CS198184B2

CS198184B2 - Method of producing new antibiotic

Info

Publication number: CS198184B2
Application number: CS761393A
Authority: CS
Inventors: Carolina Coronelli; Grazia Beretta; Maria Bardone; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1975-03-05
Filing date: 1976-03-03
Publication date: 1980-05-30
Also published as: JPS51136890A; RO68837A; US4239751A; GB1496386A; FI760562A; DK92776A; SE432782B; NO760725L; SU579902A3; GR64305B; HK46182A; AT342766B; IL49094A; SE7602864L; NL166062C; MX3839E; JPS5629880B2; IL49094A0; IE44090L; ATA159776A

Description

Vynález se týká způsobu výroby nového antibiotika, které je směsí tří látek, oddělitelných a izolovatelných jako jednotlivé složky.

Tyto látky budou dále nazývány jako antibiotikum. 8327 faktor A, faktor В a faktor C.

Antibiotikum 8327 faktor A je rovněž směsí tří velmi podobných látek a nazývá se teichomycin, tři jeho složky budou v průběhu přihlášky nazývány teichomycin Ai, teichomycin Аг a teichomycin Аз.

Antibiotickou směs a její jednotlivé faktory je možno získat pěstováním kmene, který patří do rodu Actionoplanes. Jde o Actinoplanes teichomyceticus nov. sp., který má číslo sbírky A 8327. Tento kmen byl uložen ve veřejné sbírce ATCC, v níž je jeho číslo 3'1121.

• Při výrobě nové antibiotické směsi se svrchu uvedený kmen Actinoplanes teichomycetícus nov. sp. ATCC 31121 pěstuje za aerobních podmínek ve vodném živném prostředí, vhodném pro· růst tohoto organismu, přičemž.toto prostředí obsahuje využitelný zdroij uhlíku, využitelný zdroj dusíku a anorganické soli. Obvykle se nejprve vytváří předběžná kultura v třepací láhvi tak dlouho, až se nahromadí dostatečné množství mycelia, načež se tato kultura užije к očko2 vání větších fermentorů s obsahem fermentačního prostředí.

Kultivace se provádí při teplotě 26 až 35° Celsia za aerobních podmínek po· dobu, dostatečnou v nahromadění většího množství antibiotika. V průběhu této doby se provádí mikrobiologické zkoijšky difúzí na agaru ke zjištění koncentrace vytvářeného antibiotika. Živné prostředí se. zfiltruje к odstranění mycelia a ze zfiltrovaného živného prostředí se směs antibiotik izoluje běžným způsobem, například extrakcí organickým rozpouštědlem, v němž je směs rozpustná, a které se nemísí s vodným prostředím. Extrakce se provádí po úpravě pH živného prostředí na hodnotu 3,5. Vhodným organickým rozpouštědlem pro extrakci je halogenovaný uhlovodík o 1 až 4 atomech uhlíku a alkanol o 4 až 6 atomech uhlíku. Rozpouštědlo se pak oddělí od živného prostředí odstředěním při velkých rychlostech, zahustí se na 1/10 až 1/20 svého původního objemu, zchladí a nechá stát tak dlouho, až se vytvoří sraženina, která se izoluje filtrací.

Tato sraženina v podstatě sestává z antibiotika 83'27 faktor A (teichomycin), tj. ze směsi teichomycin u Ai, Аг а Аз. Antibiotikum 83'27 faktor В a C v podstatě zůstává v organickém roztoku a tyto· faktory je pak možno vysrážet přidáním velkého množství

inertního nepolárního rozpouštědla jako lehkého petroleje. Teichomycin Ai, Аг а Аз je možno od sebe oddělit sloupcovou chromatografií, faktory В a C se od sebe dělí protiproudovou distribucí. Extrakcí mycelia směsí vody a acetonu je možno'izolovat další produkt. Po· destilaci acetonu se vodná fáze zpracuje stejným způsobem, jak bylo· uvedeno svrchu pro zfiltrované živné prostředí.	ge — Indore (Indie). Uvedený kínen roste velmi dobře na větším množství agarových živných půd. Na agaru s ovesnou moukou mají kolonie průměr 5 až 6 mm, mají pravidelné obrysy a centrální polokulovité vyvýšení. V některých prostředích je možno pozorovat bohaté vzdušné mycelium. Mikroskopické zkoumání Sporangia se tvoří ve velkém množství na většině živných prostředí a nacházejí se vět-
Popis kmene Actionoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121	šinou na vyvýšeném středovém vrcholu kolonie. Tyto· útvary jsou kulovité až vejčité s pravidelnými obrysy o průměru 15 až 25
Makroskopický vzhled kolonií	nm. Sporangiofory jsou přímé, dlouhé při-

bllžně 16 mm při průměru 2 nm. Spóry jsou Uvedený kmen, označený číslem v podni- velmi pohyblivé, kulovité až vejčité s prů-

kové sbírce A/8327 byl izolován ze vzorku půdy, který byl odebrán v Nimodi Villa-

měrem 1,5 až 2 nm.

TABULKA 1

Kultivace Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121

Živné prostředí	Vlastnosti kultury
Agar podle Hickeye a Resnera	bohatý růst s hladkým povrchem světlehnědé barvy 14/B/9, stopy bělavého vzdušného mycelia, středně silná produkce sporangií, hnědý rozpustný pigment
Bennetův agar	bohatý růst s hladkým povrchem světleoranžové barvy 9/B/7 středně silné produkce vzdušného mycelia světlerůžové barvy
Czapkův agar s glukózou	bohatý růst s hladkým povrchem světleoranžové barvy, vzdušné mycelium bělorůžové, malé množství sporangií
Czapkův agar se sacharózou	bohatý růst s bledě oranžovým hladkým povrchem 9/B/7, středně silná produkce sporangií
Agar s glukózou a asparaginem	středně silný růst s hladkým povrchem oranžové barvy 10/D/12
Bramborový agar	bohatý růst s hladkým a jemným povrchem světle ořechově hnědé barvy. Bohatá produkce světle růžových sporangií, vytváří se světle ořechově hnědý rozpustný pigment
Živný agar	slabý růst s hladkým a jemným povrchem oranžové barvy 10/5/11
Agar s vaječným albuminem	bohatý růst s hladkým povrchem světle růžovooranžové barvy 9/B/5, bohatá tvorba sporangií
Agar s peptonem a glukózou	bohatý růst se zvrásněným povrchem hluboce oranžové barvy C/12, světle zlatohnědý rozpustný pigment
Bramborový blok	omezený růst se zvrásněným povrchem světle oranžové barvy

Živné prostředí

Vlastnosti kultury

Loefflero-vo krevní sérum

Prostředí č. 2 (agar s extraktem z kvasnic a · sladem)

Prostředí č. 3 [agar s 20 promile ovesné mouky)

Prostředí č. 4 (agar se škrobem) ·

Prostředí č. 5 (agar s glycerolem a asparaginem)

Prostředí č. 6 (agar s peptonem, extraktem z kvasnic . a železem)

Prostředí č. 7 (agar s tyrosinem)

Agar s 60 promile ovesné mouky

Agar s odstředěným mlékem

Agar s maleinanem vápenatým

Agar

Želatina

Bujón s dusičnanem jednotlivé kolonie světle oranžové barvy . se šedohnědým rozpustným pigmentem bohatý .růst se slabě zvrásněným povrchem, barva světle růžovooranžová 9/B/6, bohatá sporangia světle růžové barvy 9/A/5, zlatohnědý rozpustný pigment bohatý růst s hladkým světle oranžovým povrchem 9/B/5, · bohatá . sporangie světle růžové barvy 9/A/5.

bohatý růst s hladkým povrchem hluboce oranžové barvy 9/H/10, chudá produkce sporangií bohatý růst . s jemným a hladkým povrchem světle oranžové barvy 97B/7, středně silná produkce světle růžového· vzdušného· mycelia ojedinělé kolonie · mírný růst s hladkým a jemným povrchem. růžovohnědé · · barvy · 12/A/9, malé množství bělavéhO' vzdušného mycelia a růžovohnědého rozpustného· pigmentu 12/A/9 bohatý růst s hladkým povrchem světle oranžové barvy 9/B/5 až ’ světle oranžově hnědé barvy 12/B/8 při stárnutí · kultury, bohatá sporangia světle růžová 9/B/5, .světle ořechově hnědý rozpustný pigment bohatý růst s hladkým povrchem sytě zlatohnědé barvy 15/A/12, hluboce zlatohnědý rozpustný pigment 7-/E/12 ojedinělé kolonie s hladkým a jemným povrchem světle, oranžové barvy 9/B/5, malá produkce sporangií mírný růst, kolonie bezbarvé · s bohatou tvorbou sporangií rozpustný pigment zlatohnědé barvy rozpustný pigment zlatohnědé barvy

Stanovení barev bylo prováděno· způsobem podle Maerze a Paula · (Maerz, A. .a M. Reg Paul 1950, · A dictionary of color, 2. vydání M. Grow — Hill Book Company, lne., New York).

Čísla živných prostředí .odpovídají ' označení podle Shirlinga a Gottlieba.

Vzhledem k těmto· vlastnostem byl uvedený . kmen zařazen do rodu Actihoplanes a nazván Actlonoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121.

V tabulce I byly uvedeny vlastnosti Actionoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC

311'21, při kultivaci na standardních prostředích, navrhovaných Shirlingem a Gottlibem (Int. }. Syst. Bacte-riol., 16, 313 až 340, 1966) a při . kultivaci v dalších prostředích doporučovaných Waksmanem (The Actionomycetes, sv. II, The Williams a Wilkins Co., 1961). Vlastnosti kultur byly stanoveny po 6 až 14 dnech kultivace .při teplotě 30 °C.

V tabulce 2 je uvedeno. využití uhlíkových zdrojů, využití bylo stanoveno. způsobem. podle Pridhama .a Gottliebs (Journal Bacteriol., 66, 107, 1948).

V tabulce 3 jsou uvedeny fyziologické vlastnosti nového kmene.

Kmen Actlonoplanes teichomyceticus nov.

sp. ATCC 31121 byl pěstován současně s následujícími kmeny: A. brasiliensís, A. mis198184 sourensis, A. uthaensis, A. filippinensis, А. italicus, A. armeniacus, A. deccanensis ATCC 21983, A. gerbadinensls ATCC 31049 a A. liguriae ATCC 31O4B.. Kmen bylo možno jasně odlišit od všech uvedených kmenů vzhledem к jeho morfologickým vlastnostem а к tvorbě pigmentu. Mimoto nový kmen způsobuje peptonizaci lakmusového mléka, což je jev, velmi zřídka sdílený s A. italicus, který je třešňově červeně zbarven. Z těchto důvodů se pokládá kmen A/8'327 za zcela nový kmen, jemuž byl udělen název Actionoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121.

TABULKA II

Využití uhlíkových zdrojů

Zdroj uhlíku	růst
inositol	—
fruktóza	4-4-
rhamnóza	—
mannitol	4-4-
xylóza	4-4-
rafinóza	—
arabinóza	4-4-
celulóza	—
salicin	±
sacharóza	4-4-
mannóza	4-4-
laktóza	±
glukóza (pozitivní kontrola)	4-4-
— = zdroj se nevyužívá ± = využití zdroje pochybné ++ = zdroj je dobře využit
TABULKA III
Fyziologické vlastnosti
hydrolýza škrobu	4-4-
tvorba HžS	' ++
chromogenní působení	4-4-
hydrolýza tyrosinu	—
hydrolýza kaseinu	4-4-4-
hydrolýza jablečnanu vápenatého	—
koagulace lakmusového mléka	—
peptonizace lakmusového mléka	4-
redukce dusičnanu	4--¼
zkapalnění želatiny	4-4-
rozklad celulózy	—

Jako příklad vhodného živného prostředí pro kultury v třepacích lahvích je možno užít následujícího prostředí, jehož složení je

udáno v g/litr.
extrakt z masa	3,0
trypton	5,0
extrakt z kvasnic	5,0
glukóza	1.0
rozpustný škrob	24,0
jablečnan vápenatý	4,0
destilovaná voda do	1000 ml

Láhve se uloží na 24 hodin na třepačku při 28 až 30 °C, načež se 1 litr takto vzniklé předběžné kultury užije к naočkování fermentorů s obsahem 10 litrů následujícího živného prostředí.

extrakt z masa	40' g
pepton	40 g
extrakt z kvasnic	10 g
chlorid sodný	25 g
sójová mouka	100· g
glukóza	500 g
uhličitan vápenatý	50 g
voda z vodovodu do	10 litrů

Fermentory se inkubují za aerobních podmínek a za stálého míchání při teplotě 28 až 30 °C. Po určitých obdobích se mikrobiologicky difúzí na agaru sleduje antibiotics ká účinnost při použití Staphylococcus aureus jako zkušebního mikroorganismu. К maximálnímu nahromadění antibiotika obvykle dochází po 72 až 96 hodinách pěstování.

Izolace teichomycinů a antibiotika 8327, faktorů В a C

Antibiotika jsou přítomna ve zfiltrovaném živném prostředí I v myceliu a je možno je izolovat organickými rozpouštědly známým způsobem.

Zfiltrované živné prostředí se upraví na pH 3,5 přidáním 8% kyseliny chlorovodíkové a pak se dvakrát extrahuje 30% butanolem. Organické extrakty se zahustí ve vakuu při teplotě 45 °C na 1/10 původního objemu, promyjí se malým množstvím vody při pH 3,5 a znovu se zahustí na malý objem. Koncentrovaný roztok se nechá stát v chladnu 10 až 15 hodin, čímž dojde ke vzniku sraženiny, která se oddělí filtrací. Zfiltrovaný roztok se vlije do velkého množství lehkého petroleje a získaná surová sraženina se oddělí filtrací. Mycelium se promyje vodou, při pH 3,5, suší se ve vakuu a pak se extrahuje směsí vody a acetonu v poměru 2:8. Acetonový extrakt se zahustí ve vakuu při teplotě 40 až 45 °C. Vodná fáze se upraví na pH 3,5 a 3x se extrahuje butanolem. Butanolové extrakty se slijí a promyjí malým množstvím vody při pH 3,5, načež se zahustí ýe vakuu na 1/20 původního objemu. Koncentrovaný roztok se nechá stát — = negativní výsledek + = slabě pozitivní výsledek +'+ = pozitivní výsledek +++ = silně pozitivní výsledek

Výroba a izolace antibiotika

Při výrobě antibiotika se předběžně pěstuje za aerobních podmínek kmen Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 v živném prostředí až do nahromadění většího množství mycelia při pH 6 až 8.

při teplotě 4 °C po dobu 10 až 12 hodin. Získá se surová sraženina, která se oddělí filtrací. Filtrovaný roztok se vlije do velkého množství lehkého petroleje, čímž se získá další sraženina.

Chromatografie, prováděná způsobem který bude uveden v tabulce 4, ukazuje, že produkty získané zchlazením koncentrovaných butanolových roztoků obsahují převážně teichomycin Ai, Аг а Аз, přičemž v největším množství je přítomna frakce Až, kdežto produkty, získané srážením inertním nepolárním rozpouštědlem, například lehkým petrolejem obsahují antibiotikum 8327, faktory В a C.

Antibiotikum 8327, faktory В a C je možno od sebe oddělit protiproudovým dělením a izolovat jako samostatná antibiotika. Rozpouštědla, kterých se užívá, sestávají ze směsi fosforečnanového pufru o koncentraci M/15 při pH 7,0 a n butanolu a hexanu v poměru 1:1:0,05.

Teichomycin Ai, Až а Аз se dělí sloupcovou chromatografií při - použití přípravku Séphadex LH-20 a směsi n-propanolu, ethylacetátu a hydroxidu amonného o koncentraci 0,2 N v poměru 10:7:7 jako· elučního činidla.

Frakce se analyzují chromatografií na tenké vrstvě na silikagelu při použití směsi n-propanolu, ethylacetátu a koncentrovaného hydroxidu amonného v poměru 2:1:2, detekčním mikroorganismem je S. aureus. Teichomycin Ai má Rf 0,48, teichomycin Až má Rf 0,10 a teichomycin Аз má Rf 0,0.

Frakce, obsahující jednotlivá antibiotika se zahustí na velmi malý objem, zředí methanolem a vlijí do velkého objemu acetonu, přičemž dojde к vysrážení ve formě bělavých amorfních prášků.

V následující tabulce 4 jsou uvedeny různé eluční systémy pro svrchu uvedená antibiotika.

TABULKA IV

Chromiatografie antibiotika 8327 faktoru B, faktoru C, teichotnycinu Ai, teichomycinu Az a teichomycinu Аз

Chromatografie na papíře Whatman č. 1, Faktor Faktor Teicho- Teicho- Teicho zviditelnění skvrn mikrobiologicky při použití Staphylococcus aureus

Eluční systém

1. butanol, nasycený fosfátovým pufrem¹ o koncentraci M/15 a pH 6,0

2. butanol, nasycený vodou s obsahem kyseliny p-toluensulfonové (2 %)

3. butanol, nasycený vodou s obsahem

2'% hydroxidu amonného

4. foisforečnanový pufr o koncentraci

M/15 a pH 6,0 nasycený butanolem

5. 20% vodný roztok chloridu amonného

6. butanol: methanol: voda v poměru . (40:1'0:20) s 0,75 % methyloranže

7. butanol: methanol: voda v poměru 40:10:20

8. etylacetát nasycený vodou

9. n-propanol: n-butanol: NH4OH

N(2:3:4)

Chromatografie na tenké vrstvě silikagelu

Eluční systém iřpropanol: ethylacetát: koncentrovaný hydroxid amonný (2:1:2)

В	c	mycin Ai	mycin Аз	mycin Аз
0,85	0,86	0,0	0,0	0,0
0,83	0,88	0,05	0,13	0,0
0,73	0,79	0,0	0,0	0,33
0,0	0,76	0,20	0,25	0,65
0,0	—	0,0	0,0	0,6.1
0,88	0,88	0,42	0,37	0,13
0,89	0,90	0,46	0,41	0,20
0,20	0,70	0,0	• 0,0	0,0
—	0,88	0,55	0,43	0,10
		0,48	0,10	0,0

,..01 . · 12

Biologické vlastnosti teichomycinu Ai, Az a - A3 a antibiotika 8327, faktoru B a . C

1. aktivita - in vitro Mi-nimálnfinhibiční koncentrace ' (^g/ml)

Kmen	Teichomycin- Ai	Teichomycin Az	Teichomycin A3	8327 faktor B	8327 faktor
Staphylococcus aureus ATCC 6588	0,02	0,5	2,0	. 2,0	. - -2,0
Staphylococcus aureus Tour	0,05	1,0	2,0	5,0	2,0
Staphylococcus aureus Tour + 30 %
séra skotu	50	1,0 ^?	.....’ 2,0	20	2,0
Streptococcus haemolyticus C-203	0,5	0,05	1,0	2,0	0,5
Diplococcus pneumoniae UC 41	0,5	0,1	2,0	2,0	2,0
Clostridium -perfringens ISS 3P543	2,0	0,05	5,0	10	50
Escherichia coli -SKF -12140	10	>100	>100	>100	>100
Próteus vulgaris X 19 H	20	>100	>100	'>100	>100
Pseudomonas -aeruginosa ATCC 10145	100	>100	>100	>100	>100
Candida - -albicans SKF 2270	>100	>100	>100	>100	>100
Trichophyton mentagrophytes SKF 17410	>100	>100	>100	>100	>100
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
ATCC 9360	>100	>100	N. D.	>100	100
Mycoplasma gallisepticum H 21 C.Z.B.	N. D.	>100	>100'	>100	>100
Neisseria gonorrheae	10	1,0	10	N. D.	10

N. D. = nebylo· stanoveno

Teichomyciny jsou účinné také proti bakteriím, které jsou odolné k užívaným- antibiotikům, jako je penicilín, tetracyklin, streptomycin, bacitracin, cefalosporin, rlfamycin, streptomycin, neomycin a chloramfenikol.

Ze svrchu uvedených vlastností antibiotik je zřejmé, že -tyto- . látky lze užít k různým účelům, například k léčbě -onemocnění u zvířat, desinfekci -osob a předmětů, mimoto jako růstové látky u zvířat, jakož i k dalším účelům, kde jde o - potlačení růstu pathogenních bakterií.

2. Akutní toxicita u myši

Teichomycin Ai 500 mg/k-g'( í.v.j

Teichomycin Až 1000 mg/kg ,(i ,'p.)

3. Účinnost - in vivo při experimentálních infekcích

Antibiotikum 8327 faktor. . B a faktor C nemají žádnou účinnost až do 80 mg/kg podkožně. Účinnost -ostatních složek směsi -je uvedena v následující tabulce.

Kmen

ED50 m.g/kg podkožně Teichomycin- Ai

Teichomycin - Az

Streptococcus haemolyticus 2,14

Staphylococcus- aureus

Diplococcus pneumoniae 11,5

0,1

3,97

0,57

Fyzikálně chemické vlastnosti teichomycinu Až

Teichomycin Až, získaný svrchu uvedeným způsobem je amorfní prášek, který po- čištění při použití - polystyrénové sulfonované pryskyřice (Dowex 50) ve vodném roztoku o- pH 4 má následující fyzikálně chemické vlastnosti.

1. Teplota tání 260% - za rozkladu

2. Elementární analýza

Následující procentuální složení je výsledkem tří různých analýz, z nichž byl vypočítán průměr.

...... .

54,20- - % C, - 5,70 -% Ή, 6,80- % - N, - 3,30 % Cl, 0 (jako rozdíl) 30 %.

3. Absorpční - spektrum v ultrafialovém světle (znázorněné na obr. 1) ..

Rozpouštědlo	Amax (nm)	F^{1 0/0} Ecm
fosfátový pufr 0 - pH 7,38	278	55
kyselina chlorovodíková 0,1 N	278	55
hydroxid sodný 0,1 N	297	74

Spektrum v ultrafialovém světle bylo zaznamenáno na přístroji Beckman DK-2.

4. Absorpční spektrum v infračerveném světle

Úplné spektrum v nujolovém mulu je znázorněno na obr. 2. Nejdůležitější absorpční pásy se nacházejí při následujících frekvencích (cm*¹):

'3300 (široký), 2900 (nujol), 1720 (inflexe), 1860 (inflexe), 1500, 14'55 (nujol), 1375 (nujol), 1235, 1190 — 930, 850, 720 (široký).

Absorpční spektrum antibiotika v infračerveném světle bylo zaznamenáno na přístroji Perkin Élmer 167.

5. Rozpustnost

Antibiotikum je: rozpustné ve vodě při pH 7,0, v hydrogehuhličitanu sodném, zředěných vodných roztocích hydroxidů alkalických kovů a ve směsích methanolu a vody, částečně rozpustné v methanolu a ethanolu, nerozpustné ve zředěných anorganických' kyselinách a v nepolárních organických rozpouštědlech.

6. Typické reakce

Fehling

Tollens

KM11O4

FeCh

H2SO4 koncentrovaná

Polin Ciooolteu Griess Antrone Schiff pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní tmavě fialové zbarvení •pozitivní negativní negativní negativní

7. Potenciometrícká titrace

Potenciometricky je možno zjistit ionizovatelnou funkci ve vodných roztocích o pKa = 4,9.

Zásaditou funkci je možno zjistit titrací kyselinou chloristou v dimethylsulfoxidovém roztoku. Ekvivalentní hmotnost stanovená tímto způsobem je 1170.

Fyzikální chemické vlastnosti telchomycinu Ai · _ ’

Teichomycin Ai, získaný svrchu uvedeným způsobem se dále čistí sloupcovou chromatografií na směsi silikagelu a celitu v objemovém poměru 1:1 při použití směsi n-butanol, kyselina octová a voda v poměru 8: :2:2. Jde o· amorfní prášek s následujícími fyzikálně chemickými vlastnostmi.

1. Teplota tání 220 °C za rozkladu.

2. Elementární analýza

Následující složení antibiotika v procentech je průměr ze tří stanovení:

52,9 % C, 7,6 % H, 5,26 % N, 32,5 % O, 0,96 % P, popel = 3,26 θ/ο.

3. Absorpční spektrum v ultrafialovém světle:

Při provádění tohoto spektra nedochází к absorpci v rozmezí 220 až 360 nm.

4. Absorpční spektrum v infračerveném světle:

Úplné spektrum v nujolovém mulu je udáno na obr. 3. Nejdůležitější absorpční pásy se nacházejí při následujících frekvencích (cm'¹): 1

3350 (široký), 2930 — 2850 .(.nujol), 2750 až 2000, 1720 (inflexe), 1670 (široký), 1620 (inflexe), 1560 (široký), 1460 a 1370 (nujol), 1340 (inflexe), 1260, 1240, 1155 (inflexe), 1120 (inflexe), 1040 (velmi široký), 970 (široký), 950 (inflexe), 900 (široký), 875, 805, 720.

Spektrum v Infračerveném světle bylo zaznamenáno· na přístroji Perkin Elmer 517.

5. Rozpustnost

Antibiotikum je rozpustné ve vodě při pH 7,0, ve vodném roztoku hydrogenuhličitanu sodného- ve zředěných roztocích hydroxidů alkalických k-o-vů ve vodě, v dimethylformamidu a dimethylsulfoxidu. Částečně rozpustné je v methanolu a ethanolu, nerozpustné je ve zředěných roztocích anorganických kyselin a v nepolárních organic- » kých rozpouštědlech.

6. Typické reakce:

Fehling

Tollens

КМПО4

Greiss

Antrone

Schiff

Molish i '

7. Molekulová hmotnost pozitivní pozitivní pozitivní negativní pozitivní negativní pozitivní

Stanovení molekulové hmotnosti bylo prováděno chromatografií na přípravku Sephadex G 75 a byly získány tyto hodnoty:

000 ve fosfátovém pufru o pH 7,38 30 000 v citrátovém pufru -o pH 4,4.

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

1. Způ'sO'b výroby nových antibiotik teichomycinu Az a teichomycinu Ai s následujícími fyzikálně chemickými vlastnostmi, teichomycin ' Az — teplota tání 260 °C za rozkladu, — elementární analýza, stanovená jako průměr ze tří samostatných stanovení 54,20' % C, 5,70 % H, 6,80 % N, 3,30 .% Cl, 0 (jako. rozdíl) = 30 %, — absorpční spektrum v ultrafialovém světle rozpouštědlo

Amax .(nm)

fosfátový pufr pH 7,38 278 55 kyselina chlorovodíková 0,1 N 278 53 hydroxid sodný 0,1 N 297 74

— spektrum v infračerveném světle v nujo- lové suspenzi má nejdůležitější absorpční pásy .při ' následujících frekvencích •(cm'¹),

3300 (široký), ~ 2900 (nujol), 1720 (inflexe), 16'60, 1600 (inflexe), ~ 1500, 1455 (nujol), 1375 (nujol), 1235, ' 1190 — '930, 850, 720 ' (široký), — rozpustnost je dobrá ve vodě při pH 7,0, ve vodném roztoku . hydrogenuhličitanu solného, ve zředěných vodných roztocích hydroxidů alkalických kovů a ve směsi methanolu a vody, částečně rozpustné je antibiotikum v methanolu a ethanolu, nerozpustné je ve zředěných anorganických kyselinách a v nepolárních organických rozpouštědlech, —- typické reakce

Fehling

Tollens

KMnOi

FeC13

H2SO4 koncentrovaná

Folin Ciocolteu Griess Antrone Schiff pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní tmavě fialové zbarvení pozitivní negativní negativní negativní — při . potenciometrické titraci bylo možno prokázat ionizovatelnou funkci ve vodném roztoku při pKa 4,9, zásaditou funkci bylo· možno dokázat titraci kyselinou chloristou v dimethylsulfoxidovém roztoku, ekvivalentní hmotnost, stanovená tímto· způsobem je 1170, — při chromatografii na papíru Whatman č. 1 bylo možno. při . použití následujících systémů rozpouštědel zjistit uvedené hodnoty Rf butanol nasycený M/16 fosfátovým pufrem o pH 6,0 0,0 butanol, nasycený vodou s obsahem 2 % kyseliny p-toluensulfonové 0,13 butanol, nasycený vodou s obsahem 2 % hydroxidu amonného0,0 fosfátový pufr o· koncentraci

M/15 při pH 6,0, nasycený butanolem'0,25

20% vodný roztok NH4CI0,0 butanol: methanol: voda v poměru 40:10:20 s' 0,75 % methyloranže0,37 butanol·: : voda v poměru . 40:10:200,41 ethylacetát nasycený vodou0,0 n-propanoo: o-butanol: .ΝΉ4ΟΗ

10 N 1-2:-3:4)0,43 při chromatografii na tenké vrstvě . na silikagelu . byla při . použití n-propanolu, ethylacetátu a . koncentrovaného hydroxidu amonného. v poměru 2:1:2 Zjištěna hodnota Rf '= 0,1, teichomycin Ai — teplota . tání 220 °C za . . rozkladu — elementární analýza jako průměr ze .. tří samostatných stanovení

52,9 % C, 7,6 % H, 5,26 % N, 32,5 '% O, popel = 3,26' Ψ0, — absorpční spektrum v ultrafialovém světle nemá žádný pás v . rozmezí 220 až 360 nm, — absorpční spektrum . v infračerveném světle v nujolovém mulu má následující důležité absorpční pásy při uvedených frekvencích ' (cm*¹)

3350' (široký), 2930 — 2850 (nujol), 275'0 až '2000, 1720 . (inflexe), 1670 (Široký), 1620 ' (inflexe), 1560 (široký), 1460- a 1370 (nujol), 1340 (inflexe), 1260, 1240, 1155 (inflexe), 1120 (inflexe), - 1040 .(velmi široký), 970 '' (široký), '950 (inflexe), 900. (široký), ' 865, 805, 720, — rozpustnost antibiotika je dobrá ve vodě při pH ' 7,0, ve vodném roztoku . hydrogenuhličitanu sodného, ve zředěných vodných roztocích hydroxidů alkalických kovů, v dimethylformamidu a dimethylsul198184 foxldu, částečně rozpustné je antibiotikum v methanolu a ethanolu, nerozpustné je ve zředěných anorganických kyselinách a nepolárních organických rozpouštědlech, — typické reakce

Fehllng Tollens, KMnOí Griess Antrone Schlff Molish pozitivní pozitivní pozitivní negativní pozitivní negativní pozitivní — molekulová hmotnost podle stanovení chromatografií na Sephadexu G 75 má hodnotu 20 000 při použití fosfátového pufru o pH 7,38 a 30 000 při použití citrátového pufru o pH 4,4, — při chromatografii na papíře Whatman č. 1 bylo možno zjistit při použití uvedených elučních systémů následující hodnoty Rf:

butanol, nasycený M/15 fosfátovým pufrem o pH 6,00,0 butanol, nasycený vodou s obsahem 2 % kyseliny p-toluensulfonové0,05 butanol, nasycený vodou s obsahem 2 % hydroxidu amonného0,0 fosfátový pufr M/15 o pH 6,0, nasycený butanolem0,20

20%' nasycený roztok NHdCl0,0 butanol: methanol: voda v poměru 40 : 10 : 20 s 0,75 °/o methyloranži0,42 butanol: methanol: voda v poměru

40 : 10 : 200,46 ethylacetát nasycený vodou0,0 n-propanol: n-butanol: NHiOH .10 N(2: 3:4)0,55 ia — při chromatografii na tenké vrstvě silikagelu bylo zjištěno při použití elučního systému n-propanol : ethylacetát : koncentrovaný hydroxid amonný v poměru 2 : 1: 2 Rf 0,48, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Actinoplanes teichomyceticus nov. spec ATCC 31121 za aerobních podmínek ve vodném živném prostředí s obsahem využitelného zdroje uhlíku, využitelného zdroje dusíku a anorganických solí a po nahromadění antibiotika v živném' prostředí se antibiotikum izoluje a rozdělí na teichomycin Ai a teichomycin A2.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kultivace provádí při teplotě 25 až 35 °C.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kultivace provádí 72 až 120 hodin.
4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se , tím, že se antibiotikum extrahuje halogenovanými uhlovodíky o 1 až 4 atomech uhlíku nebo alkanoly o 4 až 6 atomech uhlíku.
5. Způsob podle bodu 1 a 4, vyznačující se tím, že se antibiotikum extrahuje butanolem.
6. Způsob podle bodů 1 a 4, 5 vyznačující se tím, že se butanolový extrakt zahustí ná 1/10 až 1/20 původního objemu a pak se zchladí, čímž se získá sraženina, sestávající ze směsi telchomycinu Ai, Аг а Аз.
7. Způsob podle bodů 1 a 4 až 6, vyznačující se tím, že se teichomycin Ai, Аг а Аз od sebe oddělí sloupcovou chromatografií.
8. Způsob podle bodů 1 a 4 až 7, vyznačující se tím, že se teichomycin A2 dále čistí při použití polystyrénové sulfonované pryskyřice ve vodném roztoku o pH 4..
9. Způsob podle bodů 1 a 4 až 7, vyznačující se tím, že se teichomycin Ai dále čistí chromatografií na sloupci kysličníku křemičitého ve směsi s celitem, přičemž jako elučního činidla se užije směsi n-butanolu, kyseliny octové a vody.