PL92972B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego zwiazku o dzialaniu antybiotyczijym o- kreslanyim ponizej numerem 30504 RP, jego soli z metalami, soli z zasadami azotowymi. 30504 RP przedstawia soba szczególne korzysci, zwiazane z je¬ go aktywnoscia przeciw bakteriom cocci, wykazy¬ wana równolegle z aktywnoscia przeciwbakteryjna i aktywnoscia przeciwmalaryczna. 30504 RP moze byc wytworzony ze srodowiska dobranych kultur nowego mikroorganizmu, który bardziej szczególowo bedzie okreslony ponizej, na¬ lezacego do gatunku Streptomyces i okreslonego pod nazwa Streptomyces gallinarius DS 25881 (NRRL 5.785). 30504 RP wykazuje szereg znamien¬ nych wlasnosci fizyczno-chemicznych: — wyglad: bialy drobnokrystaliczny proszek — rozpuszczalnosc: 30504 RP jest latwo rozpusz¬ czalny w rozpuszczalnikach chlorowcowych ta¬ kich, jak chlorek metylenu i chloroform, w al¬ koholach takich, jak .metanol i w dwumetylofor- mamidzie, jest on wzglednie rozpuszczalny w acetonie, octanie etylowym, slabo rozpuszczalny w heksanie i praktycznie nie rozpuszczalny w wodzie (oznaczenia zgodnie z Farmakopea Fran¬ cuska wydanie IX-e, czesc druga, str. 13 (1972)). — sklad procentowy: 30504 RP zawiera wegiel, wo¬ dór i tlen. Jego sklad procentowy jest bliski: C-69,4°/o, H-9,0X, 0-21,0% — równowaznik chemiczny: 30504 RP jest zwiaz¬ kiem o charakterze kwasowym, którego równo- waznik chemiczny (okreslony w roztworze w dwumetyloformamidzie przez miareczkowanie zasada czterobutyloaimonowa) wynosi 830. — temperatura topnienia (oznaczona metoda Kof- lera): — bliska 200°C. — polaryzowalnosc: okreslona w roztworze ltyo w metanolu. Polaryzowalnosc wlasciwa 30504 RP jest bliska: [«]» = -79 [alg, = -188° [«]», = -378° — widmo w ultrafiolecie: 30504 RP nie wykazuje charakterystycznego widma absorpcji w ultrafio¬ lecie. — widmo w podczerwieni: (oznaczenie w tabletce w mieszaninie z KBr) widmo to przedstawione jest na wykresie przedstawionym na rysunku, na którego osi odcietych odlozono dlugosci fal, wyrazone w mikronach (skala górna) i w licz¬ bach falowych w cm-1 (skala dolna). Na osi rze¬ dnych odlozono gestosci optyczne.W tabeli 1 ujete sa podstawowe pasma absorpcji w podczerwieni wyrazone w liczbach falowych (cm-1). Umieszczone przy liczbach skróty maja na¬ stepujace znaczenie: bm — bardzo mocne; m — mocne; sr — srednie; s — slabe; bs — bardzo sla¬ be; r — rozciagniecie. oznaczenie chromatograficzne: 30504 RP moze byc idJeotyfikiOiwany iw dirodize chromiatogiratfliii rwyjs-tejpuja- cej cienkowarstwowej na krzemionce przy zastoso¬ waniu dwóch ukladów rozpuszczalników: 9297292972 \ Tabela 1 3440 m 3090 r 2960 m 2938 m 2880 m 2855 r 2640 bs 2060 bs 1945 bs 1900 bs 1785 r 1705 m 1632 sr 1622 r 1535 bs 1458 m ¦¦- 1405 r 1380 m 1325 st 1315 r 1295 r 1272 sr 1225 s 1200 bs 1172 sr 1140 sr 1115 r 1100 r 1085 m 1070 r 1045 r 1038 m 1012 sr 980 m 958 m 935 sr 1 .. 915 sr. 880 s 8§5 bs 845 bs 825 s 792 sr 775 s 735 s 700 s 675 r 655 s 630 r 615 sr 565 r .525 sr 495 sr 465 bs 445 s ¦ octanu etylu (cykloheksan/woda/butanol w sto¬ sunku objetosciowym 50/50/25/5 : Rf=0,45 chlorek metytaiu/meitanol w stosunku objeto¬ sciowym 96/4 : Rf=0,55 aktywnosc bakteriostatyczna in vitro: 30504 RP wykazuje aktywnosc bakteriostatyczna szczególnie w stosunku do niektórych bakterii, barwiacych sie metoda Grama.Tabela 2 1 Organizmy testowane Staphylococcus aureus, szczep 209P-ATCC 6538P Staphylococcus aureus, szczep Smith Sarcina Lutea — ATCC 9341 Staphylococcus feacalis — ATCC 8043 Staphylococcus pyogenes hemo- lyticus, szczep Dig (Instytut Pasteura) Diplococcus pneumoniae, szczep Til (Instytut Pasteura) i Neisseria calarrhalis (A 152, Instytut Pasteura) Bacillus suibtilis — ATCC 6633 Bacillus cereus — ATCC 6630 Mycobacterium species — ATCC 607 Escherichia coli — ATCC 9637 Shigella dysenteriae, Shiga L (Instytut Pasteura) Salmonella paratyphi A (szczep Lacase, Instytut Pasteura) Salmonella Schottmuelleri (paratyphi B) szczep Fougenc, Instytut Pasteura) Proteus vulgaris Pseudomnonas aeruginosa | Minimalne stezenie ba- kteriostatyczne Mg/cm3 0,2 0,5 0,9 0,1 0,2 0,05 6,0 0,2 0,1 6 pow. 150 pow. 150 pbw. 150 | pow. 150 pow. 150 pow. 150 | 40 45 50 55 60 65 Aktywnosc bakteriostatyczna 30504 RP w stosun¬ ku do pewnej liczby szczepów bakteryjnych okreslo¬ na zostala metoda rozcienczen, popularnie do tego celu stosowana. Dla kazdego szczepu okreslono naj¬ mniejsze stezenie zwiazku aktywnego, który *w o- kreslonych warunkach uniemozliwia widoczny rozwój bakterii w stosowanym bulionie odzywczym.Wyniki oznaczen zgromadzone sa w ponizszej tabeli 2, w której minimalne stezenia bakteriostaityczne wyrazane sa w mdkrograimach zwiazku ha centy¬ metr szescienny badanego srodowiska. — toksycznosc: dawka letalna 50§/« (DLW) wynosi w stosunku do kurczat 85 mg/kg wagi ciala przy dawce jednorazowej, — aktywnosc przeciw bakteriom cocci: aktywnosc te okreslono w stosunku do pisklat kurzych, za¬ razonych zarazkami Elimeria tennella i Elimeria acervulina. Aktywnosc 30504 RP, podawanego z pozywieniem, byla rejestrowana w stezeniach nietoksycznych, zawartych pomiedzy 0,005°/« i 0,04§/e wagowych zwiazku w pozywieniu. — aktywnosc przeciwmalaryczna: 30504 RP wyka- . zuje aktywnosc przeciwmalaryczna podczas za¬ kazen aksperymentalnych plasmodium myszy i pisklat kurzych.Organizmem, wytwarzajacym antybiotyk 30504 RP, jest szczep Streptomyces, który zostal wyod¬ rebniony z próbki ziemi, pobranej w Indiach, któ¬ rej przyporzadkowano numer DS 25881. Próbka tego organizmu zdepenowana zostala w Northern Regional Research Laboratory U.S. Departament oi Agriculture w Peoria 111 (Stany Zjednoczone), gdzie zostal zarejestrowany pod numerem NRRL 5785.Organizm ten, majacy cechy nie pozwalajace na identyfikacje z zadnym opisanym juz organizmem, powinien byc traktowany jako organizm calkiem nowy i okreslony zostal nazwa Streptomyces gal- linarius DS 25881.Wyodrebnienia tego szczepu dokonano zgodnie z ogólna metoda, polegajaca na umieszczeniu nie¬ wielkiej ilosci ziemi w zawiesinie w sterylnej wo¬ dzie destylowanej, na rozcienczeniu zawiesiny do •róznych stezen i na posianiu (malej objetosci z kazdego rozcienczenia na powierzchni plytki Pe- triego, zawierajacej scieta pozywke. Po kilkudnio¬ wej inkubacji w 26°C, pozwalajacej na rozwój mi¬ kroorganizmów, kolonie, które maja byc izolowane i w stosunku do których maja byc prowadzone ba¬ dania, sa przeszczepiane na stale pozywki w celu otrzymania kultur bardziej obfitych.Streptomyces gallinarius DS 25881 tworzy prze- trwalniki cylindryczne lub owalne o wymiarach 1,0 do 1,2|jl/0,8 do 1,0[a, grupujace sie w grona: nitki przetrwalników, swobodne i gietkie zwijaja sie cze¬ stokroc na koncach, lub przyjmuja postac lekko za¬ krzywiona, albo tworza spirale o jednym lub cza¬ sami kilku zwojach.Wedle sposobu. wytwarzania zarodników szczep ten mozna sklasyfikowac w grupie Retinaculum — Apertum Klasyfikacji Pridhama.Streptomyces Gallinarius DS 25881 dobrze rozwi¬ ja sie w 26°C, jak równiez w 37°. Natomiast nie rozwija sie w 50°C. Jego micella zarodnikowa jest zabarwiona na szaro, zabarwienie micelli wegeta¬ tywnej zmienia sie w zasadzie w zaleznosci od sro-5 92972 6 dowiska, w którym zyje kultura, od zóltego lub zólto-szarego do zólto-brazowego lub brazowo-zólte- go. W wyniku specyficznego wytwarzania rozpusz¬ czalnego barwnika fioletowo-rózowo-brazowawego na pozywkach Hickeya i Tresnera powstaje zabar¬ wienie calosci srodowiska, na którym hodowana jest kultura, lub tez obserwowano produkcje rozpusz¬ czalnego barwnika z reguly malo intensywnego, zmieniajacego sie do zólto-brazowego lub szaro- orajzowawego do brazowo-zóJtego.W kulturach wytworzonych w 26°C szczep prze¬ jawia nastepujace cechy biochemiczne: - produkcja melaniny ¦ produkcja siarkowo¬ doru ¦ tyrozinaza ¦ uplynnianie zelatyny -rozklad celulozy produkcja azotynów z azotanów hydroliza amidonu hodowla kultur na mleku odtluszczonym - nie wystepuje - nie wystepuje ¦ nie wystepuje ¦ wystepuje wystepuje wystepuje bardzo in¬ tensywnie, zarówno w bulionie, zawieraja¬ cym azotany, jak i w pozywkach syntetycz¬ nych wystepuje peptonizacja bez koa¬ gulacji, bardzo- nie¬ wielkie obnizenie pH.Cechy kultur Streptomyces gallinarius DS 25881 zgromadzone sa w podanej tabeli 3. Sa to kultury, które osiagnely znaczny stopien rozwoju, to zna¬ czy okolo 2—3 tygodni w 26°C. Cechy charaktery¬ styczne byly obserwowane przy hodowli na pozyw¬ kach stalych i bulionowych, zwykle stosowanych podczas okreslania cech morfologicznych szczepów Streptomyces. Kultury na pozywkach stalych ho¬ dowane byly na pozywce skosnej. Pewna liczba po¬ zywek stosowanych kultur przygotowana byla zgod¬ nie ze skladami podanymi w "The Actinomycetes" S.A. WAKSMAN str. 193-^197, Chronica Botanica Company, Waltham Mass. USA 1950, w tym przy¬ padku oznaczone sa one litera W i numerem takim, jakim opatrzone zostaly w "The Actinomycetes".Inne pozywki przygotowane zostaly wedlug na¬ stepujacych zródel lub skladników: ref. A — "Hickey and Tresner's Agar" — T.G.Pridham i in. — Antibiotics Annual 1967^1957 s. 950, ref. B — "Benetfs Agar" — S.A. WAKSMAN — The Actinomycetes, tom 2, s. 331 nr 30 — the Williams and Wilkins Comp., Balti¬ more 1961, ref. C — Sklad W-23 z dodatkiem 2«/o zelatyny, ref. D — "Yeast Extract Agar" — T.G. Pridham i in. — Antibiotics Annual 1956—1957 s. 950, ref. E — "Tomato Paste Oatmeal Agar" — T.G.Pridham i in. — Antibiotics Annual, 1956—1957, s. 950, ref. F —"Melanin Formation medium" — S.A.Wakaman — The Actinomycetes, tom 2, s. 333 nr 42 — The Williams and Wilkins Comp., Baltimore, 1961, ref. G — W.E. GRUNDY i in. — Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952, ref. H — "Inorgamcs Salts — Starch Agar" — T.G. Pridham i in. Antibiotics Annual 1956—1957, s. 951, ref. I — odpowiada skladowi W-l, w którym 3§/t sacharozy zastapiono l,5*/§ glukozy, ref. J — odpowiada skladowi W-l, w którym 3*/t sacharozy zastapiono 1,5% gliceryny, io ref. K — odpowiada skladowi W-18, w którym 3*/§ sacharozy zastapiono l,5#/t dodat¬ kiem glukozy, ref. L — odpowiada skladowi W-18 bez dodatku sacharozy. Do pozywki zanurzono czes- is ciowo paseczki bibuly filtracyjnej, iref. M — „Manual of Methods for Pure CuMure Study of Bacteria" Society of American Bacteriologists — Geneva N. 4 II 50—18, ref. N — „Zelatyna kompletna" — przygotowana zgodnie ze wskazaniami, zawartymi w "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" — Society pf Ame- * rican Bacteriologists" — Geneva, N.Y.II 50—18, ref. P — Mleko w proszku — handlowe — odtwo¬ rzone zgodnie ze wskazówkami produ¬ centa, ref. Q — Pozywka, stosowana w badaniach nad produkcja H,S przez H.D. TRESNERA i F. DANGA — Journal of Bacteriology 76, 239—244, 1958.Streptomyces Gallinarius DS 25661 wykazuje ze¬ spól cech, który nie odpowiada dokladnie cechom zadnego z dotychczas opisanych szczepów i dlate¬ go powinien byc uwazany jako organizm nowo od¬ kryty.Z pomiedzy organizmów, opisanych w „The Avti- viomycetes" (t. 2, S.A. WAKSMAN, The Wiiliiams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) oraz w „Bergeyls Manual of Determinative Bacteriology (7-me wydanie, The Williams and Wilkins Compa¬ ny, Balitimore,1967), gatunkiem, do którego mozna- by go przyrównywac jest Streptomyces hygrosco- picus. Podobnie bowiem, jak ten ostatni, S. galli¬ narius DS 25881 wytwarza nucelle wegetatywna w zasadzie zabarwiona na zólto lub zólto-szarawo do brazowej lub brazowo-zóltej i szarej mieceUe prze- trwalmilkowa. Na podlozu organicznym nie produ¬ kuje rozpuszczadnego barwnika melaninowego, nie produkuje HjS, zwolna rozklada zelatyne, na któ¬ rej nie wytwarza rozpuszczalnego barwnika.Na wszystkich podlozach pdfcywkowych, zarówno syntetycznych, jak i organicznych albo nie wytwa¬ rza barwnika rozpuszczalnego albo wytworzony barwnik jest bardzo slaby o zabarwieniu, zmienia¬ jacym sie od zóltoHbrazowaiwego lub szano-brunat- nego do brazowo-zóltego. Ponadto S. gallinarius DS 25881 wykazuje specyficzna wlasciwosc wytwarza¬ nia na jednej z pozywek, na której byl hodowany (zelatyna Hickeya i Tresnera) rozpuszczalnego bar¬ wnika fioletowo-rózowo-brazowawego, okreslonego przez HwD. TRESNERA i E.J. BAOKUSA — (Ap¬ plied Microbiology 4, 243—250, 1056) jako typowy dla licznych szczepów, nalezacych do gatunku S. hygroscopicus i -wystepujacy w zaleznosci od szcze- 40 45 50 55 6092972 7 8 Tabela 3 Pozywka \ * ~~ Zelatyna Hickeya i Tresnera (ref. A) Zelatyna Bennetta (ref. B) Zelatyna Emersona Zelatyna z wy¬ ciagiem drozdzy wg Pridhama (ref. D) Zelatyna z maka owsiana i eks¬ traktem pomidoro¬ wym wg Pridhama (ref. E) ' Zelatyna glukozo- wo-peptonowa (W-6) Zelatyna pozyw- kowa (W-5) Zelatyna z eks¬ traktem tyrozyny dla produkcji me- laniny (ref. F) Zelatyna z jabl- czanem wapnia wig Krasinskiego (ref. G) Zelatyna z albu¬ mina z jaj.(W-12) Zelatyna z gluko¬ za i asparagina (W-2) Zelatyna z glice¬ ryna i asparagina (W-3) Rozwój kultury 1 2 1 dobry 'dosc diobiry dobry dlosc diobiry dosc [dobry dosc dobry umiairkio- | (wany bardzo umiarko¬ wany slaby bardzo islaby umiarko¬ wany ydosc dobry Micella wegetatywna (M.v.) lub wyglad kultury 1 3 1 wyglad jasno- brazowo-zólty do brazowo- ifiioleitu M.v. zólta .M.v. zóltio- brazowawa wyglad zólbo- brazowy M.v. zólto- nbrazowawa M.v. zólta M.v. brajzoiwlo1- -zólta M.v. brazowo- -zólta M.v. zólto- Hbrazowawy slaba M.v. zólto- Hbrunatnawa 'slaba M.v. jaisno- Hzólta M.v. zólta Aparat oddecho¬ wy (dot. formy wegetatywnej i przetrwaOni- kowej) 1 * f Jasno do ciemno szary dobirze mozwiniety Bialawy do sza¬ rawego Bairdzo slabo rozwiniety Bialawy Bardzo slabo rozwiniety Bialawy do sza¬ rawego Bardzo urnliiair. irozwiinaejty Bialawy do sza¬ rawego Bardzo umiar¬ kowanie rozwiniety Bialawy bardzo slabo .rozwiniety brak (bialawy, sla¬ dowy) Bialawy, sladowy brak brak' Bialawy, bardzo slabo rozwiniety Bialawo-szarawy do ciemno szara¬ wego. Bardzo umiarkowanie rozwiniety | Barwnik rozpuszczalny 1" ~~S 1 fioletowo1- -TÓZOWO- -brazowy zólto- -brunatny brazowo- HZólty, slaby brazowawy islaby brak lub brazowawy, islaby zólto^brazo- wawy, bardzo slaby brak brazowo-zólty slaby brak brak brak brazowo- -zóltawy slaby Uwagi i wlasciwosci biochemiczne 1 ** 1 Zarodniki cylindry- dryczne o rozmia- J rach 1,0 do jl,2 \i (0,8 do 1,0 \i, gru¬ pujace sie w gro¬ na: nitki przetrwa- lników swobodne i gietkie zwijaja sie czestokroc na kon¬ cach lub przyjmu¬ ja postac lekko za¬ krzywiona albo tworza spirale o je¬ dnym lub czasem kilku zwojach Produkcja melani- ny: brak (odczyty wykonane zgodnie z zaleceniami au¬ tora)92972 1 1 Zelatyna z amido- nem i solami mi¬ neralnymi wg Pridhama (ref. H) 1 Zelatyna z amido- nem i azotanem (W-10.) Zelatyna synte¬ tyczna Czapka z sacharoza (W-l) Zelatyna syntety¬ czna Czapka z glukoza (ref. I) Zelatyna syntety¬ czna Czapka z gli¬ ceryna (ref. J) Bulion z amido- nem i azotanami (W-19) Bulion syntetycz¬ ny Czapka z sa¬ charoza (W-18) Bulion syntetycz¬ ny Czapka z glu¬ koza (ref. K) Bulion syntetycz- | ny Czapka z celu- 1 loza (ref ,L) Pozywka buliono¬ wa z azotanami Zelatyna czysta 12% (ref. N) Hodowla na ziem¬ niakach (W-27) • 1 2 -umiarko¬ wany bardzo umiarko- twany slaby slaby bardzo umiarko¬ wany umiarko¬ wany bardzo slaby bardzo ¦slaby bandzo . slaby umiarko¬ wany dobry dobry 1 3 wyglad torazowo- -zólty M.v. zólto- -jasnio^brazo- wawa M.v. zólto- -szarawa slaba M.v. zólto- -szarawa slaba M.v. zólto- Hbrazowawa slaba pasma szarawe do brunatnych kulituira klaczko- wata bialo- -szarawa kulstura klaczko- wata bialo- -szarawa kultura klaczko- 1 watabialo- -szarawa pierscien brazo- wo-zóltawy M.v. brazowo- -zóDty M.v. forazowo- -jasno-zólta 1 4 Bialawy do jasno szarego i ciemno szary umiarkowanie .rozwiniety Bialo-szarawy bardzo slabo rozwiniety brak (brak bialawy. sladowy bialawy bardzo umliiarkowainie irozwdniety i brak Ibrak szarawy bardzo slabo irozwiniety nai bilbule zanu¬ rzonej wbulionie ibrak bialawy, sladowy bialo-szarawy sladowy 1 5 sizaro-fora- ziowy slaby brazowo-zólty bardzo slabo irozwdniety Ibrak lub zóltawy slaby brak lab zóltawy bardzo slaby zólto-forazo- wawy slaby (brak brak Ibrak (brak 1 ibrak ... (brak brazowawy islaby c.d. tabeli 3 1 6 " | — hydroliza ami¬ dami: dodaitnia — zarodniki "cy¬ lindryczne do o- walnych o wy¬ miarach 1,0 do 1,2 [l (0.8 do 1,0 H Zarodniki, grupu¬ jace sie w gro¬ nach: gietkie i swobodne nitki za¬ rodników zwijaja sie czestokroc na koncach lub przyj¬ muja postac lek¬ ko zakrzywiona al¬ bo tworza spirale o jednym lufo kilku zwojach hydroliza amidonu: dodatnia '"'" 1 produkcja azoty¬ nów: bardze wy¬ razna produkcja azoty¬ nów: bardzo wy¬ razna produkcja azoty¬ nów: bardzo wy¬ razna rozklad celulozy: dodatni produkcja azoty¬ nów: bardzo wy¬ razna dodaitnia, umdarko- [ wana . •92972 11 12 i Mleko odtluszczo¬ ne (ref. P) Zelatyna Tresne- ra i Danga (ref. Q) 2 dobry umdarko- wany 3 pierscien zólto- -ga&no--brazo¬ wawy "M.v. brazowo- -zólta 4 brak brak • 6 brak c.d. tabeli 3 6 peptonizacja bez koagulacji — niewielkie ob¬ nizenie pH, kto- | siaca zmniejszy¬ lo sie od 6,2 do ,8 produkcja HjS: brak (odczyty wy¬ konane zgodnie z zaleceniami auto¬ rów) pu na róznych podlozach, w kazdym razie rózni sie on od tego gatunku w 2 z 3 cech podstawowych, okreslajacych go: z jednej strony przez postac swo¬ ich przetrwalników, która nie odpowiada prze- trwalnikom gatunku S. hygroscopicus, z drugiej strony przez nietworzenie w zadnym przypadku w micelH przetrwalnikowej czarnych blyszczacych stref, charakterystycznych dla gatunku S. hygrcsco- picus.S. gallinarius DS 26881 móglby byc równiez po¬ równywany ze Streptomyces aureofacdens, który równiez nie wytwarza melaniny, w zasadzie tworzy mdcelle wegetatywna zólta do zólto-pomaranczowej lub brazowa, oraz szara micelle zarodnikowa, po¬ nadto S. aureafaciens na licznych podlozach nie wytwarza barwnika rozpuszczalnego — a co z tego wynika — gidy to czyni, daje barwniki rozpusz¬ czalne o zabarwieniu zóltymi do brazowego z re¬ guly dosyc slabe. W niektórych przypadkach mi- ceUa wegetatywna S. aureofacies zabarwiona jest na kolor brajzowo-czerwony do purpurowego, lecz w tych przypadkach chodzi o barwnik, nie rozprze¬ strzeniajacy sie w podlozu i który z tego powodu mie moze odpowiadac rozpuszczalnemu barwnikowi fioletowo-rózowo-brazowawemu, który moze byc wytwarzany przez S. galflonarius.Ponadto S. aureofaciens nie plyinnia zelatyny, na której wytwarza kremowa micelle wegetatywna i nie powoduje koagulacja ani peptonizacji mleka odtluszczonego, podczas gdy S. gajlinarius DS 26881 uplynnia zelatyne, na której tworzy brazowonzólta micelle wegetatywna oraz powoduje wyrazna i sy¬ stematyczna peptonizacje odtluszczonego mleka. Wi¬ dac wiec wyraznie, ze S. gallinarius DS 26881 róz¬ ni sie równiez i od tego gatunku.Zdolnosc S. gallinarius DS 26881 do korzystania z róznych zródel wegla lub azotu, zapewniajacego rozwój organizmu, okreslona zostala zgodnie z za¬ sadami metody Bridhama i Gottlieba (J. of Bact. 56 107—M4, 1946). Stopien rozwoju obserwowano na pozywce podstawowej, wskazanej przez autorów, z zastapieniem badz glukozy innymi zródlami we¬ gla poddawanymi próbom, badz siarczanu amono¬ wego badanymi zródlami azotu. Wyniki badan za¬ warte sa w ponizszej tabeli 4.Sposób wytwarzania 30504 RP polega zasadniczo na hodowli Streptomyces gaUkiarius DS 25881 na 40 55 60 odpowiednio dobranej pozywce i warunkach; oraz na wyodrebnieniu produktu, wytworzonego podczas hodowli.Hodowla kultur Streptomyces gaUinarlus DS 26881 moze byc prowadzona dowolna metoda w wa¬ runkach tlenowych na powierzchni lub wewnatrz cieczy. Ta ostatnia metoda jest zalecana ze wzgle¬ du na wygode. W tym celu stosowane sa rózno¬ rodne typy aparatów, zwykle stosowanych w prze¬ mysle fermentacyjnym.W szczególnosci mozna przyjac nastepujacy eta¬ powy przebieg procesu wytwarzania: magazyn Streptomyces gallinarius DS 25881 hodowla na zelatynie hodowla w probówkach na wytrzasarce szczepienie kultury w tankach fermentacyjnych produkcja w tankach Srodowisko, którym zachodzi fermentacja musi zawierac zasadniczo jedno zródlo wegla i jedno zró¬ dlo azotu przyswajalnego, skladniki mineralne, a w szczególnosci chlorki, oraz ewentualnie czynniki, wspomagajace rozmnazanie. Wszystkie te skladniki moga byc dostarczane w postaci dobrze okreslonych zwiazków lub mieszanin zlozonych, badz tak, jak wystepuja one w produktach biologicznych rózno¬ rodnego pochodzenia.Jako zródla przyswajalnego wegla mozna sto¬ sowac weglowodany takie, jak glukoza, sacharoza, maltoza, dektryny, amddon lub inne substancje we¬ glowodorowe, jak na przyklad gliceryna lub jak niektóre kwasy organiczne,ma przyklad kwas mle¬ kowy lub cytrynowy. Niektóre oleje zwierzece lub roslinne, jak oleij zwierzecy lub olej sojowy, moga z powodzeniem zastapic podane powyzej zródla we¬ glowodórowe luto tez moga byc stosowane jako do¬ datek.Zródla przyswajalnego azotu, które moga byc sto¬ sowane, sa bardzo róznorodne .Moga to byc zwiaz¬ ki chemiczne bardzo proste, jak sole amonowe mi¬ neralne lub organiczne, mocznik, niektóre kwasy zawierajace grupe aminowa. Azot moze byc rów¬ niez dostarczany w postaci zwiazków zlozonych, za¬ wierajacych azot w zasadzie w formie proteino-13 92972 Tabela 4 14 Badane zródlo wegla i D-rytooza D-ksyloza L-arabinoza L^ramnoza D-glukoza D-galaktoza Dnfruktoza D-mannoza L-sorboza laktoza maltoza sacharoza calobioza raimnoza dekstryna inulina amidon glikogen gliceryna eryttryt adondit dulcyt D-mannit D-sorbit inozyt 1 salicyna Wynik 2 negatywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny negatywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny negatywny pozytywny negatywny pozytywny pozytywny pozytywny negatywny negatywny negatywny pozytywny negatywny pozytywny pozytywny Badane zródlo azotu 3 NaiNO, NaNOj (NH2),S04 (NH4)2HiP04 mocznik L-asparagina glukozamina glikol sarkozyna DL-alandna DL-walina Kwas DL-asparaginowy Kwas L-glutaminowy L-asparagina L-lizyna DL-seryna DL^treonina DL-onetionina tauryna DL-fenyloalanina L-tyrozyna DL-prolina L-hydroksyprolina L-tryptofan betaina Wynik 4 pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny negatywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny" pozytywny pozytywny negatywny pozytywny . _ pozytywny pozytywny pozytywny pozytywny negatywny wej, na przyklad kazeina, aUbumkia mleczna, glu¬ ten, lub produkty ich hydrolizy, maka sojowa, ara¬ chidowa, maczka rybna, ywciagi miesne, drozdzo¬ we, destylaty rozpuszczalne i wyciagi zbozowe.Pomiedzy skladnikami mineralnymi, dodawanymi do fermentacjd, niektóre wywierac moga dzialanie buforujace lufo neutralizujace, jak na przyklad fos¬ forany zasadowe lub fosforany metali ziem alkali¬ cznych albo weglany wapnia lub magnezu. Inne zapewniaja niezbedna równowage jonowa, koniecz¬ na dla rozwoju Streptomyces gallinaóus DS 25881 oraz dla obróbki antybiotyku 30504 RP. Dla tego ostatniego celu stosowane sa chlorki i siarczany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych.Wreszcie niektóre ze skladników dzialaja bardziej specyficznie jako aktywatory procesów metabolicz¬ nych Streptomyces gallinarius DS 25881; sa to sole cynku, kobaltu, zelaza, miedzi i manganu.Czynnikami, wplywajacymi na rozwój hodowli, sa zwiazki o charakterze witamin takie, jak ryfoofla- wina, kwas foliowy i kwas pantotenowy.Poczatkowe pH srodowiska fermentacyjnego po¬ winno byc zawarte pomiedzy 5, 8 i 7, 8, a korzyst¬ nie gdy pomiedzy 6,2 i 7,4. Temperatura optymal¬ na dla prowadzenia fermentacji zawarta jest po¬ miedzy 215 a 30°C, lecz zadowalajaca produkcja mo¬ ze byc uzyskana w temperaturze, zawartej pomie¬ dzy 23 a 33°C. Napowietrzanie podczas fermentacji moze zmieniac sie w dosyc szerokich granicach. Mi¬ mo to okreslono, ze napowdetirzamae od 0,3 do 3 litrów powietrza na litr bulionu i na minute od- 40 45 50 55 60 65 powiada szczególnie dobrze. Maksymalna wydajnosc 30504 RP uzyskuje sie po 2 do 8 dniach hodowli, przy czym czas ten zalezy glównie od stosowanego srodowiska fermentacji.Zgodnie z powyzszym nalezy stwierdzic, ze ogól¬ ne warunki hodowli Streptomyces gallinardus DS 25881 w celu wytworzenia 30504 RP moga zmie¬ niac sie w szerokim zakresie i dostosowane byc musza do kazdego wymogu szczególowego ho¬ dowli.Z brzeczki fermentacyjnej zwiazek 30504 RP moze byc wyodrebniony w nastepujacy spobó: brzeczka jest filtrowana w pH kwasnym, w zasadzie za¬ wartym pomiedzy 3 i 6, a korzystnie gdy bliskim , w obecnosci dodatków, ulatwiajacych filtracje.Zwiazek czynny, zawarty w placku filtracyjnym, jest z niego wyodrebniony za .pomoca odpowiednie¬ go rozpuszczalnika organicznego, nizszego alkoholu takiego, jak metanol lub rozpuszczalnia chlorowco¬ wanego takiego, jak chlorek metylenu. Surowy pro¬ dukt moze byc wyodrebniony z (powyzej okreslo¬ nych roztworów organicznych w drodze krystaHiza- cji po uprzednim zaitezeniu tych roztworów pod zmniejszonym cisnieniem. Dla ulatwienia krystali¬ zacji mozna ewentualnie dodac rozpuszczalnik, w którym substancja aktywna nie rozpuszcza sie iub rozpuszcza sie zle oraz umiescic roztwór w chlodni.Oczyszczenie 30504 RP przebiega zgodnie z meto¬ dami klasycznymi takimi, jak rekrystalizacja, chro¬ matografia na róznorodnych nosnikach lub chroma¬ tografia podzialowa w przeciwpradzie.92972 16 Przedmiot wynalazku uwidoczniony jest w po- * nizszym przykladzie stosowania, nie majacym zna¬ czenia ograniczajacego.• Przyklad a) Fermentacja; do tanku fermen¬ tacyjnego o pojemnosci 170 litrów zaladowano: 5 — peptonu 1200 g — wyciagu z drozdzy 600 g — glukozy jednowodnej 12G0 g — czesciowo zhydralizowanego io amidonu 2400 g — wody maejskied, dopelniajacejdo 110 litrów pH ustalono w wysokosci 7,3 prze dodanie 50 cm3 ib NaOH 10 N. Srodowisko wysterylizowano przez o- grzewanie zywa para do 122°C przez 40 minut, po ochlodzeniu, w wyniku kondensacji pary, stoso¬ wanej do sterylizacji objetosc bulionu wynosi 120 litrów, a pH Wynosi6,90. 2a Szczepienie dokonywane jest 200 cm3 kultury z koilby sfcozkoweij wytrzasanej, zawierajacej Strep- tomyces gallinarius DS 25881. Kultura hodowana jest w ciagu 2ll godzin podczas mieszania i napo¬ wietrzania jalowym powietrzem, a nastepnie jest 25 gotowa do zaszczepienia hodowli produkcyjnej.Hodowla produkcyjna prowadzona jest w tanku o pojemnosci 900 litrów, do którego zaladowano: — niedogon destylacyjny rozpuszczalny^ 12,5 kg 30 — sacharoza — '12,5 kg — chloreksodowy — 2,5 kg — siarczan magnezowy sredniowodny — 1,0 kg — roztwór chlorku kobaltowego szesciowodny o stezeniu 20 g/litr — 0^5 litra 35 — woda miejska, dopelniajaca do — 460 litrów Srodowisko doprowadzono przez dodatek 720 cm3 wodorotlenku sodowego 10 N do pH = 7,5, po czym wysterylizowano przez ogrzewanie zywa para do 122°C w ciagu 40 minut. Po ochlodzeniu, w wyni¬ ku kondensacji pary podczas sterylizacji, objetosc bulionu wynosi ,500 litrów, a jego pH wynosi 6,40.Szczepienia dokonuje ,sie kultura wychowana w tanku o pojemnosci 170 litrów w sposób opisany powyzej.Kultura hodowana jest podczas 116 goidzin w 27°C podczas mieszania przy uzyciu turbiny, obra¬ cajacej sie z predkoscia 206 obrotów/minute i na¬ powietrzajac jalowymi powietrzem w objejtosoi 2i0 an3/godz. Obnizenie pH poczatkowego kultury 50 jest ograniczone do wartosci 6,5 przez automatycz¬ ny dodatek 5 N wodorotlenku sodowego (calkowi¬ ta ilosc zuzyfta — 0„5 litra). Przy koncu procesu pH hodowli wynosi 7,85, a jej olbjetosc 47i0 litrów, b) Estrakcja. 1000 litrów brzeczki, otrzymanej w 55 uprzednio wskazanych warunkach, mieszanych jest przez pól godziny po zakwaszeniu do pH=5 przy uzyciu 7 litrów 6 N roztworu kwasu solnego.Po wymieszaniu z 35 kg dodatku, ulatwiajacego filtracje, brzeczka jest filtrowana na prasie filtra- 60 cyjnej. Placek jest przemywany na filtrze 200 li¬ trami wody o pH=5,, ustalonym przez dodatek 6N kwasu solnego.Przesacz i przemywki sa usuwane.' Placek filtracyjny jest rozdrobniony w 700 litrach 05 40 45 metanolu, pH otrzymanej mieszaniny doprowadza¬ ne jest do 7 przez dodanie 470 cm3 6N wodoro¬ tlenku sodowego i calosc mieszana jest w prze¬ ciagu pól godziny.Mieszanina jest filtrowana na prasie filtracyjnej, a placek przemyty 100 litrami metanolu. Przesacz i przemywki sa laczone i zatezane pod zmniejszo¬ nym cisnieniem (5 do 10 mm slupa rteci) tak, aby otrzymac 60 litrów roztworu wodnego. pH koncentratu doprowadzone jest do wartosci 3 przez dodatek 580 cm3 6 N roztworu kwasu sol¬ nego i calosc mieszana w ciagu 10 minut z 40 li¬ trami chlorku metylenu. Fazy sa oddzielane. Faza wodna jest kolejno ekstrahowana 30 litrami i 20 litrami chlorku metylenu.Ekstrakty chlorku metylenu sa laczone i mie¬ szane z 9 litrami wody z jednoczesnym zakwa¬ szeniem do pH-3 w fazie wodnej (20 cm3 6N kwa¬ su solnego). Faza organiczna jest oddzielana, po czym ponownie przemywana 18 litrami wody z do¬ datkiem wodorotlenku sodowego, az do otrzymania pH fazy wodnej równego 9,5 (20 cm3 6N wodoro¬ tlenku sodowego). Faza chlorku metylenu zatezana jest pod zmniejszonym cisnieniem (5 do 10 mm slu- ; pa rteci), az do objetosci okolo 1 litra.Koncentrat chlorometylenowy jest powoli do¬ dawany do 10 litrów heksanu. Roztwór jest filtro¬ wany. Wyodrebniono w ten sposób 7,5 g nieroz¬ puszczalnego zwiazku nieaktywnego. Przesacz za- tezany jest do objetosci okolo 1 litra. Koncentrat z dodatkiem jednego litra octanu etylowego mie¬ szany jest w obecnosci 1 litra wody. pH regulo¬ wane jest do 3 przez dodatek 6N kwasu solnego.Faza organiczna jest oddzielona i zatezana do ob¬ jetosci 1 litra. Po pozostawieniu roztworu w +4°C nastepuje powolna krystalizacja antybiotyku 30504 RP. Wydzielone krysztaly sa odsaczane i przemyte 50 cm3 heksanu w +4°C, po czym suszone w 35°C pod zmniejszonym cisnieniem 5 do 10 mm slupa rteci. W powyzszy sposób uzyskano 76 g surowego antybiotyku 30504 RP w formie kwasu. c) Oczyszczanie. 76 g uprzednio otrzymanego pro¬ duktu rozpuszczono w 1520 cm3 acetonu. Roztwór mieszany jest w ciagu pól godziny w obecnosci wegla aktywnego. Zawiesina jest odsaczana, a filtr przemyty 100 cm3 acetonu. Przesacz i przemywka sa polaczone, po czym dodane jest 850 cm3 wody podczas powolnego mieszania w 0°C. Roztwór po¬ zostaje w 4°C do krystalizacji. Wytracone kryszta¬ ly sa odsaczane, przemyte 100 om3 mieszaniny ace¬ ton — woda (1:3 objetosciowo) i suszone pod zimniejszonym cisnieniem (5 do 10 mm slupa rteci) w 35°C. W ten sposób otrzymuje sie 68,5 g anty¬ biotyku 30504 RP. d) Rekrystalizacja. 68 g powyzej otrzymanego produktu rozpuszcza sie w 2,8 litra heksanu. Roz¬ twór mieszany jest przez 7 godzin, podczas któ¬ rych nastepuje powolna rekrystalizacja produktu.Zawiesina pozostawiona jest przez 15 godzin w +4°C, po czym krysztaly sa odsaczone, przemyte 100 cm3 heksanu i suszone pod zmniejszonym cis¬ nieniem (5 do 10 mm slupa rteci) w ciagu 12 go¬ dzin w 35°C. Otrzymuje sie w ten sposób pierwsza frakcje, zawierajaca 54 g antybiotyku 30504 RP w formie kwasu.17 92972 18 Mozliwe jest 'otrzymanie dalszej frakcji w drodze zatezania roztworu macierzystego pod zmniejszonym cisnieniem (5 do 10 mm slupa rteci), az do objetos¬ ci 0,4 litra i pozostawienie go na 12 godzin w +4°C.Wydzielone krysztaly oddzielane sa przez filtracje, przemyte 200 cm3 heksanu i suszone pod zmniej¬ szonym cisnieniem (5 do 10 mm slupa rteci) w cia¬ gu 12 godzin w 35°C. Otrzymuje sie w ten sposób druga frakcje 10 g antybiotyku 30504 RP w formie kwasu.Substancja, wytworzona sposobem wedlug wy¬ nalazku, znajduje zastosowanie do sporzadzania mieszanin przeciw bakteriom typu cocci. Miesza¬ niny -te zawieraja antybiotyk 30504 RP lub jego sole z metalami lub tez sole z zasadami azotowymi, a w szczególnosci przedmiotem wynalazku sa pozywki • zwierzece lub stezone mieszaniny dla karmienia zwierzat, zawierajace antybiotyk 30604 RP lub jego sole metaliczne ailbo tez sole z zasadami azotowy¬ mi, ewentualnie w obecnosci innego czynnika, dzia¬ lajacego przeciwko bakteriom typu cocci.Dawka niezbedna dla otrzymania pozadanego e- fektu moze naturalnie ulegac zmianom w dosyc szerokich granicach, czesto wplywajacych na war¬ tosc samego pozywienia.W sposób ogólny wystarczy, aby dawki pozywie¬ nia, podawanego zwierzetom, zawieraly od 0,005 do 0,04% wagowych 30504 RP lub jego soli z za¬ sadami azotowymi.Antybiotyk 30504 RP lub jego sole metaliczne al¬ bo sole z zasadami azotowymi moga byc zawarte w pozywieniu w formie jednorodnej zawiesiny w powyzej okreslonych dozach. Moze byc on podany wraz z pozywieniem dodatkowym, najczesciej z in¬ nymi dodatkami takimi, jak witaminy i sole mine¬ ralne. Pozywienie to moze byc wymieszane z kar¬ ma, badz tez spozywane jako takie. W zasadzie wynosi on 5—20% karmy.W pierwszym sposobie podawania zawartosci 30504 RP lub jego soli z metalami albo z zasada¬ mi azotowymi wynosi zwykle od 0,05 do 20a/o, rozproszonego w dawce pozywienia. Przedstawia to wygodny sposób, ulatwiajacy równomierny roz¬ klad produktu aktywnego w pozywieniu. Pierwszy rodzaj mieszanki jest w zasadzie otrzymywany z koncentratów, zawierajacych od 99,9 do 20% 30504 RP lub jego soli z metalami albo z zasadami azo¬ towymi, uzupelnionych dodatkami jadalnymi taki¬ mi, jak barwniki spozywcze, srodki aromatyzujace, dyspergujace, zapobiegajace zbijaniu (aglomeracji) i wypelniacze pokarmowe.Koncentraty i mieszanki wstepne sa w zasadzie subtelnie rozdrabniane. Pozywienie uzupelniajace i mieszanki odzywcze moga byc badz rozdrobnio¬ ne, badz zgranulowane przy uzyciu zwykle stoso¬ wanych metod.Dla uzyskania mieszanki, zwalczajacej bakterie cocci, sporzadza sie pokarm podstawowy o naste¬ pujacym skladzie: maczka z odpadków mlynskich 13,41% maka jeczmienna 13,41% maka kukurydziana 13,41% maka pszenna maczka rybna maczka sojowa maka piekarska bezwodna wyciag z drozdzy mleko w proszku chlorek sodowy chlorek wapniowy dodatki mineralne kompleks witaminowy 31,32% 8,92% 8,92% 4,56% 2,33% 2,6S% 0,09% 0,89% 0,06% Vitamina A 4000 jjm/kg Vitamina D, 1000 j.m/kg Chlorek choliny 11,5 mg/kg Ryboflawina 2,24 mg/kg Do mieszaniny dodaje sie i miesza w sposób Jedno¬ rodny 0,02% antybiotyku 30504 RP.. Mieszanki podstawowe, zawierajace antybiotyk 30504 RP i/lub jego sole, stosowane sa równiez ja¬ ko czynnik, przyspieszajacy wzrost bydla roslino¬ zernego (bukatów, owiec, kóz) oraz jako czynnik, zwalczajacy desynterie u swin. Mieszanki te to mieszanki paszowe dla bukatów i tuczników oraz koncentraty zywnosci zwierzecej, zawierajace an¬ tybiotyk 30504 RP lub jego sole.Dawka, niezbedna dla wytworzenia pozadanego efektu, moze oczywiscie zmieniac sie w szerokich granicach w zaleznosci od gatunku zwierzecia i zgodnie z wartoscia odzywcza samego pokarmu.Szczególnie korzystne jest podawanie zwierzetom antybiotyku 30504 RP w ilosciach dziennych, za¬ wartych pomiedzy 50 i 250 mg na glowe zwie- rzecia.Korzystne jest, aby antybiotyk 30504 RP roz¬ proszony byl w pozywieniu uzupelniajacym, które go zawiera w ilosciach od 0,01 do 0,1%, najczes¬ ciej wraz z innymi dodatkami takimi, jak wita¬ no miny i sole mineralne. To pozywienie uzupelnia¬ jace moze byc badz wymieszane z pasza, badz skarmiane jako takie, stanowiac zwykle li do 10% dodatek do dziennej normy paszowej. W tym przy¬ padku 30504 RP stanowi od 0,0001 do 0,01% wago- 45 wych dziennej dawki paszy.Mieszanki wstepne, stosowane dla przygotowania paszy lub pozywienia uzupelniajacego, w zasadzie zawieraja od 0,1 do 5% antybiotyku 30504 RP, roz- proszonego w pozywieniu. Stanowia one wygodny sposób, ulatwiajacy jednorodny rozklad antybio¬ tyku 30504 RP w pozywieniu. Mieszanki wstepne sa najczesciej otrzymywane z koncentratów, zawie¬ rajacych od 99,9 do 5% antybiotyku 30504 RP z do- datkiem skladników jadalnych takich, jak barwniki spozywcze, zwiazki zapachowe, srodki dyspergujace lub zapobiegajace zlepianiu paszy, albo wypelnia¬ czy pokarmowych.Koncentraty i mieszanki wstepne sa w zasadzie 60 subtelnie rozdrabniane. Pozywienie uzupelniajace moze byc badz rozdrobnione, badz zgranulowane przy pomocy zwykle do tego celu stosowanej te¬ chniki. W mieszankach tych antybiotyk 30504 RP lub jego sole moga wystepowac w postaci drobnych 85 zajsteczek, które moga byc równiez pokryte otoczka.19 92972 PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku 30504 RP zwlaszcza przeciw bakteriom cocci jak równiez jego soli z metalami i soli z zasadami azotowymi, znamienny tym, ze w warunkach aeroboiwych pro¬ wadzona jest hodowla Streptomyces gallinarius DS 25881 (NRRL 5.785) w odpowiednim klasycznym srodowisku i w zwykle stosowanych warunkach dla tego rodzaju kultur, a nastepnie wyodrebnia sie antybiotyk 30504 RP, wytworzony w trakcie hodowli, w postaci wolnej lub w postaci soli i pod¬ daje sie go oczyszczeniu. I I Cr -o Dfuqosc fal w mikronach. 15 20 25 50 4000 3000 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 Liczby falowe w cm'1 Drukarnia Narodowa Zaklad Nr 6, zam. 475/77 Cena 10 zl PL PL PL