амониев формиат като елюент; във втория случай като стационарна фаза е удачно използуван йонообменен гел, а като елюиращи системи са използувани водни буфери или смеси от водни буфери и неводни разтворители.

Предпочитаният метод за разделяне на Теихомицин А на отделни съединения е колонната хроматография с обръщане на фазите, с използуване на октадецилсиланова колона и като елюент — смес на ацетонитрил и 0,2%-ен воден разтвор на амониев формиат в обемно отношение 24:76.

Алтернативен метод е разделянето на Теихомицин А с помощта на колонна хроматография с пълнех от хидратиран силикагел и градиентно елюиране с ацетонитрил/воден разтвор на амониев формиат като елюент. В предпочитано изпълнение, колоната се елюира в линеен градиент от 10 до 20% ацетонитрил в 0,2%-ен воден разтвор на амониев формиат. В друго предпочитано изпълнение този процес включва ратваряне на Теихомицин А-конплекс в смес на 0,2% воден разтвор на амониев формиат и ацетонитрил в съотношение 9:1, установяване на pH около 7,5 чрез прибавяне на NaOH, прекарване на получения разтвор през колоната, елюиране на колоната, събиране на фракциите, които имат характерен за Теихомицин А - фактор 2 2

HPLC-профил, изпаряване на органичния разтворител под понижено налягане, изсопване на останалия воден разтвор чрез: прекарването му през колона със хидратиран силикагел, промиване на колоната с вода; елюирането й с 50%-ен ацетонитрил във вода; концентриране на елюата до получаване на малък обем; и утаяване на по същество чистия Теихомицин А -фактор 2 чрез прибавяне на изсолваи агент.

Добри резултати се получават също като за стационарна фаза се използува диетиламиноетилов дериват на агароза, а разделянето се извършва чрез постепенно елюиране с буферни разтвори или смеси от буферни разтвори и неводни, смесваеми с вода разтворители.

Процедурата по разделянето е проконтролирана с HPLC

Фракциите със сходен HPLC-профил се комбинират по желание , поппагаг се на по-нататъшно пречистване с подготвителна HPLC и се изсолват. След това единичните фактори се извличат от тези разтвори, чрез изпаряване на органичните разтворители, отстраняване на водата до получаване на малък оЬен и прибавяне на излишък от органичен разтворител, в който съединенията са неразтворими, така че да се утаят желаните продукти.

По-нататък следва илюстрация на разделителния процес предмет на изобретението. Есички проценти са тегловни, а съотношенията на течностите - обемни, освен в случаите, в които се посочва или ясно се вижда, че са използувани други мерни диници. Под втилов етер се има предвид диетилов етер, а под tl бутанол »1 n-бутанол. Запазените търговски марки са

Sephade , Merck , Whatman

Partisii”, Cellosolve ft

Difco,

Nujol” и ’’ Zorbax

Methylcellosolve представлява

2-метипоксиетанол,

Nujol течен парафин, а хидратиран силикагел .

Разделителен процес g Теихомицин А комплекс, получен по метода, описан в

GB-A-1496386, се разтварят в литър смес на

0,2%-ен амониев формиат и ацетонитрил в съотношение

9:1 с pH, установено на 7,5 с помощта на IN NaOH. Този разтвор се прекарва през колона , съдържаща

500 g хидратиран силикагел 60 (Merck). След това колоната се елюира с линеен градиент от до 20% ацетонитрил в

0,2%-он воден разтвор на амониев формиат в общ обем от 10 литра

Фракциите от около 20 ml всяка се събират и проверяват с HPLC

Таблица I са дадени стойностите на времето на задържане фактори 1, 2, 3, 4 и 5 при контролно за Теихоницин А разделяне с HPLC (работните условия са посочени под таблицата)

ТАБЛИЦА I

Теихомицин А - фактор

Време на задържане (минути)

121,2

222,6

323,3

425,8

526,4

3,5-дихидроикситолуол (вътрешен стандарт)8,84

Колона: 5 микрона Zorbax ODS (Du Pont)

Подвижна фаза: линеен градиент от 0%В до 50%В в А за 40 минути

А)	25 mM NaH	РО 2 4	/ Ацетонитрил	(9:1)
	буфериран	при	pH 6,0 с 0,1N	NaOH
В)	25 mM NaH	РО 2 4	/ Ацетонитрил	(3:7)
	буфериран	при	pH 6,0 с 0,1N	NaOH

Дебит: 2 ml/'min

Детектор: UV фотометър при 254 nm

Фракциите със сходен HPLC-профил се събират и органичният разтворител се изпарява под понижено налягане. Оставащите водни разтвори се прекарват през колона, съдържаща 10 g хидратиран силикагел (60) (Merck). Колоната се промива с дестилирана вода, за да се отстрани амониевият формиат, след което се елюира с 50%-ен воден разтвор аацетонитрил. Елюатът се концентрира до получаване на малък обем чрез прибавяне иа бутанол за улесняване на изпаряването на водата и след това се утаява със смес ацетон и етилов етер в съотношение 1:1. По горния начин от се (770 получава чист Теихомицин А - фактор 2 (410 mg) и фактор mg) . Теихомицин А - фактор 3 е снесен с Теихомицин А -фактор 2 2 2 в съотношение 1:1 и се пречиства по-нататък чрез HPLC със семипрепаративна колона при следните работни условия:

Колона: Whatman Partiaii ODS Μ 9 10/50

Подвижна фаза: 0,2 %-ен амониев формиат във вода/ацетонитрил (76:24) ml/miη

UV фотонетър при 254 nm : 20 mg.

Дебит: 4, Детектор: Зареждане

Също така, е проверка на всяка фракция с HPLC както и смесват (Добив:

Фракциите, съдържащи чист Теихомицин фракциите, съдържащи изсолват и утаяват,

510 mg Теихомицин А фактор чист Теихомицин А

А

- фактор 3, както е описано по-горе.

фактор 2 и 520 mg

Теихомицин

2, се фактор 3)

Получените от първата колона фракции съдържащи факторите 4 и 5 в съотношение 1:1 (около 500 mg) се смесват с друга група фракции, съдържащи смес от факторите (около

490 mg), получени по същия начин от друго, паралелно разделяне, и се разделят с помощта на семипрепаративна HPLC при същите работни условия, както за пречистването на Теихомицин А 2 фактор 4 е 350 mg.

фактор 3, като добивът на Теихомицин А

300 mg.

а на Теихоницин А фактор 5

Настоящото изобретение включва фармацевтично приемливите соли на единичните фактори

За предпочитане са солите на алкалните и алкалноземните метали, както и фармацевтично приемливите амониеви соли на Теихомицин А фактори

1, 2, 3, 4 и 5. Типични представители на солите на алкалните и алкално-земните метали са солите на натрия, калия лития, калция и магнезия;

към амсние вите соли спадат содите на амония и първичните, вторичните хидрокси и третичните (С - С ) алкиламониеви

4 ) алкиламониеви соли.

соли получават (С 1 Солите на по соли · или 5 в свободна алкалните и алкално-земните познати

Например киселинна начини

Теихомицин А метали попучаване се форма се разтваря в подходящо

3, 4 разтворител (примерно пропиленгликол) и към получения разтвор постепенно се прибавя приблизително стехиометрично количество подходящо подбрана неорганична основа.

След това получената сол на алкален или алкално-земен метал се извлича чрез утаяване с изсолващ агент и филтрация

Алтернативна възможност е тези соли да бъдат получени в по същество безводна форма, чрез пиофилизация; в този случай водните разтвори, съдържащи желаните соли, които са получени от реакцията на свободната киселинна форма с подходящо подбрани карбонат или основа на алкален или алкално-земен метал в количества, необходими за получаване на pH между 7 и 8, се филтрират за отстраняване на неразтворимите компоненти и се лиофилизират.

Органичните амониеви соли могат да се приготвят било като се прибави удачно подбран амин към разтвор на свободната киселинна форма на Теихомицин А - фактори 1, 2, 3, 4 и 5 в поцхидяш разтворител като пропиленгликол, след което се изпаряват разтворителят и излишният аминов реагент, било като се осъществи контакт между двата реагента в минимум количество вода и спец това чрез прибавяне на изселващ агент се преципитират получените соли.

Както е посочено пс-горе всеки от факторите 1, 2, 3, и 5 на Теихомицин А съдържа и основна функционална група, 2 способна да образува соли. Техните Фармацевтично приемливи соли , получени по общоизвестни начини чрез взаимодействие със силна киселина, за предпочитане неорганична, са също обект на настоящото изобретение

Приготвяне на натриева сол на Теихомицин А

Фактор 2

Воден разтвор на Теихомицин А ml) се довежда до pH 8,0 чрез прибавяне фактор 2 (150 mg, на O,1N NaOH на капки.

Полученият разтвор се филтрува и се замразява в камерата криосушене. След като замразяването завърши, въздухът в камерата се разрежда до 0,1 тора и ледът се сублимира чрез довеждане на нагревателната пластина до о

температура 0 С. Този процес продължава, докато продуктът стане почти сух (с влажност около 1%)

Титруването на разтвор на така получената натриева сол на Теихомицин А 2 фактор 2 в 25 ml метилцелосолв и Η 0 в съотношение 3:1 с

IN NaOH показва наличие на 2 титруеми функции, характеризиращи се с pH 7,03 и 4,78.

Съгласно гореописаната процедура, но изхождайки ст

Теихомицин А - фактор 1, 3, 4 и 5 се получават съответните натриеви соли. Количественото определяне на натрия в крайните соли потвърждава, че са получени соли с един атом натрии.

Антибактериалното действие на Теихомицин А фактори 1, 2, 3, 4 и 5 in vitro, които показват активност главно против грам-позитивни бактерии, е определено върху клинично изолирани стафилокски и стрептококи помощта на метода на двукратното разтваряне

За стафилококите и стрептококите са използувани респективно бульон на Penassay (Difco) и бульон на Todd-Hewitt (Difco)

На следващия ден куртуралните течности се разреждат до 3 около 10 единици/ml. Като съдържание на крайната посявка минимална инхибиторна концентрация (МИК) е отчетена най-ниската концентрация, при която не се отбелязва видим растеж на 18-ия до 24-я час от инкубацията, о

при 37 С. Получените резултати са обобщени в ТАБЛИЦА II по-долу:

ТАБЛИЦА II

и

Wi

II

03

co

гЧ

m 'ί

II

ft

II

o

CM

in

Ш

и

ι;

0

II

1

I

1

I

o

φ

»—I

II

H

II

CM

Ό

tn

i-4

*

u

II

X

II

ъ.

*.

o

ъ

o

tl

II

Я

II

o

*

o

II

e

II

*

o

II

η

H

O

11

II

cT

II

co

00

lD

i—I

’T

if

II

o

Ю

H

II

ft

II

o

*.

o

CM

in

m

II

0

II

1

o

1

o

r4

II

::

H

::

CM

i

m

-4

».

*.

*

:i

1!

X

It

*.

*

vO

o

Ъ

o

II

Η

Я

II

o

-

o

li

ϋ

A

II

o

c

II

If

ε

II

co

00

Ш

ι-4

ΓΜ

СЧ

II

J!

a

II

*

»-

ο

«·.

*.

гЧ

ιΌ

ιΐ

li

σ· o

ii

o

ο

-

ο

гЧ

γ—ί

CM

ο

I!

t|

It

1

ο

1

*

>1

1!

--¹ X

It

CM

I

m

—4

ο

II

s

1!

·.

*

1П

ο

*.

II

ii

w -e

li

o

ο

CM

*.

ο

и

It

s

}

ο

Ιί

II

X

li

*

Η

tl

ГЧ

;;

ο

Η

t;

:t

VO

V0

ι—I

m

II

ft

It

4

-

гЧ

*.

ъ

CM

II

0

II

i-H

гЧ

·.

ο

CM

1—1

**

1-4

11

ti

b

II

1

ί

ο

1

*.

ъ.

*

*·

1«

II

X

•1

00

ι-4

1

ιη

гЧ

ο

ι>

li

Я

II

·.

ъ

tn

ο

κ

II

•Θ·

II

o

ο

CM

ο

II

It

‘1

ο

Н

II

*

II

tl

r—1

II

ο

II

il

:i

Ό

\Ο

CM

‘1

II

ft

II

ъ

*.

·.

*

ιη

II

0

II

гЧ

1-4

ο

СЧ

II

H

!!

1

τ*4

1

ο

(Ν

1—1

r—1

II

X

II

00

CM

ι—1

CM

*

II

Я

II

ъ

*>

ο

*.

*

ο

II

•e

II

ο

1

ο

II

Ш

II

u

II

ο

II

1 0

It

»

II

a

II

ο

II

(0

II

3

co

cn

00

<η

co

II

X

II

υ

и

3

II

X

II

υ

ο и

υ

U

0

U

υ

и

η

Я

II

0

0 ·Μ

υ

□

φ

υ

и

co

υ

φ

II

Ρ

II

υ

□ Ό

0

φ

0

3

0

φ

II

ft

II

0

0 ·Μ

и

т

и

Ή

υ

co

υ

0

Η

и

ο

•4

II

0

II

<~ч

—· ε

0

Φ

0

C

0

Ή

ο·

0

Ρ

0

00

0

-Ρ

II

ο

II

>1

т

>, κ

•Ρ

С

•Ρ

0

4J

Ρ

•Ρ

φ

Ρ

•Η

Ρ

υ

II

ft

II

-С

3

λ φ

(λ

φ

£b

ε

£b

φ

Λ ω

α

>

Λ

3

Qj

co

Οι

φ

II

X

II

CU

Φ

φ

σ’

Φ

5

φ

υ

Φ Η

φ

•Η

Φ

σ’

Φ

-Η

φ

»—<

II

X

II

φ

Ρ

·γΗ

Ρ

0

Ρ

φ

Ρ

φ

Ρ Ρ

Ρ

С

Ρ

>

Ρ

φ

II

X

II

•Ρ

3

Ρ Οι

-Ρ

>4

Ρ

α

Ρ

φ

4-> ·Η

Ρ

φ

•Ρ

φ

•Ρ

0

•Ρ

σ’

II

W

φ

ω φ

СЛ

сь

ω

сь

ω

4-1

сл ε

ω

σι

СЛ

и

СЛ

X

СЛ

φ

Антибактериалната активност на индивидуалните фактори 1, 2, 3 , 4 и 5 е определена по агар-дифузионния метод като за микробнале н тест е използуван

Staphylococcus

Aureus АТСС 6538, а като стандарт

Теихомицин А

В частност

Теихомицин А фактор

Теихомицин

Теихомицин фактор 5 и

А - фактор 2

Теихомицин '1 еихомицин

- фактор 4, комплекс..

А - фактор

Теихомицин

2, разтварят поотделно в комплекс, използуван като стандарт, диметилформамид в концентрация 2000 се

Mg/ml. По-натагък тези разтвори се разреждат

0,067М фосфатен буфер с pH 7,4, допълнен

1% гопехпи серум за получаване на следните концентрации: 2

5, 5, и 20 .

След това кръгчета филтърна хартия се потопяват в пробните разтвори и се поставят на еднакви интервали по повърхността на плаките с агар, където е направена посявка със суспензия на тестувания о

микроорганизъм. Плаките се инкубират при 37 С в продължение на часа, след което се измерва диаметърът на зоните на инхибиране·

Получените данни се вкарват в компютър за изчисляване на активността на отделните фактори, отнесена към тази на комплекса.

Получените резултати са дадени по-долу

Теихомицин	А	2	фактор	1	841
Теихомицин	А	2	фактор	2	1086
Теихомицин	А	2	фактор	3	1131
Теихомицин	А	2	фактор	4	1066
Теихомицин	А	2	фактор	5	954
Теихомицин	А	-	комплекс	1000

единици/mg единици/mg единици/mg единици/mg единици/mg единици/mg

IB

Теихомицин A - фактори 2 , 3 , 4 и 5 са тестувани и при експериментални инфекции у мишки, предизвикани от S.

pneumoniae и S. pyogenes. Получените резуитвти са отразени в

ТАБЛИЦА III по-долу:

ТАБЛИЦА III Антибактериално действие in vivo

Съединение	ЕД 50	(mg / kg/ден)
		S .	pneumoniae L 44	S. pyogenes L 49
Теихомицин	А	0,28	(0,22-0,34)	0,15	(0,13-0,18)
фактор 2	2
Теихомицин	А	0,27	(0,23-0,32)	0,13	(0,11-0,16)
фактор 3	2
Теихомицин	А	0,12	(0,98-0,14)	0,098	(0,073-0,11)
фактор 4	2
Теихомицин	А	0,13	(0,10-0,15)	0,16	(0,098-0,13)
фактор 5	2
Теихомицин	А	0,35	(0,28-0,44)	0,18	( - )
конплекс	2
Приблизителната	остра	токсичност на	Теихомицин A - 0	фактори
1, 2, 3 , 4	и 5	при мишки (i. р. ) е	показана в ТАБЛИЦА IV
по-долу:
			ТАБЛИЦА IV
	Остра	токсичност у мишки (ί. р.)
Съдинен	не		Прибпизитална LD 50	(mg/kg)

Теихомицин	А	- фактор	1	>	1500	<	2000
Теихомицин	А	Z - фактор 9	2	>	1500	<	2000
Теихомицин	А	Z - фактор 9	3	>	1000	<	1500
Теихомицин	А	Z - фактор 9	4	>	500	<	1000
Теихомицин	А	Z - фактор	5	>	500	<	1000

Предвид на горното, съединенията от настоящото изобретение

Теихомицин А фактор ],

2, Теихомицин фактор 3, Теихомицин

Теихомицин А

А

- фактор 5

Теихомицин А 2 фактор 4 и

А могат да бъдат ефективно фактор използувани като активна съставка на антимихробни препарати, прилагани в хуманната и ветеринарната медицина за профилактика и лечение на инфекциозни заболявания, причинени от патогенни бактерии, активните съставки. При такова лечение тези съединения могат да бъдат използувани като такива или като единични фактори или пък предвид на сходството в техния модел на действие поп формата на смеси на два или повече от петте фактора в произволно съотношение

Съединенията от настоящото изобретение могат да бъдат прилагани перорално, локално или парентерално там, където парентерелната апликация е все пак за предпочитане

В зависимост от начина на апликация, тези съединения могат да бъдат под различни лекарствени форми.

Препаратите за перорална апликация могат да бъдат под формата на капсули, таблетки, течни разтвори или суспензия. Както е известно в тази област, капсулите и таблетките могат да съдържат наред с активната съставка и конвенционални ексципиенти като разтворители например лактоза, калциев фосфат и сорбитол ; сназочни вещества например магнезиев стеарат, талк, полиетиленгликол; свързващи агенти - например поливинилпиролидон, желатин, сорбитол, трагаканта, гума арабика; ароматизиращи вещества; и приемливи дезинтегриращи агенти и овлажнители. Течните препарати, обикновено под формата на водни или маслени разтвори или суспензии, могат да съдържат конвенционални адитиви като суспендиращи агенти. За локална употреба съединенията от настоящото изобретение могат да бъдат приготвени във форми, подходящи за абсорбиране през кожата, лигавицата на носа и гърлото или бронхиалната тъкан и могат удачно да приемат формата на течни спрейове или инхаланти, таблетки за смукане или багрила за гърло. За медикаментозно лечение на очите и ушите, препаратът може да бъде в течна или полутечна форма. Препаратите за локална употреба могат да бъдат под формата на хидрофобни или хидрофилни основи като мехлеми, кремове, лосиони, багрила или пудри. Съставите за инжектиране могат да бъдат под формата на суспензии, разтвори или емулсии върху водни вехикулуми и могат да съдържат формулиращи агенти като суспендиращи, стабилизиращи и/или дисперсиращи агенти.

Като алтернатива, активната съставка може па бъде под формата на прах за възпроизвеждане в момента на поставянето , заедно с подходящ вехикупум, например стерилна вода.

Количеството на активната основна съставка за апликация зависи от различни фактори като телесното тегло и състоянието на обекта , подлежащ на лечение, начинът и честотата на апликацията, причинителя на заболяването. Теихомицин А 2 фактори 1,2,3,4 и 5 обикновено са ефективни при дневна доза от 0,1 до 20 mg активна съставка на 1 kg телесно тегло, разпределени по избор на два приема дневно . Особено желани са съставите, приготвени под формата на единици, съдържащи 50

- 250 mg всяка.

Типични примери за приготвяне на фармацевтични състави

Парвнтералвн разтвор приготвен от:

100 mg катриенЕа сол на Теихомицин А фактор 2.

разтворена η ml стерилна вода за инжектиране

Парентерапен разтвор приготвен

250 mg натриева сол на

Теихомицин Λ разтворена в ml стерилна вода за инжектиране.

Мехлем за локално приложение, приготвен от:

200 mg

Теихомицин фактор

600 mg попие тиленгпикол

4000

U.S

1,2 mg полиетиленгликол

400

Наред с действието си като медикаменти.

съединенията от настоящото изобретение могат да бъдат използувани като стимулатори на растежа при животни.

За тази цел едно или повече съединения от изобретението се прилагат перорално с подходяща храна. Точната концентрация е онази, която е необходима, за да осигури ефективно стимулиращо растежа действие на активния агент при консумация на нормално количество храна.

За предпочитане е добавянето на активните съединения от настоящото изобретение към храната за животни да става като се приготви подходяща смеска, съдържаща активните съединения в ефективно количество и тя се включи към цялата дажба.

Като алтернатива, с храната може да се смеси >2 междинен концентрат съдържаща активната или хранителна добавка, съставка.

Начинът, по който такива смески и цели дажби могат да се приготвят и прилагат, е описан в справочната литература (например Applied Animal Nutrition, W.Н.Freedman and Co, S. Francisco, USA. 1969 или Livestock Feeds and Feeding, 0 and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ «

Чисто антибиотично вещество · , наречено Теихомицин А - фактор 1, представляващо бял. аморфен прах, който при нагряване започва да поιьнняиа, ο о при температура около 220 С и се разлага напълно при 255 С и който

а) е лесно разтворим във вода при pH > 7,0 или pH < 2, в диметилформамид, динетил сулфоксид и пропиленгликол; слабо разтворим в 2-метоксиетанол и глицерол; лошо разтворим в метанол и етанол; почти неразтворим в хлороформ, бензол, н-хексан, ацетонитрил. диетилов етер, ацетон, етилацетат и тетрахлорметан;

6) има ултравиолетов абсорбционен спектър със следните три максимални стойности на абсорбцията (вик Фиг. 1 от приложените чертежи)

278 nm max

1% (Е

1 cm

49,5) в 0,1 N солна киселина max

1%

278 nm (Е

1 cm

50,0) във фосфатен буфер pH 7,4 max

1%

297 nm (Е

72,1) в 0,1 N натриева основа;

1 cm

в) има инфрачервен абсорбционен спектър (виж Фиг. 2) в течен парафин със следните максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100,

2960-2840 (парафин), 1645, 1590, 1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890,

845, 815, 720 (парафин);

г) при елементния анализ след о

сушене при около 140 С в инертна атмосфера (% w

8,5) показва следните приблизителни средни резултати: С

56,7%; Η

4,

90%; Ν

6,65%; С1

3,80%;

(чрез пресмятане на разликата)

27,95%;

д) има време на задържане (t ) 21,

В високоефективна течна хроматография минути при анализ чрез (HPLC) с обърната фаза, с използуване на колона

е.

5 микрометра хидратиран силикагел и чрез елюиране с линеен градиент от 0-50% разтвор В в разтвор

А за 40 минути (разтвор А:

(обемно съотношение 9/1),

25 mM NaH РО / ацетонитрил pH 6,0 с 0, IN NaOH;

буфериран при разтвор

В: 25 mM NaH РО
2 4 pH 6,0 с 0,lN NaON)
3/7), буфериран при (вътрешен стандарт:

е) показва следните /ацетонитрил обенно·съотношение с дебит 2rnl/min

3,5-дихидрокситолуол, t 8,84 минути); R 1 спектър 270 MHz Н на групи сигнали в ядренонагнитния резонанс (вих Фиг.

3), регистриран в DMSO-d d ) с 6 (концентрация 25 mg/(като диметилсулфоксид прибавени няколко вътрешен стандарт капки D 0 е използуван TMS (тетраметилсилан) при 0,00 б): 0,8-1,5 (т).

1,7-2,3 (т).

7-4,0 (m), 4,0-4,7 (т), 4,8-5,8 (т), 6,2-8,1 (т);

има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

има основна функционална група, чрез която образува соли;

има молекулно тегло около 1875, определено с помощта на

FAB мас-спектрометрия или негова фармацевтично приемлива сол ·

Чисто антибиотично вещество ·, наречено Теихомицин А - фактор 2, представляващо бял, аморфен прах, който при нагряване започва да потъмнява, о о при температура около 210 С и се разлага напълно при 250 С и който

а) притежава характеристиките за разтворимост, дефинирани в претенция 1 (а) ;

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (виж Фиг. 4) с три максимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани в претенция 1(6), респективно 48, 49,0 и 70,0:

в) има инфрачервен абсорбционен спектър (виж Фиг. 5) в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100, 2960-2860 (парафин), 1645, 1590, 1510, 1450 (парафин), 1375 (парафин), 1300, 126G, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (парафин);

г) има средни приблизителни стойности от елементния анализ, както е дефиниран в претенция 1(г): (% w = 9,8): С - 56,15%; Н

5,15%; N - 6,30%; С1 - 3,90%; О (чрез пресмятане на разликата)

- 28,50%;

д) има време на задържане , както е определено за фактор 1 (д) равно на 22,6 минути;

е ) показва следните групи ядреномагнитния резонанс ( виж фиг . 6) , както са дефинирани в претенция 1 (е): 0,7-1,5 (т) ,

1,8-2,2 (m), 2,7-4,5 (ш),
4,6-5,7 (m); 6,2-8,1 (т)

ж) има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

з ) има основна функционална група чрез която образува соли;

и) има молекулно тегло около 1877 определено с помощта на

FAB мас-спектронетрия.

или негова фармацевтично приемлива

3. Цисто антибиотично вещества , наречено Теихомицин А - фактор 3, представляващо 2 бчп анорфен прах, който при нагряване започва дя потъмнява при о о температура около 205 С и се разлага напълно при 250 С и който

а) притежава характеристиките за разтворимост, дефинирани в претенция 1 (а)

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (вих Фиг. 7) с три максимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани за фактор 1(6), респективно 49,2, 50,8 и 72,7;

в) има инфрачервен абсорбционен спектър (вих Фиг. 8) в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100, 2960-2850 (парафин), 1645, 1590, 1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (парафин);

г) при елементния анализ, както е дефиниран в претенция 1 (г) , показва средни приблизителни стойности (% w =12,0): С - 56,26%; Н - 5,20%; N - 6,69%; С1 - 3,95%;

0 (чрез пресмятане на разликата) - 27 90%;

д) има време на задържане, както е определено за фактор 1 (д) равно на 23,3 минути;

е) показва следните групи сигнали в спектър 270 MHz Н на ядреномагнитния резонанс ( вих фиг. 9), както са дефинирани в претенция 1 (е): 0,7-1,5

1,8-2,0 (m), 2,7-4,5 (го),

6-5.7 (m); 6,2-8,0 (m) има киселинна функционална група, чрез която образува соли:

има основна функционална група, чрез която образува соли;

има молекулно тегло около 1877, определено с помощта на

ΕΆΒ мас-спектроиетрия или негова фармацевтично приемлива

Чисто 2НТИ0ИОТИЧНО веществф · наречено Теихомицин А фактор 4 бял аморфен температура прах, който при нагряване започва Да потъмнява при о о около 210 С и се разлага напълно при 250 С и който

а) притежава характеристиките за разтворимост, дефинирани в претенция 1 (а);

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (вих Фиг.10) с три наксинални стойности на абсорбцията, както са дефинирани в претенция 1(6), респективно 52,5, 52,5 и 75,5;

в) има инфрачервен абсорбционен спектър в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100, 2960-2840 (парафин)

1645, 1590,

1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1300,

1230, 1175,

1140, 1060, 970, 890, 840,

815, 720 (парафин

г) при елементния анализ, както е дефиниран за претенция 1(г), дава приблизителни средни стойности (% W

9,8) : С

56,50%; Н
5,10%; N
6,50%; С1 разликата) има време на задържане, както е определено за фактор 1 , равно на 25.8 минути;

има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

има основна функционална група, чрез която образува соли;

има молекулно тегло около 1891, определено помощта на

FAB мас-спектрометрия или негова фармацевтично приемлива сол ' Мис то антибиотично вещество , наречено Теихомицин А фактор 5 представляващо бял аморфен прах, който при нагряване започва да потъмнява при температура о о около 210 С и се разлага напълно при 250 С и който

а) притежава характеристиките за разтворимост, дефинирани в претенция 1 (а);

б) има ултравиолетов абсорбционен спектър (вих Фиг.12) с три максимални стойности на абсорбцията, както са дефинирани в претенция 1(6), респективно 49,6, 51,8 и 78,8;

в) има инфрачервен абсорбционен спектър (вих Фиг.13) в течен парафин със следните наблюдавани максимални стойности на абсорбцията: 3700-3100, 2960-2840 (парафин), 1645, 1590, 1510, 1460 (парафин), 1375 (парафин), 1300, 1230, 1175,

1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (парафин);

г) елементен анализ, както е дефиниран в претенция 1(г) (% w - 10,1): C - 56,60%; H - 5,05%; N - 6,63%; Cl - 3,85%; O (чрез пресмятане на разликата' - 27,87%;

д) има време на задържане, както е определено в претенция 1(д), равно на 26,4 минути;

е) има киселинна функционална група, чрез която образува соли;

х) има основна функционална група, чрез която образува соли;

з) има молекулно тегло около 1891 определено с помогата на

FAB нас-спектрометрия;

или негова фармацевтично приемлива

6. Алкален нетал, алкално-земен метал или фармацевтично приемлива анониева сол или всяко от съединенията обект на претенции 1-5.
7. Състав, съдържащ смес от две или повече от съединенията или солите съгласно която и да е от предходните претенции, с изключение на състава, описан като Теихомицин А в

Z

GB-A-1496386.
8. Съединение или състав съгласно която и да е от предходните претенции, за антибактериална употреба.
9. Метод за получаване на съединение или сол съгласно която и да е от предходните претенции, който включва разделяне на Теихомицин А на единичните фактори с помощта на разделяне с обърната фаза или йонообменна хроматография и при желание превръщане на така получените съединения в съответните фармацевтично приемливи соли.
10. Метод съгласно претенция 9, при който Теихомицин

А се разделя на единичните съединения чрез колонна хроматография с обърната фаза с използуване на колона октадесилсилан и смес от ацетонитрил и 0,2%-тен воден разтвор на амониев формиат в обенно съотношение 24:76 като елюент

Метод съгласно претенция 9, при който Теихомицин

А се разделя с помощта на колонна хроматография с използуване на колона с хидратиран силикагел и градиентно елюиране с ацетонитрил във воден разтвор на амониев формиат като елюент
12. Метод съгласно претенция 11, при който колоната се елюира с ацетонитрил в линеен градиент от 10 до 20% в

0,2%-ен воден разтвор на амониев формиат
13. Метод съгласно претенция 12 съединението от претенция 2 който включва разтваряне на

Теихомицин А комплекс в смес от 0 2 на амониев формиат и ацетонитрил в установяване на pH на около

7,5 прекарване на получения разтвор

2%-ен воден съотношение чрез прибавяне през колоната, разтвор

9:1, на NaOH, елюиране на колоната, събиране на фракциите които имат HPLC-профил , характерен за Теихомицин А - фактор 2, 2 изпаряване на органичния разтворител при понижено налягане , изсолване на останалия воден разтвор чрез прекарването му през колона с хидратиран силикагел, промиване на колоната с вода, елюиране на колоната с

50%-ен ацетонитрил във вода, концентриране на елюата до малък обем и утаяване на намиращия се в него по същество чист

Теихомицин А фактор 2 чрез прибавяне на изсолващ агент.
14. Метод съгласно претенция 9, при който

Разделянето се постига чрез колонна хроматография с използуване на диетипаминое тиловия дериват на агарсзата като постоянна фаза и буферни разтвори или смеси от буферни разтвори и неводни водносмесими разтворители като елюенти.