DE2608216A1

DE2608216A1 - Antibiotika

Info

Publication number: DE2608216A1
Application number: DE19762608216
Authority: DE
Inventors: Maria Rosa Bardone; Grazia Beretta; Carolina Coronelli; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1975-03-05
Filing date: 1976-02-28
Publication date: 1976-09-23
Also published as: NL7602258A; IE44090L; NO145342B; NL166062B; PL98593B1; LU74476A1; JPS55102598A; IN142259B; DK141022B; JPS5830037B2; FR2302748B1; GR64305B; AU501202B2; FI54145B; CS198184B2; NO760725L; FI54145C; HU171790B; IL49094A; SU579902A3

Description

Die Erfindung betrifft ein antibiotisches Gemisch und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Das antibiotische Gemisch enthält eine Familie neuer Antibiotika, die als einzelne Bestandteile abgetrennt und isoliert werden können.

Diese Substanzen werden im nachstehenden als Antibiotikum 8327 Faktor A, 8327 Faktor B und 8327 Faktor C bezeichnet werden.

Antibiotium 8327 Faktor A,das seinerseits ein Gemisch aus drei ähnlichen Substanzen ist, wird auch als Teichomycin bezeichnet, während die drei Fraktionen als Teichomycin A., Teichomycin A_ und Teichomycin A bezeichnet werden.

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ORIGINAL INSPECTED

Das antibiotische Gemisch und die einzelnen Faktoren werden durch Fermentation eines zur Gattung Actinoplanes gehörenden Stammes namens Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. erhalten und in der vorliegenden Kollektion als Nummer A/8327 identifiziert. Der Stamm wurde bei der A.T.C.C. hinterlegt, wo er die Nummer 31121 erhielt.

Zur Herstellung des neuen Antibiotikagemischs wird Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das sich zum Wachstum dieses Organismus eignet, gezüchtet, wobei das Medium eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält. Gewöhnlich wird der Antibiotika produzierende Stamm in einem Schüttelkolben vorgezüchtet bis ein wesentliches Mycelwachstum vorliegt, worauf die Kultur zum Inokulieren der Nährmedium enthaltenden Fermentator-Gefäße verwendet wird.

Die Züchtung wird bei 25 bis 35°C unter aeroben Bedingungen solange fortgesetzt, bis eine wesentliche Menge an Antibiotikum entstanden ist. Während dieser Zeit werden mikrobiologische Prüfungen mit Hilfe der Agardiffusionsmethode durchgeführt, um die Konzentration des produzierten Antibiotikums zu kontrollieren. Die Fermentationsbrühe wird filtriert, um den Mycelkuchen abzutrennen. Das Antibiotikagemisch wird von der filtrierten Fermentatinnsbrühe nach üblichen Verfahren isoliert, wie beispielswe-ise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, worin das Äntibiotikagemisch löslich ist und das mit dem wäßrigen Medium nicht mischbar ist·.Die Extraktion wird durchgeführt, nachdem der pH-Wert der Fermentationsbrühe auf etwa 3,5 eingestellt worden ist. Geeignete organische Lösungsmittel für die Extraktion sind vorteilhafter-

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weise halogenierte C- bis C^-Kohlenwasserstoffe und C₁.- bis Cß-Alkanole. Das Lösungsmittel wird dann von der Fermentationsbrühe durch Hochgeschwindigkeitszentrifugierung abgetrennt, auf etwa 1/10 bis 1/20 seines ursprünglichen Volumens eingeengt, gekühlt und stehengelassen, bis sich ein Niederschlag bildet, der abfiltriert wird.

Dieser Niederschlag besteht im wesentlichen aus dem Antibiotikum 8327 Paktor A (Teichomycin), d.h. einem Gemisch aus Teichomycin A₁, A und A . Antibiotikum 8327 Faktoren B und C bleiben im wesentlichen in der organischen Lösung zurück und werden durch Zugabe einer großen Menge eines inerten nichtpolaren Lösungsmittels, wie Leichtpetroleum, ausgefällt.

Teichomycin A₁, A₂ und A werden durch Säulenchromatographie voneinander getrennt, während die Faktoren B und C voneinander mit Hilfe von Gegenstromverteilungstechniken getrennt werden.

Durch Extrahieren des Mycelkuchens mit wäßrigem Aceton ist es möglich, weiteres Produkt zu gewinnen. Nach Destillation des Acetons wird die wäßrige Phase der gleichen Behandlung unterworfen, die vorstehend für die filtrierte Fermentationsbrühe beschrieben wurde.

Beschreibung von Actinoplanes teichmyceticus nov. sp. ATCC 3H21 Makroskopische Untersuchung der Kolonien

Der mit der eigenen Code Nr. A/8327 bezeichnete Stamm wurde von einer Erdprobe, die b'ei Nimodi Village-Indore (Indien) gesammelt worden war, isoliert. Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Nähragars. In Hafermehlagar haben die Kolonien einen Durchmesser von 5 bis 6 mm, zeigen gleichmäßige Konturen und eine zentrale kuppelartige Protuberanz. Auf einigen Medium wurde ein reichliches steriles Luftmycel gefunden.

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Mikroskopische Untersuchung

Auf den meisten Medien reichlich produzierte Sporenkapseln werden in der Hauptsache auf der Kuppel der Kolonie gefunden. Sie sind sphärisch bis oval, mit regelmäßigen Konturen mit einem Durchmesser von 15 bis 25 mu. Die Sporenkapselträger sind gerade, etwa 15 niu lang mit einem Durchmesser von 2 um. Die Sporen, höchst beweglich, sind sphärisch bis oval mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2 mu.

Auf der Basis dieser Kennzeichen wurde der A/8327-Stamm der Gattung Actinoplanes zugeordnet und Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 genannt.

Tabelle I gibt die Kulturcharakteristxka von Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121, gezüchtet auf verschiedenen von Shirling und Gottlieb (Int. J. Syst.Bacteriol., 16, 313 bis 3^0j 1966) vorgeschlagenen Standardmedien und anderen von Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, The Williams and ftilkins Co., 196I) empfohlenen Medien wieder. Die Kulturcharakteristiken wurden nach 6 bis l^tägiger Inkubation bei 3O⁰C bestimmt.

Tabelle II gibt die Verwendung von Kohlenstoffquellen wieder, untersucht nach der Methode von Pridham und Gottlieb (Journal Bacteriol., 56, 107, 1948).

Tabelle III gibt die physiologischen Charakteristika des Stammes wieder.

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Der Stamm Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 wurde gleichzeitig gezüchtet mit: A. brasiliensis, A. missourensis, A. uthaensis, A. filippinensis, A. italicus, A. armeniacus, A. deccanensis ATCC 21983, A. garbadinensis ATCC 31049 und A. liguriae ATCC 31048. Er konnte sich klar von all diesen Species im Hinblick auf morphologische und PigmentationsCharakteristiken unterscheiden. Außerdem peptonisiert er Laiemusmilch, eine nicht häufige Eigenschaft, die er mit dem kirsch-rosa pigmentierten A. italicus teilt. Aus diesem Grunde wurde der Stamm A/8327 als neue Species anerkannt und ihm der Name Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 gegeben.

TABELLE I

Kulturcharakteristika

Kulturmedium Kulturcharakteristika

Hickey und Tresners- reichliches Wachstum mit glatter Agar Oberfläche, hellbraum 14/B/9

- Spuren von weißlichem Luftmycel mittlere Produktion von Sporenkapseln - braunes lösliches Pigment

Bennets Agar reichliches Wachstum mit glatter

Oberfläche,hellorange 9/B/7

- mittlere Produktion von blaßrosanem Luftmycel

Czapeks Glukoseagar reichliches Wachstum mit glatter

Oberfläche/hellorange 9/H/7

- Produktion von weiß-rosanem Luftmycel - einige spärliche Sporenkapseln

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Tabelle I (Fortsetzung)

Kulturmedium KuIt ur charakteris t ika

Medium Nr. 4 (Stärkeagar)

Medium Nr. 5 (GIy cerinasparaginagar)

Medium Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar)

Medium Nr. 7 (Tyrosinagar)

Hafermehlagar (60 °/oo)

Magermilchagar

Calcium-malatagar

Agar

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, tieforange 9/H/lO spärliche Produktion von Sporenkapseln

reichliches Wachstum mit dünner und glatter Oberfläche, blaßorange 9/B/7 - mittlere Produktion von Luftmycel, hellrosa

spärliches Wachstum

mittleres Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, ins Rosa gehendes Braun 12/A/9 - Produktion von spärlichem und weißlichem Luftmycel - rosa-braunes lösliches Pigment 12/A/9

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, blaßorange 9/B/5 bis hellorange-braun 12/B/8 beim Altern - reichliche Sporenkapseln hellrosa 9/B/5 - hell-haselnußbraunes lösliches Pigment

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, gebrannte Bernsteinfarbe 15/A/12 - tiefbernsteinbraunes lösliches Pigment 7/E/12

schwaches Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, blaßorange 9/B/5 - mittlere Produktion von Sporenkapseln

mittleres Wachstum, farblose reichliche Bildung von Sporenkapseln

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Tabelle I (Fortsetzung)

Kulturmedium Kulturcharakteristika

Gelatine bernsteinfarbiges lösliches

Pigment

Nitratbrühe bernsteinfarbiges lösliches

Pigment

Die Farbbestimmung wurde nach der Methode von Maerz und Paul gemacht (Maerz, A. und M. Reg Paul 1950j A dictionary of color, 2. Auflage, M. Grow - Hill Book Company, Inc., New York).

Die Nummern einiger Kulturmedien entsprechen denjenigen Nummern, wie sie gemäß Shirling und Gottlieb angegeben wurden.

TABELLE II

Kohlenstoffverbrauch

Kohlenstoffquelle Wachstum

Inosit

Fructose ++

Rhamnose

Mannit · ' ++

Xylose ++

Raffinose

Arabinose ++

Cellulose

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Tabelle II (Fortsetzung)

Kohlenstoffquelle Wachstum

Salicin +_

Saccharose ++

Mannose ++

Lactose +_

Glukose (positive Kontrolle) ++

= kein Verbrauch
+_ = zweifelhafter Verbrauch ++ = stark positiver Verbrauch

TABELLE III

Physiologische Charakteristika

Stärkehydrolyse ++

H₂S-Bildung ++

Chromogene Wirkung ++

Tyrosinhydrolyse

Caseinhydrolyse +++

Ca-malathydrolyse

Lackmusmilchkoagulation

Lackmusmilchpeptonisierung +

Nitratreduktion ++

Gelatineverflüssigung ++

Cellulosezersetzung

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- = negative Reaktion

+ = schwach positive Reaktion

++ = positive Reaktion

+++ = stark positive Reaktion

Herstellung der Antibiotika und Isolierung

Zur Herstellung der Antibiotika wurde der Stamm Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 aerob in einem Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8 vorgezüchtet, bis ein wesentliches Mycelwachstum vorlag.

Beispielsweise kann eine Schüttelkolbenkultur folgende Zusammensetzung in g/l aufweisen:

Fleischextrakt 3_SO

Ty/rpton 5,0

Hefeextrakt 5,0

Glukose 1,0

lösliche Stärke 24,0

Calciummalat 4,0 destilliertes Wasser q.s. auf 1000 ml

Die Kolben wurden etwa 24 Stunden lang bei etwa 28 bis 30⁰C geschüttelt und dann die Vorkulturen (1 Liter) zum Inokulieren von Fermentatorgefäßen verwendet, wobei jedes Gefäß 10 des nachstehenden Nährmediums enthielt:

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Fleischextrakt 40 g

Pepton HO g

Hefeextrakt 10 g

Natriumchlorid 25 g

Sojabohnenmehl 100 g

Glukose 500 g

Calciumcarbonat 50 g Leitungswasser q.s. auf 10 Liter

Die Fermentationsbeschickungen wurden unter Rühren bei 28 bis 30⁰C aerob inkubiert. In Intervallen wurde die antibiotische Aktivität durch die Agardiffusionsmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus als TestOrganismus bestimmt. Die maximale Aktivität war nach 72 bis 96stündiger Fermentation erreicht.

Isolierung der Teichomycine und Antibiotikum 8527 Faktoren B und C

Die sowohl im filtrierten Medium als auch im Mycelkuchen vorliegenden Antibiotika können mit organischen Lösungsmitteln nach üblichen Methoden extrahiert werden.

Die filtrierte Brühe wurde auf einen pH-Wert von 3_S5 durch Zugabe von 8£iger HCl eingestellt und dann 2 χ mit 30$igem Butanol extrahiert. Die organischen Extrakte wurden unter Vakuum bei ^5⁰C auf 1/10 des ursprünglichen Volumens eingeengt, mit einer kleinen Menge Wasser bei einem pH-Wert von 3,5 gewaschen und wieder auf ein kleines Volumen eingeengt. Man ließ die eingeengte Lösung bei niedrigen Temperaturen 10 bis 15 Stunden lang stehen, bis sich ein Niederschlag bildete, der abfiltriert wurde. Die filtrierte Lösung wurde in eine

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große Menge Leichtpetroleum geschüttet und der dabei erhaltene rohe Niederschlag abfiltriert.

Der Mycelkuchen wurde mit Wasser bei einem pH-Wert von 3_S5 gewaschen, unter Vakuum getrocknet und mit einem Gemisch aus Wasser/Aceton 2:8 extrahiert. Der Acetonextrakt wurde unter Vakuum bei 40 bis 45°C eingeengt. Der wäßrige Rückstand wurde auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und 3 χ mit Butanol extrahiert. Die gesammelten Butanolextrakte wurden mit einer kleinen Menge Wasser bei einem pH-Wert von 3,5 gewaschen und unter Vakuum auf 1/20 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Die eingeengte Lösung ließ man bei 4°C 10 bis 12 Stunden lang stehen. Ein roher Niederschlag wurde erhalten, der abfiltriert wurde. Die filtrierte Lösung ergab einen weiteren Niederschlag, nachdem man sie in eine große Menge Leichtpetroleum gegossen hatte.

Die chromatographische Untersuchung, die wie in Tabelle IV durchgeführt wurde, zeigte, daß die Produkte, die durch Kühlen der eingeengten Butanolextrakte erhalten wurden, im wesentlichen Teichomycin A., A und A enthielten, wobei A„ die in größeren Mengen vorliegende Fraktion war und die durch Ausfällung in ein inertes nicht polares Lösungsmittel (Leichtpetroleum) erhaltenen Produkte Antibiotika 8327 Faktoren B und C enthielten.

Antibiotikum 8327 Faktoren B und C wurden voneinander getrennt, indem man Gegenstromverteilungstechniken anwandte, und als einzelne Antibiotika isoliert. Ein für diese Trennung geeignetes Lösungsmittel ist ein Gemisch aus Phosphatpuffer M/15 pH 7,0-n-Butanol-Hexan 1:1:0,05.

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Teichomycin A., A_ und A, wurde durch Säulenchromatographie auf Sephadex LH-2O_/unter Verwendung eines Gemischs aus n-Propanol-Äthylacetat-NH^OH O,2N 10:7:7 als Eluierungsmittel getrennt.

Die eluierten Fraktionen wurden mit Silicagel TLC analysiert unter Verwendung von n-Propanol-Äthylacetat-konzentriertes NHhOH 2:1:2 als Lösungsmittelsystem und von mikrobiologischer Entwicklung von S.aureus als Nachweissystem. Teichomycin A₁ hat Rf - 0,48, Teichomycin A„ R_f = 0,10 und Teichomycin A, = 0,0.

Die die einzelnen Antibiotika enthaltenden Fraktionen wurden auf ein sehr kleines Volumen eingeengt, mit Methanol verdünnt und in ein großes Volumen Aceton gegossen, wobei die drei Antibiotika als weißlich amorphe Pulver ausfielen.

Die verschiedenen chromatographischen Muster der fünf Antibiotika in den verschiedenen Eluierungssystemen werden in Tabelle IV wiedergegeben.

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TABELLE

IV

Chromatographische Muster von Antibiotika 8327 Paktor B, Paktor C₃ Teichomycin Α., Teichomycin Ap und
Teichomycin A,

Chromatographie auf Whatman-Papier Nr. 1
Inaugenscheinnahme der Flecken durch mikro·

biologische Entwicklung von Staphylo coccus aureus	Paktor B	Paktor C	Teichomycin A₁.	Teichomycyin	Teichomycin ^A3
Eluierungssystem 1) Butanol gesättigt mit Phosphatpuffer _CT M/15 pH 6,0 ο 2) Butanol gesättigt mit Wasser enthaltend co 2% p-Toluolsulfonsäure a> 3) Butanol gesättigt mit Wasser enthaltend ^w 2% Ammoniumhydroxid ί^ 4) Phosphatpuffer M/15 pH 6,0 gesättigt _» mit Butanol _o 5) 20#ige wäßrige NHhCl-Lösung -* 6) Butanol:Methanol:Wasser(40:10:20) mit . co O,75£ Methylorange 7) Butanol:Methanol:Wasser (40:10:20) 8) Äthylacetat gesättigt mit Wasser 9) n-Propanol:n-Butanol:NH₁₁OH 1ON(2:3:4)	0,83	0,86 0,88	0,0 o.os	0,13	'0,0 0,0
DünschichtChromatographie auf Silicagel Eluierungssystem: -	0,73 0,0 · 0,0	0,79 0,76 .	0,0 . 0,20 0,0 ·	0,0 '0,2S O_f.O. 0.37 ' 0.41	0,33^ .0_;ό1* ■ 0,13 0,20 0,0· 0,10
n-Propanol:Äthylacetat:konz.NH2jOH (2:1:2)	0,88 0,89 0,20	, 0,88 0.90	0,42 0,46	0,0 L Oj 43
	Ö.7Ö 0,88	0_;0 0,55		0,0 ro cn CD
			0,10
	0,48 i

Biologische Eigenschaften von Teichomycin A^, 1) in vitro-Aktivität

A, und 8327 Paktoren B und C

Mindesthemmkonzentration (ug/ml)

Stamm	Teichomycin	Teichomycin	Teichomycin!	3 :	j	8327	. ,	8327
	^Al	^A2	A	.0 ■	*	Paktor B		Faktου C
Staphylococcus aureus ATCC 6538	0.02	0.5	2	.0	;	2.0		2.0
Staphylococcus aureus Tour	•0.05	1.0	2	.0 !	!	5.0	J	. 2.0
Staphylococcus aureus Tour + 30°a Bovinserum ~	50	1.0	2	.0 i	!	20	I i I	2.0
Streptococcus haemolyticus C-203 *'	O.5..	0.05	1	• o i		2.0 ■	, ί	0.5
Diplococcus pneumoniae UC 41 ,	0.5	0.1	■ 2	•0	I	2.0	I	2.0
Clostridium perfringens ISS 30543 _t	2.0	' 0.05 :	5		10	■i	50 *
Escherichia coli SKF 12140 '	■ · 10	>ioo :	i>100	>100	• I	>100-4r
Proteus vulgaris X 19 H ' '	20	t>ioo I	>100	>100	.J.	>100*
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145	100	>100	>100	>100	>100
Candida albicans SKF 2270 ,	l>100	• >ioo j	f>100	>100 '	>100
Trichophyton mentagrophytes SKF 17410	• >100	ί>100 \|	>100	>100	>100
Mycobacterium tuberculosis H₃₇R ATCC 9.360	t>100	>100 ' j	N.D	>100	100
Mycoplasma gallisepticum H 21 C.Z,B.'	N.D	i>100	>100	' >100	' >100
Neisseria gonorrheae . ....		1.0 ,·	• 10	. N.D	10

οο οα co

= nicht bestimmt

cn * ο

Die Teichomycine sind außerdem gegenüber Bakterien aktiv, die gegenüber weit verbreiteten Antibiotika resistent sind, wie Penicillin, Tetracyclin, Streptomycin, Bacitracin, Cephalosporin, Rifampicin, Streptomycin, Neomycin und Chloramphenicol.

Aus vorstehenden Eigenschaften ist ersichtlich, daß die neuen antibiotischen Substanzen für verschiedene Zwecke geeignet sein können, wie beispielsweise zum Bekämpfen von Infektinnskrankheiten bei Tieren, zum Desinfizieren von Objekten und Instrumenten, als wachsturnsfördernde Mittel bei Tieren und für viele andere Zwecke, bei denen die Unterdrückung pathogener Bakterien eine Rolle spielt.

2) Akute Toxizität bei Mäusen

Teichomycin A^

500 mg/kg (i.v.) Teichomycin A„ 1000 mg/kg (i.p.)

3) in vivo-Aktivität bei experimentellen Infektionen

_. mg/kg s.c. Infizierender Stamm Teichomycin A₁ Teichomycin A₉

Streptococcus haemoliticus 2,1*} 0,1

Staphylococcus aureus ' 3,97

Diplococcus pneumoniae 11,5 0,57

8327 Faktor B und 8327 Paktor C zeigten keinerlei Wirksamkeit bis zu 80 mg/kg s.c.

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Physikalisch-chemische Eigenschaften von Teichomycin

Das wie vorstehend beschrieben erhaltene Teichomycin A ist ein amorphes Pulver, das nach weiterem Reinigen durch Behandlung mit einem Polystyrol-sulfonierten Harz (Dowex 50) in wäßriger Lösung bis auf einen pH-Wert von ¹I folgende physikalischchemische Eigenschaften aufweist:

1) Schmelzpunkt: 26O°C (Zers.)

2) Elementaranalyse:

Die nachstehend angegebenen prozentualen Werte sind der Durchschnitt aus drei verschiedenen Analysen:

C = 5^,20; H = 5,70; N = 6,80; Cl = 3,30; 0 (durch Differenz

errechnet) = 26,70

3) UV-Absorptionsspektrum: (siehe Figur 1)

Lösungsmittel	7,38	*max (nm)	^Elcm
Phosphatpuffer pH		278	55
Salzsäure O,1N	IN	278	53
Natriumhydroxid 0,	297

Das UV-Spektrum wurde mit einem Beckman DK-2-Apparat aufge nommen .

'4) IR-Absorptionsspektrum:

Das vollständige Bild des Spektrums in Nujolmull wird in Figur 2 wiedergegeben. Die wichtigsten Absorptionsbanden treten bei folgenden Frequenzen auf-(cm ):

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3300 (breit), ~29OO (Nujol), 1720 (Schulter), 1660, 1600 (Schulter), -1500, 1455 (Nujol), 1375 (Nujol), 1235, 1190-930, 850, 720 (breit).

Das IR-Spektrum wurde mit einem Perkin Eimer 157-Apparat aufgenommen.

5) Löslichkeit

Die Verbindung ist:

löslich in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7*0, wäßrigem Natriumbicarbonat, verdünnten Lösungen von Alkalihydroxiden, Methanol-Wasser-Gemischeoteilweise löslich in Methanol und Äthanol; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren und nichtpolaren organischen Lösungsmitteln.

6) Charakteristische Reaktionen:

Fehling	positiv
Tollens	positiv
KMnO₁₁	positiv
PeCl,	positiv
konz. H₂SO₂J	dunkelviolett
Polin Ciocolteu	positiv
Griess	negativ
Antron	negativ
Schiff	negativ

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7) Potentiometrische Titrationen:

Eine ionisierbare Punktion wurde potentiometrisch ermittelt, in Wasserlösungen mit einem pKa-Wert = 4,9. Eine basische Punktion wurde durch Titration mit HClOj. in Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösungen ermittelt; das ermittelte Äquivalentgewicht betrug dementsprechend 1 170.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von Teichomycin A.

Teichomycin Α., das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, wurde weiter gereinigt durch Säulenchromatographie an Silicagel-Celit (1:1 V/V) unter Verwendung eines Gemischs von n-Butanol/Essigsäure/Wasser (8:2:2) als Eluierungsmittel. Es war ein amorphes Pulver mit folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

1) Schmelzpunkt: 220⁰C (Zers.)

2) Elementaranalyse:

Folgende prozentuale Mengen angabe ist der Durchschnitt von

drei verschiedenen Analysen:

C = 52,9 %i H = 7,6 %; N = 5,26 %; 0 = 32,5 %; Asche = 3,26

3) UV-Absorptionsspektren:

Keine Absorption zwischen 220 und 360 nm.

Das UV-Spektrum wurde mit einem Beckman DK-2-Apparat aufgenommen.

4) IR-AbsorptionsSpektrum:

Das vollständige Bild des Spektrums in Nujolmull wird in Figur 3 wiedergegeben. Die wichtigsten Absorptionsbanden

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treten bei folgenden Frequenzen auf (cm ):

3350 (breit), 2930-2850 (Nujol), 2750-2000, 1720 (Schulter), 1670 (breit), 1620 (Schulter), I56O (breit), 1^60 und 1370

(Nujol), 13^0 (Schulter), I26O, 1240, II50 (Schulter),

1120 (Schulter), 1040 (sehr breit), 970 (breit), 950 (Schulter),

900 (breit), 865, 805, 720.

Das IR-Spektrum wurde mit einem Perkin-Elmer-517-Apparat

aufgenommen.

5) Löslichkeit

Die Verbindung ist:

löslich in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7,0,

wäßrigem N at ri umb ic arb onat, verdünnten wäßrigen Lösungen ■.

von Alkalihydroxiden, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid;

teilweise löslich in Methanol und Äthanol,

unlöslich in verdünnten Mineralsäuren und in nichtpolaren

organischen Lösungsmitteln.

6) Charakteristische Reaktionen:

Pehling	positiv
Tollens	positiv
KMnO₁,	positiv
Griess	negativ
Antron	positiv
Schiff .	negativ
MoIish	positiv
Molekulargewicht: ■

Die Bestimmung des-Molekulargewichts durch Chromatographie

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durch Sephadex G 75 zeigte folgende Werte: 20 000 in Phosphatpuffer pH 7,38 30 000 in Citratpuffer pH H₃H.

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Claims

Patentansprüche:

!./Antibiotika, genannt Teichomycin A„, gekennzeichnet durch:

1) Schmelzpunkt: 26O°C (unter Zersetzung)

2) Elementaranalyse (Durchschnitt von drei Bestimmungen): C = 54,20 %; H = 5,702; N =·6,8θ %; Cl = 3,30 %;

0 (durch Differenz) = 26,70 %.

3) UV-Absorptionsspektrum (Figur 1):

Lösungsmittel λ max (nm) ^Eicm

Phosphatpuffer pH 7,38 278 55 Salzsäure O,1N 278 53

Natriumhydroxid O,1N 279 74 _f

4) IR-Absorptionsspektrum in Nujolmull (Figur 2):

mit den wichtigsten Absorptionsbanden bei folgenden Prequenzen (cm ):

3300 (breit), ~ 2900 (Nujol), 1720 (Schulter), 1660, 1600 (Schulter), ~1500, 1455 (Nujol), 1375 (Nujol), 1235, 1190-930, 850, 720 (breit),

5) Löslichkeit:

löslich in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7,0, wäßrigem Natriumbicarbonat, verdünnten wäßrigen Lösungen

von Alkalihydroxid, Methanol-Wasser-Gemische. teilweise löslich in Methanol und Äthanol;

unlöslich in verdünnten Mineralsäuren und in nichtpolaren

organischen Lösungsmitteln,

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6)-Charakteristische Reaktionen:

Fehling positiv Tollens positiv KMnO₁₁ positiv PeCl positiv konz.HpSOij dunkelviolett Folin Ciocolteu positiv Griess negativ An tr on negativ Schiff negativ Potentiometrisehe Titrationen:

£ine ionisierbare Funktion wurde potentiometrisen ermittelt in Wasserlösungen mit einem pKa-Wert = 4,9;
eine basische Funktion wurde durch Titration mit HClO₂, in DMSO-Lösungen ermittelt; das ermittelte Äquivalentgewicht ist somit 1170,

8) Chromatrographisches Muster:

a) auf Whatman-Papier Nr. 1:

Eluierungssystem Rf

1) Butanol gesättigt mit Phosphatpuffer M/15 pH 6,0 0,0

2) Butanol gesättigt mit Wasser enthaltend 2% p-Toluolsulfonsäure 0,13

3) Butanol gesättigt mit Wasser enthaltend 2% Ammoniumhydroxid O₉O

4) Phosphatpuffer M/15 pH 6,0, gesättigt mit Butanol 0,25

5) 20&ige wäßrige NH.Cl-Lösung 0,0

6) Butanol:Methanol:Wasser-

(40:10:20) mit 0,115% Methyl- 0,37 orange

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7) Butanol:Methanol:Wasser

(40:10:20) 0,4l

8) Äthylacetat, gesättigt mit Wasser 0,0

9) n-Propanol^-Butano^NHjjOH

ION (2:3:*Ο 0,ίί3

b) auf Silicagel-Dünnschicht

Eluierungssystem Rf

n-Propanol:Äthylacetat:konz.NHkOH 0,1

(2:1:2)

2. Antibiotika, genannt Teichomycin A₁, gekennzeichnet durch:

1) Schmelzpunkt = 220⁰C (unter Zersetzung)

2) Elementaranalyse (Durchschnitt von drei Bestimmungen):

C = 52,92; H = 7,6%; N = 5,262; 0 = 32,52; Asche = 3,262,

3) keine UV-Absorption zwischen 220 und 360 nm,

i}) IR-Absorptionsspektrum in Nujolmull (Figur 3):

mit den wichtigsten Absorptionsbanden bei folgenden Fre-

quenzen (cm );

3350 (breit), 2930-2850 (Nujol), 2750-2000, 1720 (Schulter), I67O (breit), 1620 (Schulter), I56O (breit), 1460 und 1370 (Nujol), 13^0 (Schulter), 1260, 12*10, 1155 (Schulter), 1120 (Schulter), lOHQ (sehr breit), 970 (breit), 950 (Schulter), 900 (breit), 865, 805, 720,

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5) Löslichkeit:

löslich in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7,0, wäßrigem Natriumbicarbonat, verdünnten wäßrigen Lösungen von Alkalihydroxiden, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid; teilweise löslich in Methanol und Äthanol; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren und nichtpolaren organischen Lösungsmitteln,

6) Charakteristische Reaktionen:

Pehling positiv Tollens positiv KMnO^ positiv Griess negativ Antron positiv Schiff negativ Molish positiv Molekulargewicht:

Bestimmungen des Molekulargewichts durch Chromatographie durch Sephadex G 75 zeigte folgende Werte:

20 000 in Phosphatpuffer pH 7,38 30 000 in Citratpuffer pH 4,4,

8) Chromatographische Muster:

a) auf Whatman-Papier Nr. 1

Eluierungssystem Rf

1) Butanol, gesättigt mit Phosphatpuffer M/15 pH 6,0 0,0

2) Butanol, gesättigt mit Wasser, enthaltend 2 % p-Toluolsulfonsäure 0,05

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3) Butanol, gesättigt mit Wasser,

enthaltend 2% Ammoniumhydroxid 0,0

4) Phosphatpuffer M/15 pH 6,0, gesättigt

mit Butanol 0,20

5) 20$ige wäßrige NH^Cl-Lösung 0,0

6) Butanol:Methanol:Wasser (40:10:20) mit

0,752 Methyl-orange 0,42

7) Butanol:Methanol:Wasser (40:10:20) 0,46

8) Äthylacetat, gesättigt mit Wasser 0,0

9) n-Propanol:n-Butanol:NH^OH ION (2:3:4) 0,55

b) auf Silicagel-Dünnschicht: Rf

Eluierungssystem

n-Propanol:Äthylacetat:konz.NH₁₁OH 2:1:2 0,48

3· Verfahren zur Herstellung der Antibiotika gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 oder ein Äquivalent davon unter aeroben Bedingungen in einem eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltendem wäßrigen Nährmedium züchtet, die Antibiotika gewinnt und die beiden Antibiotika voneinander trennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei etwa 25 bis etwa 35°C durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung etwa 72 bis 120 Stunden durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Teichomycin A^ und Teichomycin A_ zusammen mit anderen Metaboliten, genannt Teichomycin A,, Antibiotikum 8327 Faktor B bzw. Antibiotikum 8327 Paktor C herstellt und die verschiedenen

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im Fermentationsmedium vorliegenden Metaboliten in einzelne Fraktionen von Teichomycin A , Teichomycin A_?, Teichomycin A , Antibiotikum 8327 Faktor B und Antibiotikum 8327 Faktor C trennt.

7. Verfahren nach Anspruch 3 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antibiotika durch Extraktion mit halogenierten C^- bis (^-Kohlenwasserstoffen oder C^- bis C^-Alkanolen gewinnt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 3, 6 und 7» dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit Butanol durchführt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 3₃ 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Butanolextrakt auf etwa 1/10 bis ^! 1/20 seines ursprünglichen Volumens einengt und dann unter Bildung eines Niederschlags, der im wesentlichen aus einem Gemisch aus Teichomycin A A_ und A besteht,- kühlt.

10. Verfahren nach den Ansprüchen j>, 6, 7> 8 und 9_S dadurch gekennzeichnet, daß man Teichomycin A , A und A durch Säulenchromatographie voneinander trennt.

11, Verfahren nach den Ansprüchen 3> 6, 7> 8, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Teichomycin A_n durch Behandlung mit einem Polystyrol-sulfonierten Harz in wäßriger Lösung auf einen pH-Wert von ²J weiter reinigt.

12..Verfahren nach den Ansprüchen 3· £> 7, 8, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet j. daß man Teichomycin A₁ durch Chromatographieren

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~ ^2Ί ~ ? 6 Q 8 2 1 6

durch eine Silica-Celit-Säule unter Verwendung eines Gemische aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser als Eluxerungsmittel weiter reinigt.

Für: Gruppo Lepetit S.p.A. Mailanä ///Italien

r.tflJ.Wolff Rechtsanwalt

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