DK167815B1

DK167815B1 - Antibiotikum a 40926 mannosyl-aglycon og farmaceutisk acceptable additionssalte deraf, fremgangsmaade til fremstilling heraf, anvendelse af forbindelsen til fremstilling af et medikament samt farmaceutisk praeparat indeholdende en saadan forbindelse

Info

Publication number: DK167815B1
Application number: DK617086A
Authority: DK
Inventors: Giovanni Cassani; Francesco Parenti; Enrico Selva; Beth P Goldstein; Peetro Ferrari
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1985-12-30
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1993-12-20
Also published as: JPS62175499A; ZA869716B; IL81105A; HU201099B; GR3003514T3; JP2514942B2; EP0228015A3; ATE71113T1; DE3683266D1; GB8531846D0; KR960010556B1; EP0228015B1; KR870006193A; HUT43091A; DK617086D0; KR950010460B1; IE863381L; IE59603B1; ES2038593T3; KR890002230A

Description

DK 167815 Bl

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotisk stof der er betegnet antibiotikum A 40926 man-nosylaglycon og farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, en fremgangsmåde til fremstilling deraf ud fra an-5 tibiotikum A 40926 kompleks eller en faktor deraf og forbindelsens anvendelse til fremstilling af et medikament til behandling af infektionssygdomme fremkaldt af mikroorganismer der er følsomme derfor, samt et farmaceutisk præparat indeholdende en sådan forbindelse.

10 Antibiotikum A 40926 kompleks og dets faktorer er antibiotiske stoffer der er virksomme mod grampositive bakterier og stammer af Neisseria, og det frembringes af stammer af slægten Actinomadura.

En A 40926-producerende stamme af slægten Actino-15 madura er deponeret den 8. juni 1984 hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 10852, USA under Budapest-traktatens regler.

Antibiotikum A 40926 er et komplekst antimikrobi-elt stof; fem af dets komponenter er blevet isoleret og 20 identificeret som faktor PA, PB, A, B og Bq.

Antibiotikum A 40926 og dets faktorer såvel som den producerende mikroorganisme og en fremgangsmåde til fremstilling deraf er beskrevet i europæisk patentansøgningspublikation nr. 177.882. På basis af de fysisk-kemi-25 ske data,og på baggrund af strukturerne af kendte antibiotiske stoffer,kan nedenstående formel I tilskrives A 40926-faktorerne (hvorved nummereringen er analog med den der er foreslået af J. Williams i J.A.C.S. 106, 4895-4908 (1984)): 30 DK Ίο/οΊ o ΒΊ 2

0A H

z h °

H o 6H 6 1] J 4 li 2|H

5 fW^-b HZ3 b r*jl-^γ- -ηΛ/®2-€η3

Xe 8*? X, ! 10 - n-h civ^X, ji °^c_Uhx7 ΓηΙ Tm Γη 0 V/ Oh ho

f^VoB 0H

15 1 hvilken formel A betegner en N-(C^_^2)acylamin°glucu-ronylgruppe og B betegner en mannosyl eller acetylmanno-sylgruppe.

Nærmere betegnet er antibiotikum A 40926 faktor A 20 en forbindelse med den ovenfor viste formel I, hvor A er undekanoyl-aminoglucuronyl og B er mannosyl; antibiotikum A 40926 faktor Bq er den forbindelse med ovenstående formel, hvor A er isododekanoyl-aminoglucuronyl og B er mannosyl.

25 Antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB afvi ger fra de tilsvarende faktorer A og Bq ved at mannose-en-heden er erstattet med en acetylmannose-enhed.

Antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB er, i det mindste under visse gæringsbetingelser, de antibiotiske 30 hovedprodukter som dannes af den A 40926-producerende mikroorganisme.

Antibiotikum A 40926 faktorer A og B er i hovedsagen omdannelsesprodukter af antibiotikum A 40926, henholdsvis faktor PA og PB, og er ofte til stede allerede 35 i gæringssuppen.

Det har vist sig at antibiotikum A 40926 faktor PA kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor A, og antibiotikum A 40926 faktor PB kan omdannes til antibio- 3 DK 167815 B1 tikum A 40926 faktor B under basiske betingelser.

Som følge heraf vil der, når gæringssuppen eller en antibiotikum A 40926-inholdende ekstrakt eller koncen-tfat deraf henstår i en vis tid under basiske betingel-5 ser (fx en vandig opløsning af en nukleofil base, ved en pH-værdi på >9 natten over), vindes et antibiotikum A 40926 kompleks som er beriget med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B.

10 Antibiotikum A 40926 mannosylaglycon er ejendommelig derved at det har følgende egenskaber (i den form hvor det ikke er additionssalt): A) et ultraviolet absorptionsspektrum, der er vist i ^ tegningens fig. 1 og udviser følgende absorptionsmaxima:

Amax, nm a) 0,1N HCL 280 b) fosfatpuffer pH 7,38 280 300 (skulder) 20 c) 0,1N kaliumhydroxid 298 d) fosfatpuffér pH 9,0 282 300 (skulder) B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i teg- ningens fig. 2 og som udviser følgende absorptionsmaxima: /5 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620-1540; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1350-1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810 cm-1 C) ^H-NMR-spektrum som er vist i fig. 3 og som udvi ser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz optaget i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) plus CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm: 2,51, s (DMS0d5); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 3,30, m (Z’2); 4,08, m (X6); 4,44, d (X5); 4,49, d (X7); 4,83,

0D

m (X2); 5,02, s (4F); 5,08, s (Z6); 5,31, s (anomeriske proton af mannose); 5,53, d (X4); 5,78, s (4B); 6,08, d DK 167815 Bl 4 (X3); 7,70, s (6B); 6,44-8,52 (aromatiske og peptidiske NH'er), og d står for dublet, m for multiplet og s for singlet.

5 D) en retentionstid (R ) på 1,18 i forhold til antibiotikum L 17054 (TA3-1) (R^ = 8,78 min) ved analyse med reversf ase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultraspere" ODS (5 pm) "Altex" ® (Beckman), 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 10 for-kolonne: Brownlee Labs. RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH3CN 10%h reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70%n reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%-* til pH 6,0 15 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,6 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: antibiotikum L 17054 (TA3-1) (Gruppo 20 Lepetit S.p.A.) E) en R^-værdi på 0,39 i følgende kromatografiske system: 1M NaCl indeholdende 5 g/1 NaH2P04.H20 70 25 acetonitril 30 reguleret til pH 6,0 og under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F254 Merck plader (lagtykkelse 0,25 mm) Synliggørelse: ultraviolet lys , 30 gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 20^, 171 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)), bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium, F) et hurtigt atombombardement (FAB) massespektrum med M + H'-'på ca. 1374 , 35 DK 167815 B1 5 og som forsøgsvis er tilskrevet formlen

o« H

5 % o x3 o X·» lii»I . 1-¾ i ^ CH;3 ~\ 6 8v *v;

~o. N-H

io ^c-UHX7 ΠΊ] Jjnf fijj 0 \_/ 0H \ o w\-OB oh hvor B betegner mannosyl.

På basis af de fysisk-kemiske egenskaber under 15 hensyn til strukturen af kendte antibiotiske stoffer hørende til samme stofgruppe, kan den foran viste formel I, hvor A betegner hydrogen og B betegner mannosyl, tilskrives antibiotikum:·^ A 40926 mannosylaglycon.

I nærværende beskrivelse med tilhørende krav sig-20 tes der med betegnelsen "antibiotikum A 40926 mannosylaglycon" også til den "interne salt"-form såvel som til de mulige syre- og baseadditionssalte.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig derved at man hydrolyserer antibiotikum A 40926 kompleks 25 eller en faktor deraf under kontrollerede sure betingelser, ved hjælp af en koncentreret vandig opløsning af en mineralsk eller organisk stærk syre og eventuelt i nærværelse af et aprotisk organisk opløsningsmiddel.

Foretrukne eksempler på stærke mineralske syrer er 30 svovlsyre og fosforsyre.

En foretrukken stærk organisk syre er trifluor-eddikesyre.

Foretrukne aprotiske organiske opløsningsmidler til formålet er alicykliske eller cykliske alkylætere så-35 som dioxan og tetrahydrofuran, lavere alkylsulfoxider såsom dimetylsulfoxid og lavere alkylamider såsom dimetyl-formamid.

DK Tb/»ΊΟ ti i 6

Reaktionstemperaturen holdtes i almindelighed mellem 0°C og reaktionsblandingens tilbagesvalingstemperatur. I mange tilfælde er den mellem 15°C og 75°C, et fore-trukkent temperaturområde er mellem 20-55°C og i særlig grad 5 foretrækkes det at bruge stuetemperatur.

Reaktionstiden varierer i afhængighed af de særlige reaktionsparametere, og eftersom reaktionsforløb kan følges ved TLC- eller HPLC-teknikker vil den på området sagkyndige være i stand til at overvåge reaktionens for-10 løb og fastslå når reaktionen kan anses for at være fuldført.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er kontrolleret hydrolyse af antibiotikum A 40926 kompleks eller en ren faktor deraf til dan-15 nelse af antibiotikum A 40926 mannosylaglyeon i nærværelse af vandig 80-95%s trifluoreddikesyre ved stuetemperatur.

En anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er kontrolleret hydrolyse af antibiotikum A 40926 mannosylaglyeon i nærværelse af en 20 blanding 2:1 til 1:2 af vandig 1-2N svovlsyre og dioxan.

Rensning af råt antibiotikum A 40926 mannosylagly-con som det udvindes ved slutningen af hydrolysetrinnet kan udføres ved i og for sig kendte teknikker, fx udfældning med tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel, ekstrak-25 tion med opløsningsmidler og kromatografering.

Foretrukne kromatografiske procedurer indbefatter søjlekromatografering og en særlig foretrukken kromatografisk fremgangsmåde er reversfase-søjlekromatografe-ring.

30 En hensigtsmæssig reversfase-væskekromatografe- ringsprocedure anvender fortrinsvis rustfaste stålkolonner under moderat tryk (5-5Q bar) eller ved højt tryk (100-200 bar). Den faste fase kan være en silaniseret silikagel med en kulbrintefase med 2-18 kulstofatomer 35 (især foretrukket C 18) eller fenylgrupper, og eluerings-midlet er en blanding af et polært vandblandbart opløsning og en vandig puffer ved en pH-værdi som er forenelig med harpiksen, fortrinsvis pH 3-8.

DK 167815 Bl 7

Repræsentative eksempler på polære vandblandbare opløsningsmidler er vandopløselige alkoholer (fx metanol, ætanol, isopropanol, n-butanol), acetone, acetonitril, lavere alkylalkanoater (fx ætylacetat), tetrahydrofuran, 5 dioxan og dimetylformamid og blandinger deraf; det foretrukne polære vandblandbare opløsningsmiddel er acetonitril .

De eluerede fraktioner bestemmes med hensyn til antibiotikumindhold ved hjælp af de sædvanlige biobestem-10 melser såsom papirskive- eller agar-diffusionsbestemmelser på følsomme mikroorganismer. Eksempler på følsomme organismer er Bacillus subtilis og S. aureus.

Rensningen såvel som reaktionen overvåges også hensigtsmæssigt ved TLC- eller HPLC-teknikker.

15 En foretrukken HPLC-teknik er en reversfase-HPLC

under anvendelse af en kolonne af porøse og kugleformede paftikler af silaniseret silikagel som er funktionalise-ret med C-18 alkylgrupper med en diameter på fortrinsvis 5 mikrometer (såsom 5 pm "Ultrasphere" ODS "Altex1®; Beck -20 man Co.), en for-kolonne som er en silikagel funktionali-seret med C-18 alkylgrupper (fx RP 18 Brownlee -Labs) og et elueringsmiddel som er en lineær gradientblanding eller et polært vandblandbart opløsningsmiddel såsom et af de ovenfor nævnte, i en vandig pufret opløsning.

25 Fortrinsvis reguleres denne opløsning til pH 5-7.

Et i særlig grad foretrukket elueringsmiddel er en lineær gradient fra 5 til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, hvor elueringsmiddel A er en blanding af aceto-nitril/vandig puffer pH 5-7, 10:90, og elueringsmiddel B 30 er en blanding af acetonitril/vandig puffer pH 5-7, 70:30. San kendt i teknikken kan mange stoffer blive brugt son intern standard. En meget hensigtsmæssig intern standard er i dette tilfælde antibiotikum L 17054, der har en retentiontid nær ved forbindelsen ifølge opfindelsen i dette 35 HPLC-system. Dette standardstof er kendt og er beskrevet i europæisk patentansøgningspublikation nr.· 1 19.575.

DK 1678T5 Bi 8

Den antibakterielle virkning af forbindelsen ifølge opfindelser kan påvises in vitro ved hjælp af standard fortyndingsprøver på forskellige mikroorganismekulturer. Kulturmedier og vækstbetingelser til bestemmelse 5 af MIC (mindst inhiberende koncentration) var som følger: "Isosensitest" suppe ("Oxoid"^), 24 timer, for stafylokokker, Streptococcus faecalis og gramnegative bakterier (Escherichia coli); Todd-Hewitt-suppe ("Difco"®), 24 timer for andre arter streptokokker; GC-basesuppe ("Dif-10 co"®) + 1% "Isovitalex" (BBL), 48 timer, CC^-beriget atmosfære for Neisseria gonorrhoeae; GB-base-agar ("Dif-<6>> co'H + 1% "Isovitalex" + 0,001% hæmin, 24 timer, for

Haemophilus influenzae; AC-suppe ("Difco"®), 24 timer, anaerob atmosfære for Clostridium perfringens; Wilkings-15

Chalgren agar (se T.D. Wilkins & S. Chalgren, 1976, Anti-microb. Ag. Chemother. K*/ 926), 48 timer, anaerob atmosfære for andre anaerobe bakterier (Clotridium difficile, Propionibacterium aenes, Bacteroides fragilis); PPLO-suppe ("Difco"®) +10% hesteserum + 1% glukose, 48 ti-20 mer, for Mycoplasma galliseptieum. Inkubering skete ved 37°C. Inokula var som følger: 1 rumfangs% af en 48 timers suppekultur for Mycoplasma galliseptieum; omkring 104-105 kolonni-dannende enheder/ml for andre suppefor- 4 5 tyndings MIC'er; omkring 10 -10 bakterier/plet (podet 25 med en mangepunkts inokulator) for agar-fortyndings MIC’er (Haemophilus influenzae, Clostridium difficile, Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis) -

De mindste inhiberende koncentrationer (MIC, pg/ml) for nogle mikroorganismer fremgår af nedenstående 30 tabel 1.

DK 167815 B1 9 SSlliia^tJJnotoDicnmmæmm ω uocnrorodroHHrtrtr+r+r+d-rtrt rt rororon-oroooddddrorororo P>

OffSffiOt+ffilOdiUffilDO'flO'i 3 O(ilOtnH'(I)rtrtiOOlCOtJ'5,tri3‘ 3 l-,d,droOdddrtrtrtrt|-<,'<t<;k<; (0

pjp-tri-iDOH-H-OOOOl-'HHM

£ηηι-·Η·Η·Η·α<&οοοοοοοο

B^HPJtroaH-H-oooooooo SUH-C (DfDCCOOOOOOOO

Ρ)ωι£Ωω33ΩΩΩΩΩΩΩΩ iQ Od· 0£££ΩΩΩΩ roroH-droHi£ij,øcncncntndddd MOdOddH-ro ω cn tn tn Η H Hi d H-D) Hi d 3 Μι Ό Ό H. H. !_ihj Cifl hi Hi p· (li d *< (D ro ro P> cn ddJ3t-,-t-,-drtroroCfOddd ro cn ro o η ω η· η· ω c u3 η· i-< d d ►OWDOPJH-d-dcnpJBOC'OOO Γ+^)ΝΡ)ΩωΗϋ3' (- O d (D d d d H· ro (D d (Dfl) h· d ro d cn cn tn

Ω —* (D Ωί> Df^CflH-wS

d to h in i-3 > in M ro h- i-3 i-3 i-3

g -i rt en o h3 η· > (D ΠΩιΟ O O

to h- d d d cn o *ø σι t-3 o cn · ncocnddd m ro oo o to cn now

\ O UO VO LO Η· ifc- > LO

S tj-» -«j σι o cn -j -> t3otd CD to o co un o o Oo\p-i ι-< >σιυουηυο.&·.Ηοο O σι ø- tg —» oo ro o O un d O lo rt -1 ?> -- η- O to ro

Qj to ro -1 >3 id to ro o ro ro vo oo ro σι er λ» d ro _> d· Ω H1 00 3 Hl d h \ 3

H

> d r+ d- er H- o et S H-H * o d - 3 > •0 4=>

V v iQ O

_» \ LO

to to σι co σ 3 to oooo^to—»J^too—»—»—»—»oto—»o Η σι «, ** > —> σι . to 3 uo un ro 3 d

O

en

H

ro

VO

M

·< Ω

O

d 10 UK Ib/B l S b l

Den antimikrobielle aktivitet af forbindelsen i-følge opfindelsen er også bekræftet ved forsøg in vivo, udført i det væsentlige som beskrevet af R. Pallanza et al., J. Antimicrob. Chemother. JJ_, 419 ( 1983).

5 Den eksperimentelle infektion blev induceret i mus ved intraperitoneal indgift af en suspension af Streptococcus pyogenes C 203. Det indpodede var· revideret på en sådan måde at ubehandlede dyr døde af septicemi i løbet af 48 timer. Dyrene behandledes subkutant med test-10 forbindelse ca. 30 minutter efter inficeringen.

ED50-værdien beregnedes på den 10. dag ved den af Spearman og Karber angivne metode (D.J. Finney "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, side 524, 1952) på basis af den procentuelle overlevelse ved hver 15 dosis.

Under ovenfor angivne betingelser var Ed^g for an-tibiogikum A 40926 mannosylaglycon 3,8 mg/kg.

Antibiotikum A 40926 mannosylaglycon har sure basiske funktioner og danner salte ved sædvanlige fremgangs-20 måder.

Repræsentative og hensigtsmæssige syreadditionssalte af forbindelsen ifølge opfindelsen er de salte der dannes ved standardreaktioner med både organiske og uorganiske syrer som fx saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, 25 fosforsyre, eddikesyre, trifluoreddikesyre, triklored- dikesyre, ravsyre, citronsyre, ascorbinsyre, mælkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, cholsyre, pamoesyre, aiucinsyre, glutaminsyre, kamfersyre, glutarsyre, glykol-syre, ftalsyre, vinsyre, laurinsyre, stearinsyre, sali-30 cylsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, picrinsyre, benzoesyre og kanelsyre.

Repræsentative eksempler på disse baser er alkalimetal- og jordalkalimetalhydroxider såsom natrium-, kalium- og kalciumhydroxid, ammoniak og organiske alifa-35 tiske aminer, alicykliske og aromatiske organiske aminer såsom metylamin, dimetylamin, trimetylamin og pikolin.

Omdannelse af de frie amino- eller ikke-saltfor- DK 167815 Bl 11 bindeiser ifølge opfindelsen til de tilsvarende additionssalte og omvendt, dvs. omdannelse af et additionssalt af en forbindelse ifølge opfindelsen til ikke-salt-formen eller den fri aminoform, ligger indenfor sædvan-5 lig tekniks sagkundskab og ligger indenfor opfindelsens rammer.

Fx kan antibiotikum A 40926 mannosylaglycon omdannes til det tilsvarende syre- eller baseadditionssalt ved opløsning af ikke-saltformen i et vandigt opløsnings-10 middel og tilsætte et lille molært overskud af den valgte syre eller base. Den resulterende opløsning eller suspension frysetørres derefter for at udvinde det ønskede salt.

I tilfælde af at det sluttelige salt er uopløse-15 ligt i et opløsningsmiddel i hvilket ikke-saltformen er opløselig, udvindes det ved filtrering fra den organiske opløsning af ikke-saltformen efter tilsætning af en støkiometriske mængde eller et svagt molært overskud af den valgte syre eller base.

20 Ikke-saltformen kan fremstilles ud fra et tilsva rende syre- eller basesalt opløst i et vandigt opløsningsmiddel, der derefter neutraliseres til frigørelse af ikke-saltformen.

Når afsaltning er nødvendig efter neutralisatio-25 nen kan der bruges en almindelig afsaltnings-fremgangs-måde. Fx kan der hensigtsmæssigt bruges søjlekromatogra-fering på silaniseret silikagel, ikke-funktionaliseret polystyren, akryliske harpikser og polydextranharpikser med kontrolleret porestørrelse (fx "Sephadex"^ LH-20) eller 30 aktiveret kul. Efter eluering af de uønskede salte med en vandig opløsning elueres det ønskede produkt ved hjælp af en lineær gradient eller en trinvis gradient af en blanding af vand og et polært eller apolært organisk opløsningsmiddel som fx acetonitril/vand fra 50:50 til 35 ca. 100% acetonitril.

Som det er kendt i teknikken kan saltdannelse med enten farmaceutisk acceptable syrer (baser) eller DK 167815 B1 12 farmaceutisk uacceptable syrer (baser) bruges som en hensigtsmæssig rensningsteknik. Efter dannelse og isolering kan saltformen af et A 40926-antibiotikum omdannes til et tilsvarende ikke-salt eller til et farmaceutisk accep-5 tahelt salt.

I nogle tilfælde er baseadditionssaltet af antibiotikum A 40926 mannosylaglycon mere opløseligt i vand og hydrofile opløsningsmidler.

Antibiotikum A 40926 mannosylaglycon er virksomt 10 mod grampositive bakterier som er ansvarlige for mange vidt forskellige infektionssygdomme. På grund af den stigende resistens af disse patogener mod de sædvanlige terapeutiske blandinger er behovet for nye antibiotiske stoffer stadig stor.

15 Den foreliggende opfindelse angår derfor også anvendelsen af antibiotikum A 40926 mannosylaglycon til fremstilling af et medikament til antimikrobiel anvendelse, samt et farmaceutisk præparat indeholdende denne forbindelse i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

20 I almindelighed kan til antibakteriel behandling med antibiotikum A 40926 mannosylaglycon såvel som de ugiftige, farmaceutisk acceptable salte deraf eller blandinger deraf indgives ad forskellige veje og bruges fx topisk (lokalt) eller parenteralt. Den parenterale ind-25 gift er i almindelighed den foretrukne indgiftsvej.

Præparater til injektion kan have sådanne former som suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olie-agtige eller vandige bærestoffer og de kan indeholde ad-juvanser såsom suspenderingsmidler, stabiliseringsmid-30 ler og/eller dispergeringsmidler.

Den virksomme bestanddel kan også være i pulverform til rekonstitution lige før anvendelsestidspunktet, hvorved der sættes en passende bærevæske som fx sterilt vand dertil.

35 I afhængighed af indgiftsvejen kan disse forbindel ser oparbejdes i forskellige dosisformer.

I nogle tilfælde kan det være muligt at oparbejde forbindelserne ifølge opfindelsen i tarmovertrukne dosisformer til oral indgift, der kan fremstilles som kendt i DK 167815 B1 13 farmacien (se fx "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. udgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennesylva-nia, USA, side 1614).

Dette kunne navnlig være tilfældet når absorption 5’af det antimikrobielle stof særlig ønskes i tarmkanalen, mens stoffet passerer uændret gennem maven.

Den mængde virksomt stof der kan indgives afhænger af forskellige faktorer såsom størrelsen og tilstanden af det individ der skal behandles, indgiftsvejen og 10 indgiftens hyppighed,samt det der bevirker den tilstand som skal behandles.

Det antibiotiske stof ifølge opfindelsen, nemlig antibiotikum A 40926 mannosylaglycon og fysiologisk acceptable salte deraf, er i almindelighed effektivt ved en 15 dagsdosis på mellem ca. 0,5 og 50 mg virksomt stof pr. kg af patientens legemsvægt, eventuelt opdelt i 1-4 deldoser om dagen.

Særlig hensigtmæssige præparater er sådanne der er oparbejdet i dosisenhedsform indeholdende fra ca.

20 100 til ca. 5.000 mg pr. enhed.

Præparater med langvarig frigivelse af det virksomme stof kan fremstilles ved forskellige mekanismer og metoder som det er kendt i farmacien.

En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af 25 et præparat med langtidsvirkning og indeholdende antibiotikum A 40926 mannosylaglycon indebærer anvendelse af en vanduopløselig form af dette antibiotikum, suspenderet i et vandigt eller olieagtigt medium. 1 2 3 4 5 6

Fremstilling af farmaceutiske præparater 2

En dosisenhedsform til intramuskulær injektion 3 fremstilles med 5 ml steril suspension USP indeholdende 4 8% propylenglykol og 1.000 mg antibiotikum A 40926 man 5 nosylaglycon .

6

En dosisenhedsform til intramuskulær injektion fremstilles med 5 ml sterilt vand USP indeholdende 500 mg antibiotikum A 40926 mannosylaglycon.

En dosisenhedsform til intramuskulær injektion DK 167815 B1 14 fremstilles med 2.000 mg antibiotikum A 409*26 mannosyl-aglyconnatriumsalt suspenderet i 5 ml sterilt vand til injektion.

Det antibiotiske stof ifølge opfindelsen er nyt-5 tig til at undertrykke væksten af Clostridium difficile, der fremkalder pseudomembranøs colitis i tarmen. Det antibiotiske stof kan bruges til behandling af pseudomembranøs colitis ved oral indgift af en effektiv dosis af dette antibiotikum eller et farmaceutisk acceptabelt 10 salt deraf, tilberedt i en farmaceutisk acceptabel dosisform.

Til en sådan anvendelse kan antibiotikaet indgives i gelatinekapsler eller i suspension i en væske.

Foruden dens aktivitet som medikamenter kan anti-15 biotikum A 40926 mannosylaglycon og farmaceutisk acceptable salte deraf bruges til fremme af dyrs vækst.

Til dette formål indgives en forbindelse ifølge opfindelsen oralt i et passende foder. Den præcise koncentration som anvendes er den der behøves for at sikre at 20 det virksomme stof indtages i en til vækstfremme effektiv mængde når der fortæres normale mængder foder.

Tilsætning af den virksomme forbindelse ifølge opfindelsen til dyrefoder udføres fortrinsvis ved at man tilbereder en passende foder-forblanding indeholdende 25 den virksomme forbindelse i en effektiv mængde og inkorporerer forblandingen i den fuldstændige ration.

Det er også muligt at indblande et som mellemprodukt fremstillet koncentrat eller fodersupplement indeholdende det virksomme stof i foderet.

30 Den måde på hvilke sådanne foder-forblandinger og fuldstændige rationer kan fremstilles og indgives er beskrevet i referencebøger såsom "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman og Co., San Francisco, USA, 1969, eller "Livestock Feeds and Feeding", 0 and B books, Cor-35 vallis, Oregon, USA, 1977; der henvises til disse værker.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen og må ikke udlægges som begrænsende dens omfang.

DK 167815 B1 15

Eksempel 1 a) En prøve på 214 mg af antibiotikum A 40926 kompleks AB (se omstående udgangsmateriale 3) opløses i 30 ml blanding trifluoreddikesyre/vand 9:1 (rumfang). Efter 5 48 timer ved stuetemperatur inddampes blandingen under vakuum ved stuetemperatur til 1/10 af det oprindelige rumfang, skylles med 30 ml vand og ekstraheres derefter to gange med ætylacetat. Den vandige fase indeholdt i hovedsagen A 40926 mannosylaglycon og trifluoreddikesyre.

10 b) Denne vandige fase neutraliseres med 1N natriumhydroxid og overføres derefter til en kolonne (lejehøjde 5 cm) af silaniseret silikagel 60, 70-230 mesh (50 ml;

Merck Co. artikel 7719) i vand. Kolonnen vaskes med destilleret vand og elueredes derefter med acetonitril/ 15 vand 1:1 (rumfang).

Der opsamles fraktioner på 20 ml og de analyseres ved HPLC (eller TLC); de som indeholder antibiotikum A 40926 mannosylaglycon forenes, koncentreres til et lille rumfang ved azeotrop destillation med n-butanol og 20 frysetørres derefter til frembringelse af T24 mg antibiotikum A 40926 mannosylaglycon.

Eksempel 2

Samme fremgangsmåde som i eksempel 1 gentages,

Zd men udgangsmaterialet omsættes med den vandige trifluoreddikesyre i 2 timer ved ca. 65°C i stedet for ved stuetemperatur natten over. Udbytte 110 mg slutprodukt.

Eksempel 3

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde gentages, men med den forskel at der bruges en blanding af 2N vandig svovlsyre og dioxan i forholdet 1:1 i stedet for vandig trifluoreddikesyre. Reaktionstemperaturen er i dette til-fælde ca. 65°C, og omsætningen sker natten over. Der opnås lignende udbytter som i de foregående eksempler.

16

Ulv 10/0 ΙΟ O I

Eksempel 4

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 gentages under anvendelse af

a) antibiotikum A 40926 faktor A 5 b) antibiotikum A 40926 faktor B

som udgangsmaterialer i stedet for antibiotikum A 40926 kompleks. Der opnås lignende udbytter som i de foregående eksempler.

10 Eksempel 5

Antibiotikum A 40926 mannosylaglycon, vundet som beskrevet i fremgangsmåde 1a, renses yderligere på følgende måde: ^ den vandige fase neutraliseres med 1N vandigt na triumhydroxid og koncentreres derefter til ca. 18 ml under vakuum.

Den vundne opløsning overføres i to på hinanden følgende kromatografisk forløb til en søjle af rustfast stål (ired en diameter på 2 cm) pakket med 20 g 10 mikron RP 18 silikagel ("Lichrosorb"~ RP 18, Merck Co., artikel 9334) ækvilibreret med et opløsningsmiddel bestående af acetonitril/18 mM natriumfosfatpuffer pH 6,0 17:83 (rumfang) .

2^ Kolonnen er en del af en ”Chromatospac Modulprep" enhed (Joben Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160, Longjan-neau, Frankrig). Kolonnen elueres med acetonitril/18 mM natriumfosfatpuffer pH 6,0 17:83 (rumfang). De eluerede fraktioner overvåges ved 275 nm under anvendelse af et 2q "Uvicord" S UV apparat (LKB Co.) og analyseres ved HPLC og TLC.

De fraktioner fra de to kromatografiske gennemløb som indeholder antibiotikum A 40926 mannosylaglycon forenes og koncentreres under vakuum for at fjerne det or-ganiske opløsningsmiddel. Den resulterende vandige opløsning kromatograferes derefter og oparbejdes som beskrevet i eksempel 1b; der vindes 66 mg A 40926 mannosylagly- DK 167815 B1 17 con lyofilisat.

Fremstilling af udgangsmaterialer Udgangsmateriale^ 5 Gæring af Actinomadura sp. ATCC 39727

En kultur af en antibiotikum A 40926-producerende stamme (Actinomadura sp. ATCC 39727) dyrkes på en skråkultur af havremelsagar i 2-3 uger ved 28°C og bruges til podning af en 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe indeholdende 10 100 ml medium sammensat af 0,5% kødekstrakt, 0,5% autolyse- ret gær, 0,5% pepton, 0,3% kaseinhydrolysat, 2% glukose, 0,15% NaCl (pH 7,5 før sterilisation).

Kolben inkuberes ved 28°C på en roterende ryster ved 200 opm i ca. 72 timer hvorpå kulturen overføres til 15 en gæringsbeholder indeholdende 4 liter af ovennævnte medium. Denne kultur dyrkes ved 28°C i ca. 72 timer med en luftning på ca. to liter pr. minut og omrøring ved ca. 900 opm. Derefter bruges denne kultur til at pode en 200 liter stor gæringsbeholder med samme medium. Denne 20 gæringsbeholder luftes med 100 liter steril luft pr. minut og omrøres ved 250 opm ved ca. 28°C. Antibiotikumproduktionen overvåges ved papirskive-agardiffusionsmetoden under anvendelse af Bacillus subtilis på et minimalt medium som testorganisme. Den maximale aktivitet opnås efter 25 72-96 timer.

Udgangsmateriale _2

Udvinding af antibiotikum A 40926 A) Gæringssuppen afkøles til 4°C, bringes til pH 9,5 30 og omrøres. Efter ca. 1 time filtreres den og filtratet reguleres til pH ca. 3,5 med en vandig mine.ralsyre. Blandingen omrøres i 30 minutter ved 4°C og filtreres derefter med filterhjælp ("Hyflo" ^ -FloMa). Det klare filtrat kasseres og filterkagen suspenderes i deioniseret vand, 35 reguleres til pH ca. 8,5, omrøres og filtreres derefter.

Den herved genvundne filterkage underkastes samme proces.

De forenede filtrater indeholder A 40926.

18 B) 2 liter opsvulmet D-Ala-D-Ala-e-aminokaproyl-"Se-pharose" ® -modificeret matrix sættes til den ifølge udgangsmateriale 1 vundne gæringssuppe (efter filtrering deraf og efter at det klare filtrats pH-vaardi er bragt til ca.

5 8,5) eller til de forenede filtrater vundet i henhold til foranstående udgangsmateriale 2 A. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur fraskilles harpiksen ved filtrering og vaskes i rækkefølge med ca. 2 x 10 liter 0,45 mM HC1-TRIS-puffer pH 7,5 (TRIS: 2-amino-2-hydroxymetyl-l,3-pro-10 pandiol) som indeholder 5% v/r NaCl, og derefter med 4 x 20 liter destilleret vand.

Antibiotikum A 40926 elueres fra harpiksen med 2 x 20 liter l%s v/r ammoniakvand. Eluaterne henstår natten over ved stuetmeperatur og koncentreres derefter til 15 et ringe rumfang (ca. 2,5 liter). Vand fjernes ved azeo-trop destillation med n-butanol. Derefter tilsættes der petroleumsæter hvorved der udfældes 3,4 g råt antibiotikum A 40926 kompleks.

20 Udgangsmateriale 3

Rensning af antibiotikum A 40926 kompleks AB

Råt antibiotikum A 40926 kompleks, opnået i det væsentlige ved fremgangsmåden i foranstående udgangsmateriale 2 (750 mg; HPLC-titer 70%) opløses i 400 ml vand, reguleres til pH

7,5 og filtreres. Derefter underkastes filtratet affini-tetskromatografering på en D-Ala-D-Ala-e-aminokaproyl-"Sepharose" ® -kolonne (50 ml opsvulmet harpiks; lejehøjde 5 cm). Kolonnen, ækvilibreret med 0,16% v/r ammoniak 2q indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 7,5 med HCl, fremkaldes med følgende tre pufferopløsninger i rækkefølge: puffer A: 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 7,5 med HCl (2,6 kolonnelejerumfang)? puffer B: 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 9,5 med HCl (16 kolonnelejerumfang); 35 DK 167815 B1 19 puffer C: 1% v/r ammoniakvand pH 11,4 (2,6 kolonneleje-rumfang).

Puffer C eluerer antibiotikum A 40926 kompleks AB 5 i en enkelt fraktion. Denne eluerede fraktion reguleres til pH 7,0 og overføres igen til samme affinitetskolonne pufret med 10 mM TRIS-HC1 pH 7,0. Kolonnen vaskes med destilleret indtil afsaltningen er fuldstændig. Antibioti-ket elueres derefter med 2 kolonnelejerumfang 0,39%s v/r 10 ammoniakvand pH 11,0.

De eluerede fraktioner koncentreres til en lille vandig blanding og frysetørres derefter. Der vindes 374 mg rent antibiotikum A 40926 kompleks AB.

1 5 Udgangsmateriale 4

Isolering af antibiotikum A 40926 faktor A og B

A) 3,3 g antibiotikum A 40926 kompleks vundet i henhold til eksempel 2, eller 2,3 g antibiotikum A 40926 kompleks AB vundet i henhold til eksempel 3, suspenderes i 0,5 ml vand, omrøres og filtreres derefter. Det klare filtrat overføres til en silaniseret silikagelkolonne (200 g; lejehøjde 18 cm; silaniseret silikagel 60; 70-230 mesh, Merck Inc.), for-ækvilibreret med opløsning A (0,001M vandig natrium-EDTA indeholdende 0,25% v/r 25

Na^PO^.^O og 2,5% v/r NaCl reguleret til pH 6,0 med NaOH). Kolonnen elueres med en lineær gradient fra 0% til 40% (rumfang) acetonitril i opløsning A med et samlet rumfang på ca. 7 liter i løbet af ca. 48 timer. Der opsamles fraktioner på ca. 15,5 ml og de prøves ved bio-30 bestemmelse på Bacillus subtilis og analyseres ved HPLC. Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes. Fraktionerne nr. 310-330 og nr. 348-365 indeholdt de antibiotiske stoffer der er betegnet henholdsvis A 40926 faktor A og A 40926 faktor B.

35 B) De forenede fraktioner indeholdende de enkelte fraktioner A 40926 faktor A og faktor B koncentreres DK bl 20 under nedsat tryk for at fjerne acetonitril, fortyndes med vand (ca. det dobbelte rumfang af de oprindelige opløsninger) og overføres til en silaniseret silikagelkolon-ne af den ovenfor beskrevne type (rumfang af den opsvul-5 mede matrix: 50 ml; lejehøjde 15 cm). Kolonnen vaskes med deioniseret vand indtil afsaltningen er fuldstændig og fremkaldes til sidst med acetonitril/vand 60:40 (rumfang).

De eluerede fraktioner koncentreres under nedsat tryk og remanenserne frysetørres til udvinding af 134 10 mg antibiotikum A 40926 fra den første gruppe eluerede fraktioner (ovennævnte fraktioner 310-330) og 206 mg A 40926 faktor B fra den anden gruppe eluerede fraktioner (ovennævnte fraktioner 348-365).

15 udgangsmateriale 5

Isolering af antibiotikum A 40926 faktor PA Og faktor PB Ved i det væsentlige at gå frem som beskrevet i udgangsmateriale 2 A og det første trin i eksempel 2 B elueres 2Q det til harpiksen koblede antibiotikum med '2 x 20 liter l%s v/r ammoniakvand. Eluaterne reguleres til pH 7,8 med svovlsyre og koncentreres til et lille rumfang under vakuum ved azeotrop destillation med n-butanol for at vinde et vandigt koncentrat som derefter filtreres på papir.

25 Det udvundne filtrat indeholder antibiotikum A 40926 faktor PA, A 40926 faktor PB og mindre mængder A 40926 faktor A og faktor B (HPLC). En prøve på 10 ml af dette vandige koncentrat indeholdende ca. 50 mg/ml rent antibiotikum A 40926 kompleks (HPLC-analyse) filtreres på et fil-2Q ter med en porestørrelse på 5 p ("Acrodisc"; Gelman Science Inc.) og overføres derefter til en kolonne af rustfrit stål (diameter 2 cm) indeholdende 20 g oktadecyl-silyl-reversfase-silikagel ("Lichrosorb" ® RP 18, Merck Inc; partikelstørrelse 10 μπι). Silikagelen pakkes derefter under moderat tryk (et nominelt tryk på ca.' 14 bar) i en kolonne af rustfrit stål hørende til et "Chromatospac Modulprep" apparat (Yoben Yvon, Frankrig) og ækvilibreres med en blanding bestående af acetonitril og 18 mM natrium- DK 167815 B1 21 fosfatpuffer pH 6,0, 25:75 (rumfang). Elueringen udføres med samme opløsningsmiddelblanding som brugtes til ækvili-breringen og med en strømningshastighed på ca. 10,5 ml/min. Eluatet overvåges ved biobestmemelse på Bacillus subtilis 5 og ved HPLC. De fraktioner som har ensartet antibiotikumindhold forenes og de homogene fraktioner af 5 kromatografiske gennemløb koncentreres for at afdampe det organiske opløsningsmiddel.

Den resulterende opløsning fortyndes med vandigt 1 o 1M natriumklorid til det dobbelte af det oprindelige rumfang og overføres til en silaniseret silikagelkolonne (50 g; lejehøjde 5 cm; silaniseret silikagel 60, Merck Inc.) ækvilibreret med vand.

Kolonnen vaskes med deioniseret vand indtil afsalt-15 ningen er fuldstændig (ingen udfældning af AgCl i eluater-ne efter tilsætning af vandigt AgNO^) og elueres derefter med acetonitril/vand 1:1 (rumfang). De eluater som har ensartet antibiotikumindhold (HPLC-analyse) forenes, koncentreres til et lille rumfang ved azeotrop destillation 20 med n-butanol til opnåelse af en vandig fase som derefter frysetørres. Udbytter: antibiotikum A 40926 faktor PA: 55 mg antibiotikum A 40926 faktor PB: 51 mg antibiotikum A 40926 faktor A : 38 mg 25 antibiotikum A 40926 faktor Bq: 33 mg

Udgangsmateriale 6

Omdannelse af antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum 40926 faktor PB til antibiotikum A 40926 henholds- 30 vis faktor A og faktor B_

Antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB (50 mg) opløses hver for sig i 2,5 ml vandigt l%s v/r NH^OH og de resulterende opløsninger opbevares i ca. 24 timer ved stuetemperatur under omrøring.

35 Antibiotikum A 40926 faktor A vindes fra den opløsning der oprindelig indeholdt antibiotikum A 40926 faktor PA, DK 167815 B l 22 og antibiotikum A 40926 faktor B vindes fra den opløsning der oprindelig indeholdt antibiotikum A 40926 faktor PB ved fjernelse af vand ved azeotrop destillation med n-butanol, udfældning med ætylæter og opsamling af bundfal-5 det ved filtrering (udbytte ca. 75%).

Fremstilling af D-Ala-D-Ala-"Sepharose" ® 1 g aktiveret CH-"Sepharose" ® 4B (Pharmacia Fine Chemicals) kvældes i 15 minutter i 1 mM iskold saltsyre 10 og vaskes med samme opløsning. Den vundne gel, ca. 3 ml, blandes med en opløsning af 30 mg D-alanyl-D-alanin i 0,5M natriumklorid og 0,1M natriumbikarbonatpuffer ved pH 8. Blandingen underkastes rotation og endevending i 1 time ved stuetemperatur.

15 Efter at koblingsreaktionen er fuldført bortvaskes overskud af ligand med pufferen. De ubundne aktiverede grupper af dextranbærerén blokeres ved behandling deraf med 1M ætanolamin-hydroklorid ved pH 9 i 1 time.

Derefter udvindes den "Sephadex" ε-aminokaproyl-20 D-alanyl-D-alanin-modificerede matrix ved filtrering og vaskes grundigt skiftevis med 0,5M natriumklorid og 0,1M natriumacetat pH 4, og med 0,5M natriumklorid og 0,1M tris-(hydroxymetyl)-aminometanpuffer pH 8 (fire gange).

25 30 35

Claims

23 DK 167815 B1

1. Antibiotikum A 40926 mannosylaglycon og farmaceutisk acceptable additionssalte deraf, kendetegnet ved det i ikke-additionssaltformen har følgende egenskaber:

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse som angivet i krav 1, kendetegnet ved at man hydrolyserer antibiotikum Δ 40926 kompleks eller 20 en faktor deraf under kontrollerede sure betingelser, ved hjælp af en koncentreret vandig opløsning af en mineralsk eller organisk stærk syre og eventuelt i nærværelse af et aprotisk organisk opløsningsmiddel.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 25 ved at man som syre anvender svovlsyre, fosforsyre eller trifluoreddikesyre.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at man son aprotiske organiske opløsningsmidler anvender ali-cykliske eller cykliske alkylætere, lavere alkylsulfoxi- 30 der eller lavere alkylamider, fortrinsvis dioxan, tetra-hydrofuran, dimetylsulfoxid eller dimetylformamid.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at man holder reaktionstemperaturen mellem 0°C og tilbagesvalingstemperaturen, fortrinsvis mellem 15°C og 35 75°C.

5 A) et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: Amax, nm a) 0,1N HC1 280 b) fosfatpuffer pH 7,38 280 10 300 (skulder) c) 0,1N kaliumhydroxid 298 d) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder)

15 B) et infrarødt absorptionsspektrum·! som udviser følgende absorptionsmaxima: 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620-1540; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1350-1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810 cm"1

20 C) H-NMR-spektrum som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz optaget i DMS0-dg (hexadeu-terodimetylsulfoxid) plus CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,000 ppm), 5 = ppm: 2,51, s (DMS0d5); 2,50, s (NCH-j); 2,88, m (Z2); 3,30, m 25 (Z12) ; 4,08, m (X6); 4,44, d (X5); 4,49, d (X7); 4,83, m (X2); 5,02, s (4F); 5,08, s (Z6); 5,31, s (anomeriske proton af mannose); 5,53, d (X4); 5,78, s (4B); 6,08, d (X3); 7,70, s (6B); 6,44-8,52 (aromatiske og peptidiske NH'er) 30 D) en retentionstid (R^J på 1,18 i forhold til anti biotikum L 17054 (TA3-1) (R^ = 8,78 min.) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: 35 DK IG/Slb bl 24 kolonne: "Oltraspere" ODS (5 pm) "Altex"® (Beckman), 4,6 mm (indvendig diameter) x 250mm forkolonne: Brownlee Labs. Rp 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH3CN 10IOreguleret 5 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%-* til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70%nreguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%Jtil pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter 10 strømningshastighed: 1,6 ml/min. UV-detektor: 254 nm intern standard: antibiotikum L 17054 (TA3^1) (Gruppo Lepetit S.p.A.)

15 E) en R^-værdi på 0,39 i følgende kromatografiske system: 1M NaCl indeholdende 5 g/1 NaH2P04.H20 70 acetonitril 30 reguleret til pH 6,0 under anvendelse af silaniseret 20 silikagel 60 ^54 Merck Plader (lagtykkelse 0,25 mm) synliggørelse: - ultraviolet lys - gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil- 25 syre (J. Chromatog. 2£, 171 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)). - bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis-medium

30 F) et hurtigt atombombardement (FAB) massespektrum med M + på ca. 1374, og son forsøgsvis er tilskrevet formlen DK 167815 B1 25 Ο« h 5 ' Η0ψΗιώ° ^^hz3 bf J . 1¾ ί + o^r ^ ττΛγίκVVCH3 \ 4 2 Χ6 I 10 '<V rH r*S C1V^N 1 >_Lhx7 Dl u\ rv|

0 V_/6h wVoB 0H 15 hvor B betegner mannosyl.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at man som stærk syre anvender 85-95%s vandig trifluor- L/lY 10/0 19 Dl 26 eddikesyre og holder reaktionstemperaturen på stuetemperatur .

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at hydrolysen udføres i nærværelse af en blanding af 5 vandig 1-2N svovlsyre og dioxan i mængdeforholdet 2:1 til 1:2.

8. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling af et medikament til antimikrobiel anvendelse.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at det indeholder en forbindelse som angivet i krav 1 i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. 15 20 25 30 35