HU201099B - Process for producing a 40926 antibiotic mannosylaglycon and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents
Process for producing a 40926 antibiotic mannosylaglycon and pharmaceutical compositions comprising same Download PDFInfo
- Publication number
- HU201099B HU201099B HU865503A HU550386A HU201099B HU 201099 B HU201099 B HU 201099B HU 865503 A HU865503 A HU 865503A HU 550386 A HU550386 A HU 550386A HU 201099 B HU201099 B HU 201099B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibiotic
- acid
- factor
- column
- complex
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
- C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/19—Antibiotic
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/27—Cyclic peptide or cyclic protein
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás egy új antibiotikum, az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon előállítására oly módon, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet vagy ennek A, B, PA, PB vagy Bo faktorát savas reakciókörülmények között hidrolizáljuk.
A találmány tárgya továbbá eljárás az új antibiotikumot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.
A szóbanforgó A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon olyan fertőző betegségek kezelésére alkalmas, amelyek az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmusokkal kapcsolatosak.
Az A 40926 antibiotikum komplex és faktorai Gram-pozitív baktériumok és Neisseria-törzse ellen aktív antibiotikumok, amelyeket Actinomadura törzsek termelnek.
Egy, A 40926 antibiotikumot termelő, az Actinomadura genushoz tartozó törzset 1984. június 8-án helyeztünk letétbe az American Type Culture Collection-nál (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok), a Budapesti Szerződés rendelkezései szerint.
Az A 40926 egy komplex antibiotikum, melynek ót komponensét különítették el és PA, PB, A, és Bo faktorként azonosították ezeket.
Az A 40926 antibiotikumot és faktorait, valamint a termelő mikroorganizmusokat és az ezek előállítására irányuló eljárást a 177 882 számú európai - közzétett - szabadalmi bejelentésben írják le.
Az eljárás során az Actinomadura sp. ATCC 39 727 mikroorganizmus törzset vagy ennek egy A 40926 antibiotikumot termelő variánsát vagy mutánsát aerob körülmények között, vizes táptalajban tenyésztik, majd a fermentléböl kinyerik az A 40926 antibiotikum komplexet, melyet kívánt esetben tisztítanak és/vagy valamely ismert módon a komplexből az egyes faktorokat azaz az A, B, PA, PB és Bo faktort elkülönítik.
Értelemszerűen az .A 40926 antibiotikum komplex kifejezésen az őt említett faktor elegyét értjük.
A fizikokémiai adatok alapján ée ismert antibiotikumok szerkezetére való hivatkozással a A 40926 antibiotikum faktoroknak az (1) általános képlet tulajdonítható (a számozás analóg azzal, amelyet J. Williams a JACS 106, 4895-4908, 1984 helyen javasol); e képletben A jelentése -N-(ll-12 szénatomos )-acilamino-glukuronil-csoport és B jelentése mannozil- vagy acetil-mannozil-ceoport,
X1-X7, Ze és Zs jelentése hidrogénatom.
Közelebbről az A 40926 antibiotikum A faktor olyan előbbi képletű vegyület, amelyben A jelentése undekanoil-amino-glukuronil-csoport és B jelentése mannozil-csoport; az A 40926 antibiotikum Bo faktor olyan előbbi képletű vegyület, amelyben A jelentése izododekanoil-amino-glukuronil-csoport és B jelentése mannozil-csoport.
Az A 40926 antibiotikum PA faktor és PB faktor annyiban tér el a megfelelő A és Bo faktortól, hogy a mannóz-egység helyett acetil-mannóz egységet tartalmaz.
Legalábbis bizonyos fermentációs körülmények között az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor az A 40926 antibiotikumot termelő mikroorganizmus fő termékei.
Az A 40926 antibiotikum A, illetőleg B faktor fóként az A 40926 antibiotikum PA, illetőleg PB faktor átalakulási terméke és gyakran már a fermentlében jelen van.
Azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítható A 40926 antibiotikum A faktorrá, és az A 40926 antibiotikum PB faktor átalakítható A 40926 antibiotikum B faktorrá, ha bázisos körülményeket alkalmazunk.
Következésképpen ha a fermentlevet, vagy annak egy - az A 40926 antibiotikumot tartalmazó - kivonatát vagy koncentrátumát bizonyos időn át bázisos körülmények között állni hagyjuk (például egy éjjelen át, egy nukleofil bázis vizes oldatában, pH 9 fölött), olyan A 40926 antibiotikum komplexhez jutunk, amely feldúsult az A 40926 antibiotikum A faktor és B faktor tekintetében és amelyet AB komplexnek nevezünk.
Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon a következő tulajdonságokkal jellemezhető
A) az 1. ábra szerinti UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
| lambdauxl | 'nm) | ||||
| a, | 0,1 | n HCl | 280 | ||
| b) | PH | 7,38 foszfát puffer | 280; | 300 | (váll) |
| c) | 0,1 | n káliumhidroxid | 298 | ||
| d) | PH | 9,0 foszfát puffer | 282; | 300 | (váll) |
| B) | a | 2. ábra szerinti IR | abszorpciós | spekt- |
rum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm*1):
3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620-1540; 1505; 1460; (nujol); 1375 (nujol); 1350-1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810
C) a 3. ábra szerinti Hl-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-en DMSO-ds-ban (hexadeutero-dimetil-szulfoxid (CFjCOOH hozzáadásával felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalamazva (delta, ppm; multiplicitás; azonosítás):
2,51, s (DMSOds); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 3,30, m (Z’2); 4,08, m (X6); 4,44, d (X5); 4,49, d (X7); 4,83, m (X2); 5,02, s (4F); 5,08, s (26); 5,31, s (a mannóz anomer protonja); 5,53, d (X4); 5,78, s (4b); 6,08, d (X3); 7,70, s (6b); 6,44-8,52 (aromás és peptid NH-k) d = dublett m - multiplett s = szingulett
HU 201099 Β
D) retenciós idő (Rt) 1,18 az L 17054 antibiotik műhöz (TA3-1) viszonyítva (Rt = 8,78 perc), az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a kővetkező körülmények között végezve:
oszlop: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm
| elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) | ||
| A | eluálószer: | |
| CH3CH | 10% | |
| NaHzPO4.H2O (2,5 g/1) | 90% | |
| pH 6,0-ra beállítva | ||
| B | eluálószer: | |
| CH3CN | 70% | |
| NaHzPO^HzO (2,5 g/1) | 30% |
pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris gradiens (5%-60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,6 ml/perc UV detektor: 254 mm belső standard: L 17054 antibiotikum (TA3-1) (Gruppé Lepetit S. p. A.)
E) Rr érték 0,39 a következő kromatográfiás rendszerben:
g/1 NaH2PO4.H2O-t tartalmazó IM NaCI 70 acetonitril 30 pH 6,0-ra beállítva, szilanizált szilikagél lemezeket - szilikagél 60, F254 Merck lemezek, rétegvastagság 0,25 mm - alkalmazva
Kimutatás:
- UV fény sárgaszín Pauly reagenssel, azaz diazotált szulfanilsavval (J. Chromatog. 20, 171, 1965; Z. Physio). Chem. 292, 99, 1953)
- bioautográfia B. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával minimális Davis táptalajon
F) gyors atombombázásos (FAB) tömegspektrum, amelyben Μ + M* kb. 1374-nél helyezkedik el.
A Davis táptalaj összetétele: 1000 ml vízben 1 g (NH«)zSO«, 3 g KH2PO4, 7 g K2HPO4, 0,5 g Na-citrát, 0,1 g MgSO4, 10,0 g glükóz és 15,0 g agar; pH 7).
A fizikokémiai jellemzők alapján és az ugyanebbe az osztályba sorolható ismert antibiotikumok szerkezetére vonatkoztatva az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikonnak olyan előbbi (I) általános képlet tulajdonítható, amelyben A jelentése hidrogénatom és B jelentése mannozil-csoport.
Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont úgy állítjuk elő, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet, az A faktorban és B faktorban feldúsult A 40926 antibiotikum komplexet azaz az AB komplexet, vagy az A, B, Bo, PA vagy PB faktort vagy ezek keverékeit ellenőrzött reakciókörülmények között savas hidrolízisnek vetjük alá.
Ezeket az ellenőrzött savas körülményeket egy ásványi sav vagy erős szerves sav tömény vizes oldata biztositja, amelyhez előnyösen egy aprotikus szerves oldószert adagolunk. Az ásványi savakra kitüntetett példa a kénsav vagy a foszforsav.
Kitüntetett erős szerves sav a trifluorecetsav.
Kitüntetett aprotikus szerves oldószerek az aliciklusos vagy ciklusos alkil-éterek (pl. a dioxán és a tetrahidrofurán), a rövidszénláncú alkil-szulfoxidok (például a dimetil-szulfoxid) és a róvidszénláncú alkil-amidok (például a dimetil-formamid).
A reakció hőmérsékletét általában 0 °C és a reakcióelegy visszafolyatási hőmérséklete között tartjuk. Számos esetben ez 15 °C és 75 °C között helyezkedik el, míg a kitüntetett hőmérséklet 20 °C és 55 °C között választható meg. Legelőnyösebb a szobahőmérséklet.
A reakcióidő a reakció konkrét paraméterei függvényében változik és mivel a reakció lefolyása TLC vagy HPLC technikával követhető, a szakember képes a reakció előrehaladásának követésére és annak eldöntésére, hogy a reakció befejezettnek tekinthető-e.
A találmány szerinti eljárás egy kitüntetett foganatositási módját képviseli az A 40926 antibiotikum komplex vagy egy tiszta faktora ellenőrzött hidrolízise - az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon előállítására 80-95%-os vizes trifluorecetsav jelenlétében, szobahőmérsékleten.
A találmány szerinti eljárás egy másik kitüntetett foganatositási módját képviseli az A 40926 antibiotikum komplex ellenőrzött hidrolízise, 1-2 n vizes kénsav és dioxán 2:1-1:2 arányú elegye jelenlétében.
A hidrolízis-lépés végén kinyert nyers A 40926 antibiotikus mannozil-aglikon tisztítása önmagukban ismert eljárások szerint végezhető, amilyen pl. a nem-oldószerek hozzáadása, kicsapás céljából, vagy az oldószeres extrakció és a kromatográfía.
A kitüntetett kromatográfiás eljárások közé tartozik az oszlopkromatográfia és a legkisebb kitüntetett kromatográfiás eljárás a fordított fázisú oszlopkromatográfia.
Egy megfelelő fordított fázisú folyadékkromatográfiás eljárás során előnyösen saválló acél oszlopot alkalmazunk mérsékelt nyomáson (5·105-5·106 Pa) vagy nagy nyomáson (107—2-107 Pa). A szilárd fázis lehet egy szilanizált szilikagél, 2-18 szénatomos (legelőnyösebben 18 szénatomos) szénhidrogén-fázissal vagy fenilcsoporttal, az eluálószer pedig egy poláris, vízzel elegyedő oldószer és a gyantával összeférhető pH-jú (előnyösen pH 3-8) vizes puffer elegye.
HU 201099 Β
Jellegzetes példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre: vízoldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, alkánkarbonsavak rövidszénláncú alkil-észterei (pl. az etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid és ezek elegyei. A leginkább kitüntetett poláris, vízzel elegyedd oldószer az acetonitril.
Az eluált frakciók antibiotikum-tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok segítségével határozzuk meg, amilyen pl. a papirkorongos vagy az agardiffúziós meghatározás, érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával. Az érzékeny organizmusokra példa a Bacilus subtilis és a S. aureus.
A tisztítást, akárcsak a reakciót, ugyancsak előnyösen TLC vagy HPLC technikával követhetjük.
Kitüntetett HPLC technika az olyan fordított fázisú HPLC eljárás, amelynek keretében 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált szilanizált szilikagélből előállított, előnyösen 5 mikrométer átmérőjű porózus, gömb alakú részecskékkel töltött oszlopot alkalmazunk (ilyen pl. az 5 pm-es UltrasphereB ODS Altex, Beckman Co. töltetű oszlop). Az eló-oszlop 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált szilikagél töltetet tartalmaz (amilyen pl. az RP 18, Brownlee Labs); eluálószerként pedig egy poláris, vízzel elegyedő oldószer (pl. az előbbiekben leírtak közül) lineáris gradiens elegyét alkalmazzuk egy vizes pufferoldattal.
Ezt az oldatot előnyösen pH 5-7-re állítjuk be. A leginkább kitüntetett oldószer a B eluálószer 5-60%-os lineáris gradiense A eluálószerben, ahol az A eluálószer acetonitril és egy pH 5-7 vizes puffer 10:90 elegye és a B eluálószer acetonitril és egy pH 5-7 vizes puffer 70:30 arányú elegye.
Mint ez a szakember számára ismert, belső standardként számos anyag alkalmazható. Ebben az esetben nagyon előnyös az L 17054 antibiotikum, amelynek retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben közel áll a találmány szerinti vegyületekéihez. Ez a standard anyag ismert; a 0 119 575 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés Írja le.
A találmány szerinti vegyületek antibakteriális aktivitása in vitro a szokásos higitási tesztek segítségével mutatható ki, különböző mikroorganizmus tenyészetek alkalmazásával.
A MIC (minimális gátló koncentráció) értékek meghatározásához a következő táptalajokat és tenyésztési körülményeket használtuk fel: Isosensitest leves (Oxoid), 24 óra, a staphylococcusok esetében, valamint a Strep. faecalis és a Gram-negatív baktériumok (Escherichia coli) esetében; Tedd-Hewitt leves (Difco), 24 óra a többi streptococcus-féleség esetében; GC alapleves (Difeo) + 1% Isovitalex (BBL), 48 óra, C02-ban dúsított atmoszféra a Neisseria gonorrhoeae esetében; GB alap-agar (Difco) + 1% Isovitalex + 0,001% hemin, 24 óra a Haemephilus influenzáé esetében; AC leves (Difco), 24 óra, anaerób atmoszféra a Clostridium perfringens esetében; Wilkins-Chalgren agar (T. D. Wilkins, S. Chalgren, 1976, Antimierob. Ag. Chemother. 10, 926), 48 óra, anaerob atmoszféra a többi anaerób (C. diffieile, Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis) esetében; PPLO leves (Difco) + 10% lószérum + 1% glukóz, 48 óra a Mycoplasma galiseptieum esetében. Az inkubálást 37 °C-on végezzük. Az inokulumok a következők: 1 térf./térf.% 48 órás leves-tenyészet a M. galiseptieum esetében; kb. 10+-105 telepképző egység/ml a többi leveB-higitásos MIC meghatározás esetében; kb. 10*-105 baktérium/ /folt (tőbbpontos inokulátorral inokulálva) az agar-higitásos MIC meghatározások esetében (H. influenzáé, C. diffieile, P. acnes, B. fragilis).
A következő 1. táblázatban mutatjuk be a különböző mikroorganizmusokra vonatkozó minimális gátló koncentrációkat (MIC, pg/ml).
I. táblázat
| Törzs | A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon, MIC (pg/ml) |
| Staph. aureus Teur | 0.25 |
| Staph. aureus Teur (L165) 10® telepképzó egység/ml | 1 |
| Staph. aureus Teur 30% szarvasmarha szérum | 2 |
| Staph. epidermidis ATCC 12228 | 0.5 |
| Strep. pyogenes C203 | 1 |
| Strep. pneumoniae UC41 | 1 |
| Strep. faecalis ATCC 7080 | 1 |
| Strept. mitis klinikai izolátum | 1 |
| Clostridium perfringens ISS30543 | 0.13 |
| Clostridium diffieile ATCC 9689 | 2 |
| Bacteroides fragilis ATCC 23745 | 64 |
| Propionibacterium aenes ATCC 6919 | 1 |
| Neisseria gonorrhoeae ISM68/126 | 32 |
| Haemophilus influenzáé b típus ATCC 19418 | 64 |
| Escherichia coli SKF 12140 | 128 felett |
| Mycoplasma galliseptieum S6 Weybridge | 128 felett |
A találmány szerinti vegyületek antimikrobiális aktivitását in vitro kísérletekkel is megerősítettük, amelyeket lényegében a R. Pallanza et al. által leírt módon [J. Antimierob. Chemother. 11, 419 (1983)] végeztünk.
HU 201099 Β
A kísérleti fertőzést egérben úgy idéztük elő, hogy intraperitoneálisan S. pyogenes C 203 szuszpenziót vittünk be. Az inokulumokat úgy állítottuk be, hogy a nem kezelt állatok 48 órán belül elpusztuljanak a vérmérgezésben. Az állatokat kb. 30 perccel a fertőzést követően szubkután kezeltük a vizsgálandó vegyülettel.
Az EDso értéket a 10. napon számítottuk ki Spearman és Karber módszerével [D. J. Finney, Statistical Methods in Biological Assay, Griffin, p. 524 (1952)], az egyes dózisokhoz tartozó túlélők százalékos mennyisége alapján.
Az előbbi körülmények között az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon EDso értékét 3,8 mg/kg-mal találtuk egyenlőnek.
Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon savas és bázisos csoportokat tartalmaz és a szokásos eljárások alkalmazása esetén sókat képezhet.
Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon például oly módon alakítható át a megfelelő sav- vagy bázis-addíciós sóvá, hogy a nem-só alakot vizes oldószerben oldjuk és kis moláris feleslegben az oldathoz hozzáadjuk a kiválasztott savat vagy bázist. A kapott oldatot vagy szuszpenziót ezután liofilizáljuk, a kívánt só kinyerésére.
Abban az esetben, ha a végtermék só oldhatatlan egy oldószerben, amelyben a nem-só alak oldható, úgy nyerjük ki, hogy a kiválasztott sav vagy bázis sztochiometrikus mennyiségben vagy kis moláris feleslegben való hozzáadása után a nem-só alakot kiszűrjük a szerves oldatból. A nem-só alak úgy állítható elő, hogy a megfelelő sav- vagy bázis-sót vizes oldószerben oldjuk, majd az oldatot semlegesítjük a nem-só alak felszabadítására.
Ha a semlegesítést követően kisózás válik szükségessé, egy szokásos kisózási eljárás alkalmazható. Előnyösen alkalmazhatjuk pl. az oszlopkromatográfiát szilanizált szilikagél, funkcionálisan át nem alakított polistirol, akril- és ellenőrzött pórusméretü polidextrán gyanták (ilyen például a Sephadex LH 20) vagy aktív szén felhasználásával. A nem-kívánt sók vizes oldattal való eluálása után a keresett terméket lineáris gradiens vagy lépcsős grádiens segítségével eluáljuk, amelyet víz és egy poláris vagy apoláris oldószer keveréke segítségével - ilyen pl. az 50:50 acetonitril:viz elegy - kb. 100% acetonitril - alakítunk ki.
Mint ez a szakember számára ismert, a sóképzés - akár gyógyászati szempontból elfogadható savakkal (bázisokkal), akár gyógyászati szempontból el nem fogadható savakkal (bázisokkal) - előnyös tisztítási technikaként alkalmazható. Egy A 40926 antibiotikum só alakja (miután előállítottuk és elkülönítettük) átalakítható a megfelelő nem-só alakká vagy egy gyógyászati szempontból elfogadható sóvá.
Egyes esetekben az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon bázis-addiciós sója oldhatóbb vízben és hidrofil oldószerekben.
Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon aktiv Gram-pozitív baktériumokkal ezemben, amelyek számos, széles körben elterjedt fertőzésért felelősek. Mivel ezeknek a patogéneknek a rezisztenciája a szokásos terápiás kezeléssel szemben növekszik, még mindig nagy szükség van új antibiotikumokra.
Az antibakteriális kezelés esetében általában az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon, valamint nem-toxikus, gyógyászati szempontból elfogadható sói vagy ezek keverékei különböző úton, pl. helyileg vagy parenterálisan vihetők be. Általában az adagolás kitüntetett módja a parenterális bevitel.
Az injekciós készítmények szuszpenzió, oldat, vagy emulzió alakúak lehetnek, olajos vagy vizes hordozókkal, és hatásfokozó szereket - így szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergáló anyagokat - tartalmazhatnak.
Egy másik megoldás szerint az aktiv komponens por alakú lehet és az oldat az alkalmazás időpontjában állítható eló, amikor a porhoz megfelelő vivőanyagot, például steril vizet adagolunk.
A beviteli mód függvényében ezek a vegyületek különböző adagolási formákban készíthetők ki.
Egyes esetekben a találmány szerinti vegyületek orális adagolás céljából bélben oldódó bevonattal ellátotti alakban készíthetők ki, a szakember számára ismert módon (1. például: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok, p. 1614).
Erre különösen abban az esetben lehet szükség, amikor konkréten lényeges, hogy az antimikrobiális anyag a bélszakaszból szívódjék fel, miután változatlanul haladt át a gyomor-szakaszon.
Az aktív anyag beviendő mennyisége különböző tényezőktől függ, amilyen a kezelendő egyén testsúlya és állapota, a bevitel módja és gyakorisága, valamint a szóbanforgó, a betegséget kiváltó tényezó.
A találmány szerinti antibiotikum, nevezetesen az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon és gyógyászati szempontból elfogadható sói általában kb. 0,5-50 mg aktiv komponens/ /kg testsúly napi dózis esetében hatékonyak, amelyet kívánt esetben a nap folyamán 1-4 adagra elosztva viszünk be.
Különösen előnyösek azok a készítmények, amelyeket kb. 100-kb. 5000 mg/egysóg hatóanyag-tartalmú egység-adagolási alakban állítunk elő.
Mint ez a szakember számára ismert, különböző mechanizmusok és eljárások alkalmazásával késleltetett hatású készítmények állíthatók elő.
HU 201099 Β
Egy kitüntetett eljárás egy, az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont tartalmazó készítmény előállítására - amely késleltetett hatású - abból áll, hogy az antibiotikum vizoldhatatlan alakját alkalmazzuk, vizes vagy olajos közegben szuszpendálva.
Gyógyszerkészítmények előállítása
Intramuszkuláris injekció céljára egység-adagolási alakot állítunk elő 5 ml steril USP szuszpenzióval, amely 8% propilénglikolt és 1000 mg A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont tartalmaz.
Intramuszkuláris injekció céljára egység-adagolási alakot állítunk elő 5 ml steril USP vizzel, amely 500 mg A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont tartalmaz.
Intramuszkuláris injekció céljára egység-adagolási alakot állítunk elő oly módon, hogy 2000 mg A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon nátrium sót 5 ml steril pro inj. vízben szuszpendálunk.
A találmány szerinti antibiotikum ezenkívül hasznos a Clostridium diffieile növekedésének elnyomásában, amely a bélben pszeudomembrán kolitiszt okoz. Az antibiotikum felhasználható a pszeudomembrán kolitisz kezelésében; ennek során orálisan az antibiotikumból vagy gyógyászati szempontból elfogadható sójából hatásos adagot viszünk be, gyógyászati szempontból elfogadható adagolási alakban kikészítve. Ilyen alkalmazás esetében az antibiotikum zselatin kapszulában vagy folyékony szuszpenzióban vihető be.
Gyógyszerként mutatott aktivitása mellett az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon és gyógyászati szempontból elfogadható sói felhasználhatók az állati növekedés elősegítésére.
Erre a célra a találmány szerinti vegyületeket orálisan, megfelelő takarmányban visszük be. Az alkalmazott pontos koncentráció azonos azzal, amelyre ahhoz van szükség, hogy normális mennyiségű takarmány elfogyasztása esetén az aktív anyag a növekedést elősegítő hatásos mennyiségben álljon rendelkezésre.
A találmány szerinti aktiv vegyületeknek az állati takarmányhoz való hozzáadása előnyösen ügy történik, hogy megfelelő takarmány premixet állítunk elő, amely az aktiv vegyületet hatásos mennyiségben tartalmazza és a premixet hozzáadjuk a teljes takarmányhoz.
Egy másik megoldás szerint az aktiv komponenst tartalmazó átmeneti koncentrátum vagy takarmányadalék keverhető össze a takarmánnyal.
Kézikönyvek ismertetik azokat az eljárásokat, amelyek segítségével az ilyen takarmány premixek és teljes takarmányok előállíthatok (ilyen pl. a kővetkező: Applied Animál Nutrition, W. H. Freedman and Co., San
Francisco, Amerikai Egyesült Államok, 1969 vagy .Livestock Feeds and Feeding*, 0 and B Books, Corvallis, Oregon, Amerikai Egyesült Államok). Ezeket a könyveket a hivatkozás révén a leírás részévé tesszük.
A következő példák a találmány további szemléltetésére szolgálnak és ilyenekként nem tekinthetők a találmány terjedelmént korlátozó jellegűnek.
1. példa
a) 214 mg A 40926 antibiotikum AB 15 komplexet (lásd a következő 3. műveletet) ml 9:1 (térf./térf.) trifluor-ecetsav: viz elegyben oldunk. 48 órás, szobahőmérsékleten való állás után a keveréket vákuumban szobahőmérsékleten eredeti térfogatának
1/10-ére pároljuk be, átöblitjük 30 ml vizzel, majd kétezer extraháljuk etilacetáttal. A vizes fázis főként az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont és trifluor-ecetsavat tartalmaz.
b) Ezt a vizes fázist In nátrium-hidroxiddal semlegesítjük, majd felvisszük egy oszlopra (töltet-magasság 5 cm), amely 50 ml szilanizált szilikagél 60-at (0,20-0,06 mm szita lyukbőség, Merck Co, art. 7719) tartalmaz, vizben. Az oszlopot desztillált vizzel mossuk, majd 1:1 (térf./térf.) acetonitrihvíz eleggyel eluáljuk.
ml-es frakciókat szedünk és ezeket
HPLC-vel (vagy TLC-vel) vizsgáljuk. Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont tartalmazókat összeöntjük, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be, majd fagyasztva szárítjuk.
124 mg A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont kapunk.
2. példa
Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg, de a kiindulási anyagot 2 órán át kb. 65 °C-on (nem pedig egy éjjelen át szobahőmérsékleten) reagáltatjuk a vizes trifluor50 -ecetsavval. Kitermelés: 110 mg végtermék.
3. példa
Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg, de a vizes trifluor-ecetsav helyett 1:1 2n vizes kénsav és dioxán elegyét alkalmazzuk. A reakció hőmérséklete ebben az esetben kb. 65 °C és a reagáltatást egy éjjelen át végezzük. A kitermelés hasonló az előző példa szerintihez.
-611
HU 201099 Β
4. példa
Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg, kiindulási anyagként A 40926 antibiotikum komplex helyett
a) A 40926 antibiotikum A faktort, illetve
b) A 40926 antibiotikum B faktort, alkalmazva, A kitermelések hasonlóak az előbbi példák szerintiekhez.
5. példa
Az l.a) példa szerint előállított A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont az alábbiak szerint további tisztításnak vetjük alá: a vizes fázist In nátrium-hidroxiddal semlegesítjük, majd vákuumban kb. 18 ml-re töményitjük be.
A kapott oldatot kétszer egymás után kromatográfiás futtatásnak vetjük alá saválló acél oszlopban (átmérő 2 cm), amelyet 20 g 10 mikronos RP 18 szilikagéllel töltöttünk meg (Lichroserb RP18 Merck Co., art. 9334); a töltetet 17:83 (térf./térf.) acetonitril: 18 mmólos pH 6,0 nátrium-foszfát puffer oldószereleggyel egyensúlyozzuk ki.
Az οεζίορ része egy Chromatospac Modulprep egységnek (Joben Yvon, Longjumeau, Franciaország). Az oszlopot 17:83 acetonitril: 18 mmólos pH 6,0 nátrium-foszfát puffer eleggyel eluáljuk. Az eluált frakciókat 275 nm-en vizsgáljuk, UVICORD S UV monitor (LKB Co.) alkalmazásával, és a meghatározást HPLC és TLC technikával végezzük.
Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont tartalmazó, a két kromatográfiás futtatással kapott frakciókat összeöntjük és a szerves oldószer eltávolítására vákuumban betöményítjük. A kapott vizes oldatot ezután kromatografáljuk és feldolgozzuk (az 1. b) példában leírtak szerint); igy 66 mg A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon liofilizátumot kapunk.
A kiindulási anyagok előállítása
1. művelet
Fermentáció az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel
Egy A 40926 antibiotikumot termelő törzs (Aclinomudui'M sp. ATCC 39727) tenyészetét zabliszt ferde agaron 2-3 héten át 28 °C-on tenyésztjük és ezt használjuk fel egy 500 ml-es Erienmeyer lombik beoltására, amely 100 ml, következő összetételű táptalajt tartalmaz:
0,5% húskivonat
0,5% autolizált élesztő
0,5% pepton
0,3% hidrolizált kazein
2% glukóz
0,13% NaCl pH sterilizálás elótt 7,5.
A lombikot 28 °C-on kb. 72 órán át 200 ford./perc sebességű forgó rázógépen inkubáljuk, majd a tenyészetet átvisezük egy fermentorba, amely 4 liter előbbi összetételű táptalajt tartalmaz. Ezt a tenyészetet 28 °C-on kb. 72 órán át tenyésztjük, kb. 2 liter/ /perc sebességű levegó-étfuvatással és kb. 900 ford./perc sebességgel való keveréssel. Egy ilyen lombikot használunk el egy 200 literes, ugyanilyen táptalajt tartalmazó férmentor beoltására. Ezt a fermentort 100 liter/perc mennyiségű steril levegővel levegőztetjük és kb. 28 °C-on 250 ford./perc sebességgel keverjük. Az antibiotikum termelést papírkorongos agar-diffúziós módszerrel követjük, minimális táptalajon, teszt-organizmusként B. subtilist alkalmazva. A maximális aktivitást 72-96 óra elteltével érjük el.
2. művelet
Az A 40926 antibiotikum kinyerése
A) A fermentlevet 4 °C-ra hűt jük, pH 9,5-re állítjuk be és keverjük. Kb. 1 óra elteltével szűrjük és a szűrlet pH-ját vizes ásványi savval kb. 3,5-re állítjuk be. Az elegyet 4 °C-on 30 percen ét keverjük, majd Hyflo-FloMa® szűrést elősegítő anyaggal szűrjük. A tiszta szürletet eltávolítjuk; a szűrölepényt ionmentesitett vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH-ját kb. 8,5-re állítjuk be, keverjük, majd szűrjük. A kinyert szűrölepényt ugyanennek az eljárásnak vetjük alá. Az egyesített szűrtetek tartalmazzák az A 40926 antibiotikumot.
B) 2 liter duzzasztott D-Ala-D-Ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose módosított mátrixot adunk az 1. művelet szerint előállított fermentléhez (miután szűrtük és a tiszta szürlet pH-ját kb. 8,5-e állítottuk be), vagy az előbbi 2.A) eljárás szerint kapott egyesített szűrlethez. Egy éjjelen át szobahőmérsékleten való keverés után a gyantát szűréssel kinyerjük és egymás után a következőkkel mossuk: kb. 2 x 10 liter pH 7,5 0,45 mmólos HC1-TRIS puffer (TRIS = 2-amino-2-hidroxi-metil-l,3-propándiol), amely 5 tömeg/térf.% NaCl-t tartalmaz, majd 4 x 20 liter desztillált viz. Az A 40926 antibiotikumot 2 x 20 liter 1 tömeg/térf.%-os ammónium-hidroxiddal eluáljuk u gyantáról. Az eluátumokat egy éjjelen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd kis térfogatra (kb. 2,5 liter) betöményítjük. A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval távolítjuk el. Ezután petrolétert adagolunk; igy 3,4 g nyers A 40926 antibiotikum komplexet csapunk ki.
-713
HU 201099 Β
3. művelet
Az A 40926 antibiotikum AB komplex tisztítása
A lényegében az előbbi 2. műveletet követve kapott nyers A 40926 antibiotikum komplexet (750 mg; HPLC titer 70%) 400 ml vízben oldjuk, az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be és szűrjük. A szűrletet affinitáskromatográfiának vetjük alá D-Ala-D-Ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon) 50 ml duzzasztott gyanta; töltet-magasság 5 cm). Az oszlopot 0,16 tömeg/térf.%-os ammóniával, mely 2 mól NaCl-ot tartalmaz, egyensúlyozzuk ki, amelyet HCl-val pH 7,5-re állítunk be, majd egymás után a kővetkező három puffer-oldattal fejlesztjük ki:
A puffer: NaCl-ra 2 mól, HCl-val pH 7,5-re beállított 0,16 tömeg/térf.%-os ammónia (2,6 agytérfogat);
B puffer: NaCl-re 2 mól, HCl-lel pH 9,5-re beállított 0,16 tömeg/térf.%-os ammónia (16 agytérfogat);
C puffer: 1 tömeg/térf.%-os pH 11,4 vizes ammónia 2,6 agytérfogat).
A C puffer egyetlen frakcióban eluálja az A 40926 antibiotikum AB komplexet. Ezt az eluált frakciót pH 7,0-ra állítjuk be és újra felvisszük ugyanerre az affinitás-oszlopra, amelyet pH 7,0 10 mM TRIS-HC1 pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot desztillált vízzel mossuk, amíg a sók eltávolítása teljessé nem válik. Ezután az antibiotikumot 2 oszlopágytérfogatnak megfelelő mennyiségű pH 11,0 39 tömeg/térf.%-os vizes ammóniával eluáljuk.
Az eluált frakciókat kistérfogatú vizes eleggyé tőményitjük be, majd ezt fagyasztva szárítjuk. 374 mg tiszta A 40926 antibiotikum AB komplexet kapunk.
4. művelet
Az A 40926 antibiotikum A és B faktor elkülönítése
A) 3,3 g, a 2. művelet szerint előállitott A 40926 antibiotikum komplexet vagy 2,3 g a
3. művelet szerint előállitott A 40926 antibiotikum AB komplexet 0,5 liter vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót kevertetjük, majd szűrjük. A tiszta szűrletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (200 g; ágy magasság 18 cm; szilanizált szilikagél 60, 0,20-0,06 mm szitalyukböség, Merck Inc.), amelyet előzetesen A oldattal egyensúlyoztunk ki (0,001 mól vizes nátrium-EDTA oldat, amely 0,25 tömeg/térf.% NaH2PO«-HzO-t és 2,5 tömeg/térf.% NaCl-t tartalmaz, NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva). Az oszlopot lineáris gradiens alkalmazásával eluáljuk (0%-40% - térf./térf. - acetonitril A oldatban; össztérfogat kb. 7 liter, kb. 48 óra alatt).
Kb. 15,5 ml-es frakciókat szedünk; ezeket biológiai meghatározásnak vetjük alá Bac.
subtilis alkalmazásával, és HPLC-vel elemezzük. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat ósszeóntjük. A 310-330. frakció tartalmazza az A 40926 antibiotikum A faktornak nevezett antibiotikumot, a 348-365. frakció pedig az A 40926 antibiotikum B faktornak nevezett anyagot.
B) Az A 40926 antibiotikum A faktort, illetőleg az A 40926 antibiotikum B faktort tartalmazó egyesített frakciókat az acetonitril eltávolítására csökkentett nyomáson betöményitjük, (kb. a kiindulási oldatok térfogata kétszeresének megfelelő mennyiségű) vízzel hígítjuk és felvisszük az előbbiekben leírt típusú szilanizált szilikagél oszlopra (a duzzasztott mátrix térfogata 50 ml; ágymagasság 15 cm). Az oszlopot ionmentesitett vízzel mossuk, amíg a sók eltávolítása teljessé nem vélik. Végül az oszlopot 60:40 (térf./térf.) acetonitrihvíz eleggyel fejlesztjük ki.
Az eluált frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük és a maradékot fagyasztva szárítjuk. Az eluált frakciók első csoportjából (az előbbi 310-330. frakció) 134 mg A 40926 antibiotikum A faktort kapunk, az eluált frakciók második csoportjából (az előbbi 348-365. frakció) pedig 206 mg A 40926 antibiotikum B faktort.
5. művelet
Az A 40926 antibiotikum PA faktor és PB faktor elkülönítése
Lényegében a 2. A) művelet és a 2. B) művelet első lépéseit követve a gyantához kötött antibiotikumot 2 x 20 liter 1 tömeg/ /térf.%-os ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumok pH-ját kénsavval 7,8-ra állítjuk be és az oldatokat vákuumban, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra tőményitjük be. Vizes koncentrátumot kapunk, amelyet papíron szűrünk. A kapott szűrlet A 40926 antibiotikum PA faktort, A 40926 antibiotikum PB faktort és kisebb mennyiségű A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort (HPLC) tartalmaz.
Ebből a vizes koncentrétumból egy 10 ml-es mintát, amely kb. 50 mg/ml tiszta A 40926 antibiotikum komplexet (HPLC-vel végzett elemzés) tartalmaz, 5 mikrométer pórusméretű szűrőn (Acrodise*, Gelman Science Inc.) szűrünk, majd a szürletet felvisszük egy 2 cm átmérőjű saválló acél oszlopra, amely 20 g oktadecil-szilil fordított fázisú szilikagélt (Lichrosorb RP 18, Merck Inc.) tartalmaz; részecskenagyság 10 pm. A szilikagélt ezután mérsékelt nyomáson (névleges nyomás kb. 1,4-106 Pa) betöltjük egy Chromatospac Modulprep készülék (Joben Yvon, Franciaország) saválló acél oszlopába és acetonitrihpH 6,0 18 mmól nátriumfoszfát puffer (térf./térf.) elegyével kiegyensúlyozzuk az oszlopot. Az eluálást ugyanannak az oldó9
-815
HU 201099 Β szerelegynek az alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet a kiegyensúlyozáshoz használtunk; áramlási sebesség kb. 10,5 ml/perc. Az eluálást Bac. subtilis-szel végzett biológiai meghatározással és HPLC-vel követjük.
A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük és 5 kromatográfiás futtatás homogén frakcióit a szerves oldószer ledesztillálásával betöményítjük.
A kapott oldatot az eredeti térfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű vizes 1 mólos nátrium-kloriddal hígítjuk és az oldatot felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (50 g, ágy-magasság 5 cm; szilanizált szilikagél 60, Merck Inc.), amelyet vízzel egyensúlyoztunk ki.
Az oszlopot ionmentesitett vízzel mossuk, amig a sók eltávolítása teljessé nem válik (vizes AgNO3 oldat hozzáadása után az eluátumokban nem jelenik meg AgCl csapadék), majd az oszlopot 1:1 (térf./térf.) acetonitrihviz eleggyel eluáljuk. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat (HPLC elemzés) összeöntjük, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be és így egy vizes fázist kapunk, amelyet fagyasztva szárítunk. Kitermelések:
A 40926 antibiotikum PA faktor: 55 mg A 40926 antibiotikum PB faktor: 51 mg A 40926 antibiotikum A faktor: 38 mg A 40926 antibiotikum Bo faktor: 33 mg
6. művelet
Az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítása A 40926 antibiotikum A faktorrá és az A 40926 antibiotikum PB faktor átalakítása A 40926 antibiotikum B faktorrá
50-50 mgA 40926 antibiotikum PA faktort, illetőleg A 40926 antibiotikum PB faktort, 2,5 ml vizes 1 tömeg/térf.%-os ammónium-hidroxidban külön-külön feloldunk és a kapott oldatokat kb. 24 órán át keverés közben szobahőmérsékleten tartjuk.
Az A 40926 antibiotikum A faktort úgy nyerjük ki az eredetileg az A 40926 antibiotikum PA faktort tartalmazó oldatból, és az A 40926 antibiotikum B faktort az eredetileg az A 40926 antibiotikum PB faktort tartalmazó oldatból, hogy a vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, etiléteres kicsapást végzünk és a csapadékot szűréssel összegyűjtjük (kitermelés kb. 75%).
A D-Ala-D-Ala-Sepharose előállítása
Aktivált CH-Sepharose 4B-t (Pharmacia Fine Chemicals) - 1 g - 15 percen át 1 mmólos jéghideg sósavban duzzadni hagyunk, majd ugyanezzel az oldattal mossuk.
A kapott (kb. 3 ml térfogatú) gélt öszszekeverjük egy olyan oldattal, amely 0,5 mólos nátrium-klorid - 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát puffer oldatban 30 mg D-alanil-D-alanint tartalmaz; pH 8.
A keveréket 1 órán át szobahőmérsékleten síkrázógépen rázatjuk.
A kapcsolási reakció befejeződése után a ligandum feleslegét a pufferrel kimossuk. A dextrán hordozó meg nem kötött aktivált csoportjait 1 mólos etanolamin-hidroklorid oldattal, pH 9-en 1 órán át végzett kezeléssel blokkoljuk.
Ezután a Sephadex-epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin módosított mátrixot szűréssel kinyerjük és alaposan mossuk, felváltva, 0,5 mólos nátrium-kloriddal és pH 4 0,1 mólos nátrium-acetáttal, majd négyszer -0,5 mólos nátrium-kloriddal és pH 8 0,1 mólos trisz(hidroximetil)aminometán pufferrel.
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon előállítására, mely a kővetkező jellemzőkkel rendelkezik:A) UV abszorpciós spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:lambdaaax(nm)
a) 0,1 n HCl 280 b) pH 7,38 foszfát puffer 280; 300 (váll) c) 0,1 n káliumhidroxid 298 d) pH 9,0 foszfát puffer 282; 300 (váll) B) IR abszorpciós spektruma a következő ab- szorpciós maximumokat mutatja (cm*1): 153700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620-1540; 1505; 1460; (nujol); 1375 (nujol); 1350-1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810C) ^-NMR spektruma a következő jel-cso- 20 portokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-en DMSO-d6-ban (hexadeutero-dimetil-szulf οχιό és CF3COOH elegyében felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalamazva (delta, ppm; multiplicitás; azonosítás); 25 2,51, s (DMSOds); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 3,30, m (Z’2); 4,08, m (X6); 4,44, d (X5); 4,49, d (X7); 4,83, m (X2); 5,02, s (4F); 5,08, s (Z6); 5,31, s (a mannóz anomer protonjai); 5,53, d (X4); 5,78, s (4B); 6,08, d (X3); 7,70, s (6B); 6,44-8,52 (aromás és peptid NH-k)D) retenciós idő (Rt) 1,18 az L 17054 (TA3-1) antibiotikumhoz viszonyítva (Rt = 8,78 35 perc), az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve:oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 um)A eluálószer:CH3CN 10% - 2,5 g/1 NaH2PO«.H2O 90% pH 6,0-ra beállítvaB eluálószer:CH3CN 70%2,5 g/1 NaH2PO4.HzO 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%-60% B eluólószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,6 ml/percUV detektor: 254 nm belső standard: L 17054 (TA3-1) antibiotikumE) Rf 0,39 a következő kromatográfiás rendszerben:5 g/1 NaH2PO4.HzO-t tartalmazó 1 mólos NaCl 705 acetonitril 30 pH 6,0-ra beállítva, szilanizált szilikagél 60 F254 Merck lemezeket (rétegvastagság 0,25 mm) - alkalmazvaElőhivás:- UV fény- sárga szín Pauly reagenssel, azaz diazotált szulfanilsavval- bioautog ráfia B. subtilis ATCC 6633 felhasználásával minimális Davis-f táptalajonF) gyors atom-bombázásos (FAB) tömegspektrum M + M‘ értékkel kb. 1374-nél, azzal jellemezve, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet, az A és B faktorban feldúsított komplexet, vagy a PA, PB, A, B vagy Bo faktort egy ásványi sav vagy egy erős szerves sav tömény vizes oldatának alkalmazásával - kívánt esetben egy aprotikus szerves oldószer jelenlétében - hidrolizáljuk.2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ásványi savként kénsavat alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal30 jellemezve, hogy szerves savként trifluor-ecetsavat alkalmazunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aprotikus szerves oldószerként dioxánt alkalmazunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegy hőmérsékletét 0 °C és a visszafolyatási hőmérséklet között tartjuk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 40 jellemezve, hogy a reakcióelegy hőmérsékletét 15 °C és 75 °C között tartjuk.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy erős savként 85-95%-os vises trifluor-ecetsavat alkalmazunk és a reak45 Aóelegy hőmérsékletét a szobahőmérsékletre állítjuk be.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljáráB, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist 2:1 - 1:2 arányú vizes ln kénsav:dioxán elegy jelenlété50 ben hajtjuk végre.
- 9. Eljárás gyógyászati készitmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon vegyületet egy55 gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy adalékanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB858531846A GB8531846D0 (en) | 1985-12-30 | 1985-12-30 | Antibiotic a 40926 mannosyl aglycon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT43091A HUT43091A (en) | 1987-09-28 |
| HU201099B true HU201099B (en) | 1990-09-28 |
Family
ID=10590309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU865503A HU201099B (en) | 1985-12-30 | 1986-12-29 | Process for producing a 40926 antibiotic mannosylaglycon and pharmaceutical compositions comprising same |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4782042A (hu) |
| EP (1) | EP0228015B1 (hu) |
| JP (1) | JP2514942B2 (hu) |
| KR (2) | KR950010460B1 (hu) |
| AT (1) | ATE71113T1 (hu) |
| DE (1) | DE3683266D1 (hu) |
| DK (1) | DK167815B1 (hu) |
| ES (1) | ES2038593T3 (hu) |
| GB (1) | GB8531846D0 (hu) |
| GR (1) | GR3003514T3 (hu) |
| HU (1) | HU201099B (hu) |
| IE (1) | IE59603B1 (hu) |
| IL (1) | IL81105A (hu) |
| ZA (1) | ZA869716B (hu) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK363587A (da) * | 1986-07-30 | 1988-01-31 | Smithkline Beckman Corp | Antibiotika og fremstilling heraf under anvendelseaf actinomadura parvosata |
| GB8621912D0 (en) * | 1986-09-11 | 1986-10-15 | Lepetit Spa | Increasing ratio of components of anti-biotic complex |
| GR871488B (en) * | 1986-10-10 | 1987-11-12 | Lepetit Spa | New antibiotics |
| ATE135369T1 (de) * | 1988-12-27 | 1996-03-15 | Lepetit Spa | Chemisches verfahren zur herstellung des antibiotikums l 17392 (deglukoteicoplanin) und dessen salze |
| US5206834A (en) * | 1989-10-14 | 1993-04-27 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Semiconductor memory device performing last in-first out operation and the method for controlling the same |
| CA2027629C (en) * | 1989-10-16 | 2000-01-25 | Karl H. Michel | Glycopeptide antibiotics |
| US5224972A (en) * | 1990-09-11 | 1993-07-06 | Frye Gregory C | Coatings with controlled porosity and chemical properties |
| JPH06503306A (ja) * | 1990-12-05 | 1994-04-14 | グルポ・レペチツト・エス・ピー・エイ | テイコプラニン抗生物質の３８−デカルボキシ−３８−ヒドロキシメチル誘導体およびそれらの製造方法 |
| US5606036A (en) * | 1991-03-27 | 1997-02-25 | Gruppo Lepetit Spa | Antibiotic A 40926 ester derivatives |
| EP0578644B1 (en) | 1991-03-27 | 1996-12-04 | GRUPPO LEPETIT S.p.A. | Antibiotic a 40926 ester derivatives |
| US5750509A (en) * | 1991-07-29 | 1998-05-12 | Gruppo Lepetit S.P.A. | Amide derivatives of antibiotic A 40926 |
| CN1036654C (zh) * | 1993-01-01 | 1997-12-10 | 格鲁波莱佩蒂特公司 | 抗菌素a40926的酰氨衍生物及其制备方法 |
| KR100430202B1 (ko) * | 1995-07-05 | 2004-09-18 | 아벤티스 벌크 에스.피.에이. | 등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제 |
| WO1997040067A1 (en) | 1996-04-23 | 1997-10-30 | Biosearch Italia S.P.A. | Improved chemical process for preparing amide derivatives of antibiotic a 40926 |
| US20060074014A1 (en) | 2002-11-18 | 2006-04-06 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections |
| WO2004045637A1 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections |
| US7119061B2 (en) * | 2002-11-18 | 2006-10-10 | Vicuron Pharmaceuticals, Inc. | Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections |
| JP5852880B2 (ja) * | 2011-12-28 | 2016-02-03 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 温度感応性材料 |
| EP3962929B1 (en) * | 2019-04-30 | 2023-03-01 | Huvepharma Italia S.r.l. | Method for the purification of lipoglycopeptide antibiotics |
| KR102467772B1 (ko) | 2022-08-23 | 2022-11-16 | 최세근 | 디자인에 따라 결합 가능한 모듈이 구비된 신발 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4521335A (en) * | 1983-07-13 | 1985-06-04 | Smithkline Beckman Corporation | Aglycone and pseudo-aglycones of the AAD 216 antibiotics |
| GB8425685D0 (en) * | 1984-10-11 | 1984-11-14 | Lepetit Spa | Antibiotic a 40926 complex |
-
1985
- 1985-12-30 GB GB858531846A patent/GB8531846D0/en active Pending
-
1986
- 1986-12-15 AT AT86117453T patent/ATE71113T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-15 EP EP86117453A patent/EP0228015B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-15 DE DE8686117453T patent/DE3683266D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-15 ES ES198686117453T patent/ES2038593T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 DK DK617086A patent/DK167815B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-12-23 IE IE338186A patent/IE59603B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-12-23 US US06/945,732 patent/US4782042A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-26 IL IL81105A patent/IL81105A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-12-29 HU HU865503A patent/HU201099B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-12-29 KR KR1019860011487A patent/KR950010460B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-12-29 JP JP61315964A patent/JP2514942B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 ZA ZA869716A patent/ZA869716B/xx unknown
-
1987
- 1987-07-01 KR KR1019870006803A patent/KR960010556B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-01-03 GR GR910402184T patent/GR3003514T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA869716B (en) | 1987-10-28 |
| DK167815B1 (da) | 1993-12-20 |
| IL81105A (en) | 1991-09-16 |
| DE3683266D1 (de) | 1992-02-13 |
| GR3003514T3 (hu) | 1993-03-16 |
| EP0228015B1 (en) | 1992-01-02 |
| HUT43091A (en) | 1987-09-28 |
| DK617086A (da) | 1987-07-01 |
| JP2514942B2 (ja) | 1996-07-10 |
| KR950010460B1 (ko) | 1995-09-18 |
| KR870006193A (ko) | 1987-07-09 |
| DK617086D0 (da) | 1986-12-19 |
| GB8531846D0 (en) | 1986-02-05 |
| EP0228015A2 (en) | 1987-07-08 |
| JPS62175499A (ja) | 1987-08-01 |
| IE59603B1 (en) | 1994-03-09 |
| EP0228015A3 (en) | 1987-12-16 |
| ATE71113T1 (de) | 1992-01-15 |
| KR960010556B1 (ko) | 1996-08-02 |
| IE863381L (en) | 1987-06-30 |
| ES2038593T3 (es) | 1993-08-01 |
| US4782042A (en) | 1988-11-01 |
| IL81105A0 (en) | 1987-03-31 |
| KR890002230A (ko) | 1989-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU201099B (en) | Process for producing a 40926 antibiotic mannosylaglycon and pharmaceutical compositions comprising same | |
| US4935238A (en) | Antibiotic A 40926 complex and its pure factors PA, PB, A, B and B0 | |
| JP2554350B2 (ja) | グリコペプチド抗生物質 | |
| AU601706B2 (en) | Antibiotic a 40926 n-acylaminoglycuronyl aglycons and antibiotic a 40926 aglycon | |
| JPH0819155B2 (ja) | 脱マンノシルテイコプラニン誘導体 | |
| US5085990A (en) | Teicoplanin-like derivatives | |
| JP3122248B2 (ja) | 抗生物質ＧＥ２２７０因子Ｃ２ａ | |
| JP3107586B2 (ja) | マンノシルテイコプラニン誘導体及びマンノシルテイコプラニンアグリコンの製造方法 | |
| JPH07114704B2 (ja) | 抗生物質ａ４２８６７およびその付加塩 | |
| JPH01242598A (ja) | 抗生物質ａ４２８６７誘導体 | |
| NZ227946A (en) | Actinomadura strain atcc 39727 useful for producing antibiotic a 40926 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |