Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zjed¬ noczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowych antybiotyków A-201A i A-201B Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zawierajacych w czasteczkach atomy a- zotu, antybiotyków oznaczonych w niniejszym opi¬ sie symbolami A^201A i A-201B. Antybiotyki te sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie pod¬ czas hodowli szczepu Streptomyces capreolus NRJRL 3817 w warunkach fermentacji glebinowej z napowietrzaniem, w wodnych roztworach po¬ zywki. Antytotiotyki izoluje sie z brzeczki fermenta¬ cyjnej, stosujac ekstrakcje niemieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem np. chloroformem, a na¬ stepnie rozdziela je na kolumnie chromatograficz¬ nej, wypelnionej aktywnym adsorbentem w ro¬ dzaju zelu krzemionkowego, wykorzystujac do elu- cji aceton oraz mieszanine acetonu i metanolu w stosunku 9:1. Antybiotyk A4201A oczyszcza sie przez rekrystalizacje z zimnego acetonu, zas Ah201lB, bedacy w temperaturze pokojowej olejem, otrzy¬ muje sie, zatezajac jego roztwór po elucji aceto¬ nem i metanolem (9il).Antyibiotyki A201A i A20I1IB posiadaja wlasciwo¬ sci przeciwtoakteryjne, przeciwgrzybowe oraz prze- ciwamebowe.Sa to zwiazki, zawierajace w czasteczce azot, nie- zawiierajace dajacych sie (miareczkowac grup. An¬ tybiotyk A-2G1A jest zazwyczaj izolowany w po¬ staci krystalicznej, natomiast Ah2Q1(B jest w tem¬ peraturze pokojowej olejem, wszystkie wiec przed¬ stawione ponizej dane dotycza tych Antybiotyk A-20I1A jest biala, krystaliczna sufo- 10 115 25 30 stancja, posiadajaca po krystalizacji z acetonu temperature topnienia 17i0t—ili7l2°C, dobrze rozpusz¬ czalna w acetonie, chloroformie i octanie etylu, nierozpuszczalna w wodzie, weglowodorach i ete¬ rze.Podczas miareczkowania potencjometrycznego w 67% dwumetylofor-mamidzie poczatkowa wartosc pH wynosi 7,8, a w zakresie wartosci pH=3,5— 13,5 nie stwierdzono obecnosci dajacych sie mia¬ reczkowac grup.W wyniku analizy elementarnej stwierdzono, ze antybiotyk A-201A posiada w przyblizeniu naste¬ pujacy sklad: C — 55,20%, H — 6,72%, N — 10,45%, O — 28,5%, ciezar czasteczkowy wyliczony na podstawie analizy masowej wynosi okolo 693.W widmie w podczerwieni krystalicznego zwiaz¬ ku A-201A, wykonanym w chloroformie (fig. 1), wystepuja w zakresie dlugosci fali 2^0—16,0 mikro¬ nów nastepujace pasma absorpcji: 2v96 (szerokie); 3,46; 3,53; 5,80; 6,06; 6y26; 6,03; 6,40; 6,67; 6,02; 7,06; 7,16; 7,28; 7,4)6; 7,60; 7,76; 7,02; 8,10; 8y30; 8,00; 8,87; 9,06; 9,14; 9,312; 9,54; 9,65; 10,012; 16^23; 10,60; 11,01; 11,30; lly60 oraz 12,00 mikronów.W widmie w nadfiolecie w 96% roztworze wod¬ nym etanolu wystepuja maksima absropcji przy dlugosci fali okolo 208 m\i (E1^— 535) oraz okolo 275 nu (Ej^— 400).Analiza rentgenografliczna krystalicznej substan¬ cji A-201A wykonana metoda proszkowa, przy zasto- 828983 82898 4 sowaniu chromowego zródla promieniowania i fil¬ tru wanadowego, dala przy dlugosci fali 2,i2896 A nastepujace wyniki: d I/I 14,0 9,5 6,7 5,0 4,5 4,2 3,8 3,5 0,20 0,05 1,00 0,50 0,05 0,10 0,05 0,10 Wartosci;%Jfcwiazku A^iOlA, uzyskane podczas chromatografii ni bibule Wfoatmana nr 1, przed¬ stawione sa ponizej. Chromatogramy wywolywa¬ no -tokrtogicAHe^itosujac w charakterze drobnou- s1xojjl*^^lbweigi^czeip Sarcdna lutea.Uklad rozwijajacy 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Wartosc RF 0,87 0,89 0,88 0,44 0,47 0,48 0,70 0,87 0,86 0,13 0,83 Uklady rozwijajace: 1. Butanol wysycony woda 2. Butanol wysycony woda, z dodatkiem 2% kwa¬ su p-toluenosulfonowego 3. Butanol wysycony woda, z dodatkiem 2% kwa¬ su p-ltoluenosulfonowego i pirydyny 4. Keton metylowoizobutyilowy wysycony woda . 5. Keton metylowoizobutylowy wysycony woda z dodatkiem «2°/o kwasu p-toluenosulfonowego 6. Keton metylowoizobutylowy wysycony woda z dodatkiem 2% pijperydyny 7. Mieszanina wody, metanolu i acetonu (12:3:1), pH poczatkowo doprowadzone do wartosci 10,5 przy pomocy NH4OH, a nastepnie obnizone do 7,5 dodatkiem H3PO4. 8. 18% roztwór etanolu z dodatkiem 1,5% NaCl.Bibula chromatograficzna nasycona 1 m roztworem siarczanu sodowego. 9. Metanol z 0,1 n kwasem solnym (3:1) 10. Benzen wysycony woda 11. Mieszanina wody, etanolu i kwasu octowego (70:24:6).Chromatografie cienkowarstwowa zwiazku A-201A wykonywano na plytkach pokrytych ze¬ lem krzemionkowym Brinkmana F--254, uzyskujac nastepujace wartosci Hf: Uklad rozwijajacy RF ootan etylu, etanol (4:1) 0,49 odczynnik naftorezor- cynowy octan etylu, etanol (1:) 0,83 H2SO4, promienie UV lub bioautograf Skrecalnosc wlasciwa zwiazku A-201A [a]£5 wy¬ nosi —129,6° (C = 1 metanol). 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego wy¬ kazuje obecnosc 4—5 grup metylowych, ukladów aromatycznych oraz grup hydroksylowych. Po za- cetylowaniu Ah201A zawiera 21,17% grup acetylo- wych, a analiza wlidma jmr wykazuje obecnosc trzech gruip acetylowych.Antybiotyk A-20(1B jest w temperaturze 25°C bezbarwnym do jasnobrazowego olejem, rozpusz¬ czalnym w alkoholach, acetonie, chloroformie oraz octanie etylu, nierozpuszczalnym w wodzie, weglo¬ wodorach i eterze. Latwo daje sie eluowac z ze¬ lu krzemionkowego mieszanina acetonu i metano¬ lu w stosunku 9:1.Podczas miareczkowania potenojometrycznego w 67% . dwumetyloformiamidzie poczatkowa war¬ tosc pH wynosi 7,3, a w zakresie wartosci pH = 3,5—(13,5 nie stwierdzono dajacych sie miareczko¬ wac grup.Analiza elementarna wykazala, ze antybiotyk A- -201B posiada w przyblizeniu nastepujacy sklad: C — 65,41%; H — 9,0(3%; N ^- 5,76%; O — 17,718%, ciezar czasteczkowy wynosi okolo 417.W widmie w podczerwieni w chloroformie (fig. 2) wystepuja w zakresie 2,0—ilfyO nastejpujace wy¬ razne pasma absorpcji: 2,77; 3,05; 3,45; 3,51; 5,90; 6,05; 6,20; 6,60; 6,®6; 6,96; 7,10; 7,30—7,40; 8,30; 8,90—0,00; 9,64; 10,10; 11,20; ,12,30 oraz 15,23 mikro¬ nów.W widmie w nadfiolecie w 95% roztworze wod¬ nym etanolu wystepuja maksima absorpcji przy dlugosciach fal okolo 222 mu (Ej0/^— 516), okolo 24i2, m^i (E^m— 405) oraz okolo 340 mii (Ej%m— 225).Wartosci Rf zwiazku A-201B dla chromatograifiii na bibule Whatmana nr 1 podane sa ponizej. Chro- maltogramy wywolano biologicznie, stosujac jako drobnoustrój testowy szczep Sarcina lutea.Uklad rozwijajacy i 2 Wartosc RF 0,65 0,92 1. Woda wysycona ketonem metylowoizobutylowym z dodatkiem 2% kwasu p-toluenosulfonowego i 1% pdperydyny 2. 18% etanol z dodatkiem 1,5% NaCl. Bibula wy¬ sycona 1 m roztworem siarczanu sodowego.Nowe antybiotyki, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, hamuja wzrost drobnoustrojów cho¬ robotwórczych u zwierzat i roslin, zarówno bakte¬ rii, jak i grzybów. W tablicy 1 podano najmniej¬ sze stezenie hamujace ^nowych antybiotyków wo¬ bec szeregu drobnoustrojów. Badanie przeprowa¬ dzono metoda rozcienczeniowa.Tablica 1 Aktywnosc antybiotyków A-20I1A d A-201B Szczep testowy Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis Erwinia amylovora Najmniejsze stezenie hamujace \jam/ml | A^201A 1,56 12,50 12,50 A-.201B 6,25 2(5,00 25,0082898 6 c.d. itiabeli 1 Szczep testowy * Botrycis cinerea Trichophyton manta- grophytes Xanthomonas phaseoli Lactobacdlus casei Leuconositoc ci,trovorum Vibrio metschnikovii Mycobacterium avium Diplococcus pneumo- niae Neisseria mendngitidis Mycoplasma gallisepti- cum Pasteurella hemolytica Pasteurella multocida Escherichia coli Escherichia inddioa Salmonella spp.Candida tropicalis Ceratocystis ulmi Fusarium oxysporium F. lycopersici Yerticillium albo -atrum Najniniejisze stezenie hamujace pan/ml A-B01A l'O0,O0 25,00 90^00 1(2,50 0,20 25,00 1,56 6,25 <25,00 0,78 50,00 3,12 50,00 50,00 50,00 N.T.N.T.N.T.N.T.A-201B 0,38 3,lfc- 50,00 N.T.a) N.T.N.T.N.T.N.T.N.T. n:t.N.T. 100,00 100,00 r / N.T. IO0,00 50,00 0,39 ¦ 50y00 1 12,50 a) N.T. = nie testowano Antybiotyk A-201A wykazuje in vivo aktywnosc w przypadku infekcji u kurczat, wywolywanych przez Mycopasma gallisepticum. Na przyklad po¬ danie kurczetom, zakazonym tym drobnoustrojem, 5 mg A-201A wpostaci injekcji podskórnej zmniej¬ sza ilosc zgonów (powodowanych ta infekcja.Podawana' doustnie w ilosci 100 mg na kg mie¬ szanina antybiotyków A-i201 dziala skutecznie prze¬ ciw zakazeniom, wywolywanych u mlodych szczu¬ rów przez Entamoeba histolitica.Mieszanina antybiotyków An20ll, podawana do¬ otrzewnowe w ilosci 50 mg na kg, wykazuje takze aktywnosc w infekcjach, wywolanych u myszy przez Rorrelia novyi.• Antybiotyk A-201A, podawany podskórnie my¬ szom, wykazuje in vivo aktywnosc przeciwbakte- ryjna wobec 'róznych szczepów chorobotwórczych na przyklad ED50 przy stosowaniu pojedynczej dawki, która wynosi odpowiednio dla: Staphylo- coceus aureus — 6j5 mg/kg; Dilplococcus pneumo- niae — 100 mg/kg; Streptococcus pyogenes C 203 — 12 mg/kg. Toksycznosc antybiotyku A-201A, wy¬ razona jako LD50, wynosi dla myszy 400 mg/kg.Antybiotyk A^201A hamuje takze wzrost drobno¬ ustrojów, odpowiedzialnych za powstawanie cho¬ rób zebów. Przykladem moze byc dzialanie na drobnoustroje, tworzace lysinki. Test na to dziala¬ nie przeprowadza sie w nastepujacy sposób. Pro¬ bówki z pozywka, zawierajaca 50/o sacharozy, szczepi sie wywolujacym próchnice drobnoustro¬ jem, zanurza do probówki precik sizklany i inku- 10 15 25 30 35 40 50 55 buje w ciagU nocy w temperaturze 37°C. W tym czasie powstaje na powierzchni precika warstwa lysinek. Preciki przenosi sie do roztworów, zawie¬ rajacych rózne stetenia aotytriotyfeu A-201A i po¬ zostawia na okres 5, 10 lub 15 minut, a nastepnie obmywa sie jedwukrotnieWyjalowiona, odmine- ralizowana woda i zanurza do niezaszczepionej po¬ zywki, zawierajacej 5% sacharozy. Pozywke te po¬ zostawia sie do inkubacji na noc w temperaturze 27°<2 i dodaje nastepnie blekit bromotymolowy.Wzorost drobnoustrojów obserwuje sie, sledzac zmiane barwy z niebieskiej na zólta, wywolana wytwarzaniem kwasów podczas rozwoju drobno¬ ustroju w pozywce, zawierajacej sacharoze, feo testowania uzyto dwa wywolujace próchnice szcze¬ py Streptococci spp., mianowicie Ah31O06 oraz A-31037. Sitwierdzono, ze antybiotyk A-40I1A w ste¬ zeniu l°/o hamuje wzrost tych drobnoustrojów pod¬ czas pieciominutowego zetkniecia sie z jego roz¬ tworem testowego precika, Ponadto hamowanie wzrostu drobnoustrojów stwierdzono takze w tes¬ cie rozcienczeniowym. Ponizej podano wyniki dla kilku szczepów testowych.Szczep testowy Streptococcus mutans, NCPC 10449 (National Collection Tyfce Culture [London) Streptococcus sp (niezidentytftkowa- ny) szczep A31036 / Streptococcus sp (niezidentyfikowa¬ ny) szczep A3i10i37 szczep A31iOQi8 (niezidentyfikowany) Najmniej- 1 sze steze¬ nie ha¬ mujace (MIC) pg/ml 1,0 2,0 | 1,5 2£ j $5 Dodatek antybiotyku AhSIIA do past i proszków do zebów, do plynów do plukania ust i innych preparatów, sluzacych do higieny jamy ustnej, za¬ pobiega wielu jej seborzenjom. Antybkrtyk ten mozna takze wprowadzac na powierzchnie zebów i dziasel w postaci roztworu o odpowiednim steze¬ niu za pomoca szczoteczki.Stwierdzono równiez, ze antybiotyk A-20I1A mo¬ ze przyspieszac wzrost zwierzat. Przy podaniu czterodniowym kurczetom w ilosci 45,4 g na 1 to¬ ne podstawowej karmy obserwowano zwiekszenie efektywnosci zywienia w okresie dziesieciu dni, kurczeta, otrzymujace dodatek antybiotyku A-i20ilA, wazyly 160 g natomiast karmione tylko normalna karma 148 g. Ponadto okazalo sie, ze kurczeta, otrzymujace antybiotyki An20llA, zuzywaja na kaz¬ dy funt (0,454 kg) przyrostu wagi jedynie l,3fi fun¬ ta (0,63 kg) karmy, podczas gdy przy podawaniu karmy bez dodatku antybiotyku zuzycie to wynosi 1,52 funta (0,60 kg).Nowe antybiotyki sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie podczas hodowli glebinowej z napo¬ wietrzaniem w odpowiedniej pozywce szczepu z ga-7 82898 8 tunku Streptomyces; producenta antybiotyków A-201. Izolacje i oczyszczanie wytworzonych anty¬ biotyków prowadzi sie z zastosowaniem znanych, zwyklych metod. Brzeczka fermentacyjna zawiera mieszanine antybiotyków Ah201A i A201B, które rozdziela sie i oczyszcza od innych pomniejszych skladników, znajdujacych sie w brzeczce. Antybio¬ tyk Ah201A otrzymuje sie w postaci krystalicznej po chromatoigraifii kolumnowej i krystalizacji, an¬ tybiotyk AnaaiB oczyszczony chromiatograficznie jest w temperaturze pokojowej olejem.Promieniowiec stosowany do otrzymywania mie¬ szaniny antybiotyków A20I1 zostal zidentyfikowany jako szczep Streptomyces cepreolus Higgens. Zo¬ stal on zdeponowany w Northern Utylization Re¬ search and Development Laboratory, Agriculture Research Service, United States Department of Agrioulture, Peoria, Illinois pod numerem NRiRL 3817. Szczep ten wyizolowano z próbki gleby z We¬ nezueli. Próbki gleby zawieszano w wyjalowionej wodzie destylowanej i nanoszono zawiesine na po¬ zywke z agarem odzywczym. Zaszczepione plytki inkubowano w temperaturze 25°iO-^3l50C do czasu zaobserwowania wzrostu drobnoustroju. Po zakon¬ czeniu inkubacji kolonie szczepu produkujacego antybiotyk A-f20ll, przenoszono przy pomocy dru¬ cika platynowego na skosy, agarowe, które inku¬ bowano celem otrzymania odpowiedniej ilosci ino- kulum.Sizczep Streptomyces capreolus, producent anty¬ biotyków A-I2I01, zastosowany w sposobie wedlug wynalazku charakteryzuje sie nastepujacymi pod¬ stawowymi cechami morifofLogicznymi: owalne do lekko cylindrycznych, gladkie spory zgrupowane sa w dlugie, powyginane splecione lancuchy zawiera¬ jace na ogól 1«0 do 50 sporów. Wymiary sporów wynosza 1,005—2,01 X 0,67—1,005 mikronów.Spory w masie, w zaleznosci od rodzaju pozywki maja barwe od szarej do zóltej lub czerwonej.(Shirlilng, E. B. i GotOiefo, Inter. Buli. Systemie Bac- teriol., 16, 3113^-340, 1966). Szczep ten zgodnie z klasyfikacja Tresnera i Backusa (Aplied Microbio- logy, 11, 33i5—3138, 10(63), mozna zaliczyc do grupy bialej, zóltej i czerwonej. Analiza sciany komór¬ ki, wykonana metoda, opisana przez Beckera i in. w Appl. Microbiol. 12, 421^4)23, 1964, wykazala obecnosc mezoizomeru kwasu dwuaiminopimeli- nowego. Szczep nie wytwarza melaniny. Dobry wzrost obserwuje sie w temperaturze 36°C lub po¬ wyzej.Inne szczepy z gatunku Streptomyces moga rów¬ niez produkowac antybiotyki. A-a0fl njp. Streptomy¬ ces a!baflavus lub Streptomyces canescus, jednak pierwszy z nich wytwarza pigment melaninowy, a drugi spory o ksztalcie kulistym.Badania taksonomiczne szczeku Streptomyces capreolus NfKRL 3817, produkujacego antybiotyki A-201, prowadzono poslugujac sie metodami cha¬ rakteryzowania, zalecanymi przez International Streptomyces Project (Shdrling i Gottlieb, Inter.Buli. Systemie Bacteriol., 16, 31113—#40, 1S66). Wyni¬ ki tych badan przedstawiono w dalszej czesci opi¬ su. Do okreslania barw zastosowano metode ISCC.NBS (Inter Society Oolor Oouncdl, National Bureau of Standards), opisana przez K. L. Kelly6go i D. B.Judda w ILS. Department of Coromerce, Circ. 563 (1955). Oznaczenia- w nawiasach zwyklych odnosza sie do serii barw wedlug Tresnera i Backusa (Appl.Microbiol., 11, 335, 1968), a symbole barw sa poda- * 5 ne pismem tlustym. Symbole w nawiasach kwa¬ dratowych dotycza oznaczania barw wedlug A.Maerza i M. R. Paula, opisanego w Dictionary of Color, McGraw-Hill, New York (1950). Sklad po¬ zywek, oznaczonych symbolem ISP, podany jest 10 w International Streptomyces Project (Shirling i Gottlieb, praca cytowana).Morfologia, cechy hodowlane i fizjologia szczepu Streptomyces capreolus NIRJRL 3BY1 sa nastepujace: Morfologia — spory maja ksztalt od owalnego 15 do lekko cylindrycznego i sa zgrupowane w dlugie powyginane i splecione lancuchy zawierajace w <- kazdym 10—©0 lub wiecej sporów. Fotografia w mikroskopie elektronowym wykazuje gladkoscien- ne spory o wymiarach 1,005^-1,i5 mikronów. 20 Cechy hodowlane Agar z maka owsiana i pasta pomidorowa — Wzrost dobry, grzybnia powietrzna skapa, spory biale (W), b, spód jasnoszarawo-zóltawo^brazowy 25 [13B5], brak rozpuszczalnych pigmentów.Agar Czapeka — Wzost dobry, grzybnia po¬ wietrzna ska£a, spory bladopomaranczowo-zólte (R), 3ca, [10B3], brak rozpuszczalnych pigmentów.Agar z wyciagiem drozdzowym — wzrost obfity, 30 grzybnia powietrzna i spory Me sa wytwarzane, spód silnie zóltawo-rozowy [2F9] brak rozpuszczal¬ nych pigmentów.Agar Bennetta — Wzost obfity, grzybnia po¬ wietrzna i spory nie sa wytwarzane, spód umiar¬ ze kowanie czerwony [3H1<0], brak rozpuszczalnych ~ pigmentów.Agar odzywczy — wzrost dosc obfity, brak grzyb¬ ni powietrznej i sporów, spód lekko szarawo-bra- zowy, brak rozpuszczalnosci pigmentów. 40 Agar Emersona — wzrost dobry, brak grzybni powietrznej i sporów, spód ciemnonszarawo-zólty [13K3], brak rozpuszczalnych pigmentów.Agar glukozowo-asparaginowy — wzrost dobry, brak grzybni powietrznej i sporów, spód silnie zól- *s tawo-rózowy, brak rozpuszczalnych pigmentów.Agar z jablezanu wapnia — wzrost tak bardzo nikly, ze nie oznaczono barwy.Agar tyTozynowy — wzrost dosc obfity, grzyb¬ nia powietrzna obfita, spory blado zólte (Y), 2db so [11C1], spód JbaHodozóltozielony, brak rozpuszczal¬ nych pigmentów.Pozywka ISP nr 2 — wzrost obfity, brak grzyb¬ ni powietrznej i sporów, spód szarawo-czerwona- wo-pomaranczowy [11A8], brak rozpuszczalnych 55 pigmentów.Pozywka ISP nr 3 — wzrost dosc obfity, grzyb¬ nia powietrzna obfiita ze sporami, biala (W) b, spód biladozólto-zielony flOBil], brak rozpuszczal¬ nych pigmentów. 60 Pozywka ISP nr 5 — wzrost tak nikly, ze* nie okreslono barwy. . ¦ .Charakterystyka fizjologiczna: Uplynnianie zelatyny— nie uplynnia 65 Redukcja azotanów— redukuje9 82898 10 Wytwarzanie melaniny: a) pozywka zawierajaca wyciag drozdzowy i iron^agar — nie wytwarza b) pozywka zawierajaca tryipton i wyciag droz¬ dzowy — nie wytwarza Wymagania temperaturowe W zakresie temperatur 26-^30°C wzrost tylko wegetatywny, w temperaturze 37% obserwuje sie dobry wzrost wegetatywny, natomiast w zakresie temperatur 43^49°C wystepuje dobry wzrost we¬ getatywny i dobre wytwarzanie grzybni powietrz¬ nej. W temperaturze 55°C brak wzrostu.Wplyw zmian wartosci pH na barwe substra- tu — bez wplywu.W tablicy 2 zestawiono wyniki badan zdolnosci przyswajania róznych zródel wejgla przez szczep Streptomyces capreolus NRRL 3817. Zastosowano nastepujace oznaczenia: + — przyswajanie (+) — prawdopodobne przyswajanie (—) — watpliwe przyswajalnie — — -brak przyswajania Tablica 2 Przyswajanie wegla przez szczep S. capreolus NRjRL 31817 zródlo wegla L-arabinoza (—) cellobioza -r- i^inozyt (—) D (-=-) ksyloza -z- D-mannitol — D-(—)Hfruktoza (—) D-(-j-)-rafinoza — sacharoza (—) L-{-i-)-ramnoza — dekstroza -=- wzorzec (brak wegla) — Jak juz poprzednio wspomniano, szczep S. ca¬ preolus NiREJL 3817 jest zdolny do produkowania antybiotyków A-20I1A i Ah2Q1B przy zastosowaniu róznych pozywek hodowlanych. Oczywistym jest jednak, ze ze wzgledu na ekonomie procesu to znaczy wydajnosc i prostote izolowania konieczne jest stosowanie odpowiedniej pozywki. Ogólnie mozna stwierdzic, ze pozywka wieloskladnikowa, w której wystepuja rózne zródla weglowodanów i azotu, stanowi najlepsza pozywke wzrostowa.Zródlem weglowodanów moga byc dekstryny, me¬ lasy, glukoza, gliceryna i tym podobne. Natomiast dobrym zródlem azotu sa mieszaniny aminokwa¬ sów, peptony itp. Maka sojowa jest jednoczesnie dostarczycielem azotu i weglowodanów.Pozywka ma w swoim skladzie przyswajalne so¬ le nieorganiczne w rodzaju soli, zawierajacych jony sodowe, potasowe, amonowe, wapniowe, fosforano¬ we, siarczanowe, chlorkowe, bromkowe, azotanowe, weglanowe i inne. Dodatki soli magnezu i zelaza, korzystnie w postaci siarczanów, szczególnie dodat¬ nio wplywaja na produkcje antybiotyków Ah201.Podobnie, jak w przypadku innych drobnoustro¬ jów, niezbedny jest równiez dla wzrostu i rozwoju szczepu pewien dodatek suibstancji sladowych, któ¬ re sa zazwyczaj wprowadzane jako przypadkowe zanieczyszczenia skladników pozywki hodowlanej.Drobnoustrój, uzyty do produkcji Ah20i1A i A- -2G1B, jest zdolny do wzrostu w szerokim zakresie s wartosci pH. Na przyklad, wartosc pH róznych po¬ zywek uzytych do hodowli moze sie zmieniac w granicach od 6,2—7y2. Tak, jak w przypadku wiek¬ szosci drobnoustrojów z rodzaju Streptomycetes, wartosc pH pozywki podczas hodowli, stopniowo !0 sie zwieksza i moze w okresie wzrostu zmienic sie od okolo 6,5—8. Jednak wartosc pH, jaka sie uzys¬ kuje po zakonczeniu okresu wzrostu, wynosi zwy¬ kle okolo 6,"8—¦7,2.Do otrzymywania mieszaniny antybiotyków A- 15 -201 w wiekszej skali, korzystna jest fermentacjia , glebinowa z napowietrzaniem, prowadzona w du¬ zych fermentorach. Male ilosci antybiotyków moz¬ na otrzymywac podczas hodowli w kolbach na trzesawkach. Poniewaz podczas zaszczepiania po- 20 zywki w duzych fermentorach zarodnikujaca po¬ stacia szczepu nastepuje opóznienie wzrostu, bar¬ dziej korzystnym jest stosowanie do szczepienia postaci wegetatywnej. Inokulum wegetatywne jest przenoszone do wiekszego tanku fermentacyjnego. 25 .Pozywka uzyla do wzrostu inokulum wegetatyw¬ nego moze byc taka sama, jak w przypadku duzej fermentacji, jak równiez i inna.Szczep producent antybiotyków A^201 moze wzrastac w zakresie temperatur miedzy 30°C a 30 50°C. Dla uzyskania najwyzszych wydajnosci pro¬ cesu korzystne jest prowadzenie fermentacji w za¬ kresie temlperatur pomiedzy 35°C a 40° Proces wytwarzania antybiotyku podczas fer¬ mentacji mozna kontrolowac przy pomocy odpo- ?5 wiednich szczepów testowych. Jednym z nich, w przypadku antybiotyków A-1201, jest Bacillus sub- tilis. Testowanie biologiczne mozna prowadzic me¬ toda krazków bibulowych lub plytkowa na agarze.W celu uzyskania lepszego wzrostu drabnoustro- 40 j-u przez pozywke hodowlana przepuszcza sie jalo¬ we powietrze. Objetosc przepuszczanego powietrza wynosi zazwyczaj przynajmniej 10°/o objetoscio¬ wych w stosunku do objetosci pozywki. Z zasady zwiekszanie ilosci powietrza, az do ilosci, wywolu- 45 jacej burzliwe mieszanie pozywki, powoduje wiek¬ sza intensywnosc wzrostu i zwieksza wydajnosc procesu wytwarzania antybiotyku. Zazwyczaj mak¬ symalna ilosc wytwarzanego antybiotyku uzyskuje sie pomiedzy 72 a 120 godzina fermentacji. 50 Antybiotyki Ah2G1 wydziela sie z brzeczki fer¬ mentacyjnej i oddziela od innych substancji na drodze filtracji, ekstrakcji i adsorpcji. Roztwór, zawierajacy antybiotyki, saczy sie, odrzucajac grzy¬ bnie. Do saczenia stosuje sie typowe dla tego celu 55 substancje ulatwiajace filtracje. Antybiotyki A-20ilA i A-201B ekstrahuje sie przy uzyciu ogólnie stoso¬ wanych nie mieszajacych sie z woda rozpuszczal¬ ników, po doprowadzeniu pH filtratu do wartosci okolo 8,5 za pomoca 5 n roztworu wodorotlenku 60 sodowego, a nastepnie odparowuje sie rozpuszczal¬ nik pod zmniejszonym cisnieniem. Suchy osad roz¬ puszcza sie przy mieszaniu w metanolu. Nierozpu- szczona czesc odsacza sie i odrzuca, a roztwór me¬ tanolowy zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem &5 do sucha. Suchy osad rozpuszcza sie ponownie w11 82898 12 chloroformie i wytraca sie antybiotyk przez wla¬ nie roztworu chloroformowego do pieciokrotnie wiekszej objetosci eteru naftowego. Mieszanine su¬ rowych, antybiotyków A-201A i A-201B odsacza sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Antybiotyki Ah201A i A^201iB moga byc rozdzie¬ lone na pojedyncze substancje. W tyim celu mie¬ szanine antybiotyków rozpuszcza sie w 10 obje- tosciach chloroformu i poddaje rozdzialowi chro- matograficznemu na kolumnie, napelnionej zelem krzemionkowym (Grace 82, Davison Chemical Company), otrzymujac antybiotyki A-201A i A- 201B o duzej czystosci. Mieszanine antybiotyków mozna równiez poddawac rozdzialowi na kolum¬ nach, napelnionych aktywnym tlenkiem glinu, we¬ glem .aktywnym i innymi wypelnieniami, uzysku¬ jac pojedyncze substancje o duzej czystosci. Anty¬ biotyk A^aOtlA po wyizolowaniu go na drodze chro- matograjfiicznej poddaje sie dalszemu oczyszczaniu prze* rekrystalizacje z odpowiedniego rozpuszczal¬ nika. Antybiotyk A-*201B po wyizolowaniu go na drodze chromatografii kolumnowej jest w tempe¬ ratura? pokojowej substancja stala.Dokladny sposób postepowania podczas chroma- tograficznego rozdzielania mieszaniny antybioty¬ ków podano ponizej. iSurowa mieszanine antybiotyków, otrzymana przez wytracenie jej w postaci osadu z mieszaniny eter naftowy — chloroform i suszenie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, rozpuszcza sie w chloroformie.Kolumne chromatograficzna napelnia sie zawiesi¬ na zelu krzemionkowego tylp Grace 62 (Davson Chemical Co.) w mieszaninie (Chloroform — aceton (1:1) i po ustaleniu sie poziomu zelu przemywa trzema objetosciami tej mieszaniny. Chloroformo¬ wy roztwór mieszaniny antybiotyków nanosi sie na powierzchnie zelu' w kolumnie, przemywa znów jedna objetoscia mieszaniny chloroformu z aceto¬ nem (1:1), a nastepnie eluuje acetonem antybiotyk A-i20ilA. Poszczególne frakcje eluatu kontroluje sie na obecnosc antybiotyku. Polaczone frakcje, za¬ wierajace antybiotyk A^201A, odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Sucha pozo¬ stalosc rozpuszcza sie w temperaturze —i20°C. Po 8 godzinach wydzielone krysztaly antybiotyku A- -20HA saczy sie i suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Po calkowitym usunieciu z kolumny A-2011A prowadzi sie w daOszym ciagu elucje, stosujac mieszanine aceton — metanoli w stosunku 9:1.Eluaty zbiera sie i oznacza w nich zawartosc an¬ tybiotyku. Frakcje, zawierajace antybiotyk, laczy sie i odparowuje do sucha. Sucha pozostalosc roz¬ puszcza sie przy mieszaniu w acetonie i ponow¬ nie odparowuje rozpuszczalnik. Pozbawiony roz¬ puszczalników antybiotyk A-201B jest oleista bez¬ barwna lub jasnobrazowa ciecza.Jak juz wspomniano poprzednio, antybiotyk A- -201A wykazuje aktywnosc przeciw drobnoustro¬ jom PPLO oraz róznym gatunkom szczepów Pa- steurella, Salmonella, Streptocócci, Staphylococci i innym oraz wyfcazulje dzialanie hamujace przeciw¬ ko wielu szczepom choroibotwórczym roslin. W zwiazku z tym antybiotyk A-201A moze byc uzy¬ ty w postaci ogólnie stosowanych kompozycji przy leczeniu infekcji zwierzat lub roslin. Na przyklad antybiotyk A-i20ilA moze byc podawany w postaci roztworu dodanego do paszy lub do wody przy le¬ czeniu infekcji wywolywanych przez Pasteurella spp. u swin. Antybiotyk A^aOliB, jak to juz równiez 5 wspomniano, wykazuje aktywnosc przeciwbakte- ryjna i moze byc stosowany przy zwalczaniu np. zarazy ogniowej u gruszek wywolywanej przez Er- winia amylovora przez spryskiwanie gruszy ogólnie znanymi sposobami. Oprócz tego, antybiotyk A- io -201B wykazuje aktywnosc przeoiwgrzybowa i mo¬ ze byc stosowany do zwalczania grzybów takich, jak Botrytis cinerea atakujacy rosliny ozdobne i uzytkowe.Istote wynalazku wyjasniaja nastepujace przy- 15 klady.Przyklad I. Fermentacja antybiotyku A-201 w kolbie na trzesawkach.Zarodniki Streptomyces capreokis NRRL 3817 20 zaszczepia sie oa skosaich aiganowych o nastepuja¬ cym skladzie: Agar z wyciagiem drozdzowym Skladniki Ilosc 25 • glukoza 5 g ekstrakt drozdzowy 10 g agar 20 g woda destylowana 1 litr 30 Skos agarowy zaszczepia sie zarodnikami szczepu NRiRL 3&17 i inkufouje w ciagu szesciu dni w tem¬ peraturze 30°C, po czym pokrywa sie jalowa wo¬ da destylowana oraz zdrapuje sie z powierzchni 35 agaru zarodniki przy pomocy wyjalowionej ezy.Otrzymana zawiesine zarodników miesza sie w ce¬ lu zhomogenizowania i pobiera 1 ml do zaszcze¬ pienia pozywki wegetatywnej o nastepujacym skla¬ dzie: 40 Skladniki ilosc dekstroza 15 g makasojowa 15 g suchy namok kukurydziany 5 g CaOOs 2 g 45 NaCl 5 g woda wodociagowa 1 litr Przed zaszczepieniem wegetatywna pozywka wzrostowa sterylizuje sie w autoklawie w tempe- 50 raturze 120°C w ciagu 30 minut. Fermentacje pro¬ wadzi sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 30°C przy ciaglym wstrzasaniu na trzesawce obrotowej (250 obrotów/minute). 100 ml porcje pozywki produkcyjnej o skladzie 55 takim samym, jak podano dla pozywki wegetatyw¬ nej, umieszcza sie w kolbie Erlenmeye^a i stery¬ lizuje w ciagu 30 minut w temperaturze 120°C. Po ochlodzeniu, zaszczepia sie 5 ml inokulum wegeta¬ tywnego i wstrzasa sie w ciagu 72 godzin w. tem- 60 peraturze 30°C na trzesawce obrotowej o 250 obro¬ tach/minute. Przed zaszczepieniem wartosc pH po¬ zywki wynosila 7, a w czasie fermentacji wzrasta¬ la do wartosci 7,5. Otrzymany antybiotyk ekstra¬ howano z brzeczki fermentacyjnej znanymi meto- *s darni.13 82898 14 Przyklad II.A. Otrzymywanie antybiotyków A-201 w fer- mentorach o pojemnosci 946,3 litra.Zarodki Streptomyces capreolus NRIRL 3817 zaszczepia sie na skosach agarowych o nastepuja¬ cym skladzie: Skladniki Ilosc (g) glukoza 5 ekstrakt drozdzowy 10 agar 20 woda destylowana do objejtosci 1 litra Zaszczepione skosy inkubuje sie w temperaturze 30°C w ciagu okolo 5 dni, po czym pokrywa sie ja¬ lowa woda destylowana i delikatnie zeskrobuje wyjalowiona eza platynowa celem uzyskania wol¬ nej zawiesiny drobnoustroju. 1/2 ml tak otrzyma¬ nej zawiesiny przenosi sie do 50 ml wyjalowionej wegetatywnej pozywki wzrostowej o nastepujacym skladzie: Skladniki Ilosc (g) dekstroza 15 Bactopepton 10 gliceryna 10 Amber ALB*) 10 melasa 5 Nadrisol2) 10 ^ woda ¦dstylowaoa do objetosci 1 litra *) Amber ALB jest nazwa handlowa produktu, otrzymanego z albuminy z mleka, firmy Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin 55039.*) Nadrilsol jest nazwa handlowa produktu, otrzy¬ manego z suszonych fuzli gorzelnianych firmy Na¬ tional Distillers Products Company, New York.Wartosc pH pozywki wzrostowej przed styryli- zacja doprowadza sie za pomoca 5 n wodorotlenku - sodowego do wartosci 7,0—Ifl. Po sterylizacji pH pozywki obniza sie do wartosci 6,5—6fi. Inkubacje wegetatywnej pozywki wzrostowej prowadzi sie w temperaturze okolo 3iO°C w ciagu 72 godzin przy ciaglym wstrzasaniu na trzesawce obrotowej (250 obrotów/minute). Tak przygotowanym inokuluim zaszczepia sie w drugim etapie identycznie przygo¬ towana pozywke wegetatywna w ilosci 20 ml ino- kulum na 400 ml swiezej pozywki. W drugim eta¬ pie hodowle prowadzi sie w ciagu 48 godzin na trzesawce obrotowej (250 obrotow/minulte) w tem¬ peraturze ao°c 42 litry pozywki posiewowej o skladzie opisa¬ nym powyzej oraz 0,2 g srodka przeciwpiennego na litr pozywki umieszcza sie w fermentorze wy¬ jalowionym w temperaturze 1i20o,C w ciagu 30 mi¬ nut, a nastepnie zaszczepia okolo 400 ml inokulum wegetatywnego z drugiego etapu. Fermentacje pro¬ wadzi sie w ciagu okolo 24 godzin w temperaturze 30°C stosujac mieszadlo o 135 obrotach na minute i napowietrzanie w ilosci 18,40 litra/minute. Po uplywie okolo 24 godzin fermentacji okolo 8 litrów hodowli posiewowej uzywa sie do zaszczepienia 946,3(2 litra jalowej pozywki produkcyjnej o naste¬ pujacym skladzie: 10 15 25 30 35 40 45 Skladniki srodek przeciwtpienny dekstroza srut sojowy melasa weglan wapniowy woda destylowana do 100,0 Procent (waga) objetosc 0,02 5,00 1,50 0,30 0,25 Fermentacje prowadzi sie w temperaturze okolo 30° nute i napowietrzanie 396,4 litra na minute. Po 48 godzinach dodaje sie jalowy -roztwór 47!2 kg dek- strozy w 42 litrach wody i kontynuuje fermentacje w ciagu dalszych 48 godzin.B. Izolacja mieszaniny antybiotyków. •900 litrów brzeczki fermentacyjnej, otrzymanej wedlug punktu A, filtruje sie z dodaltkiem 27 kg ziemi okrzemkowej Hytflo supercal. Wartosc pH przesaczu doprowadza sie 5 n wodorotlenkiem so¬ dowym do 8,5. Alkaliczny przesacz ekstrahuje sie dwukrotnie chloroformem w ilosciach, odpowiada¬ jacych polowie ilosci roztworu. Ekstrakty chloro¬ formowe laczy sie i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w 2 litrach metanolu, nierozpuszczona czesc od¬ sacza sie i odrzuca, a przesacz odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Sucha pozo¬ stalosc rozpuszcza sie w 470 ml chloroformu i wle¬ wa do 10 litrów eteru naftowego. Wytracony ete¬ rem naftowym produkt odsacza sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 82,6 g suro- wej mieszaniny antybiotyków Ai201.C. Rozdzial antybiotyków A-201. 63 g surowej mieszaniny antybiotyków A-201, otrzymanej wedlug przepisu podanego w punkcie B, rozpuszcza sie w 5O0 ml chloroformu. Kolumne chromatograficzna o wymiarach 7 cm X 60 cm napelnia sie zelem krzemionkowym (Grace 02, Da- vison Chemical Go) zawieszonym w mieszaninie chloroform-aceton w stosunku 1:1 i spuszcza sie z kolumny faze ruchoma, znajdujaca sie nad po¬ ziomem zelu. Nastepnie nanosi sie na wierzcholek kolumny chloroformowy roztwór mieszaniny anty¬ biotyków Ah201, pozwalajac na przejscie antybio¬ tyków do warstwy zelu krzemionkowego. Po 50 spuszczeniu z kolumny 500 ml chloroformu prze¬ mywa sie ja 10 litrami mieszaniny ohlroformu i acetonu (1:1), a nastepnie eluuje acetonem an¬ tybiotyk A-20I1A. W poszczególnych eluatach, wy¬ chodzacych z kolumny, oznacza sie zawartosc an- 55 tybiotyku. Eluaty, wykazujace aktywnosc anty- biotyczna, laczy sie i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Do suchej pozostalosci dodaje sie 500 ml acetonu, ogrzewa, a nastepnie pozostawia na noc w temperaturze -^20°C do 60 krystalizacji. Wydzielone krysztaly antybiotyku A-H201 odsacza sie i suszy pod zmniejszonym cis¬ nieniem, otrzymujac 13,3 g zwiazku o tempera¬ turze topnienia 170—1172°C.Po wyeluowaniu z kolumny antybiotyku A-201A 65 prowadzi sie dalsza elucje mieszanina aceton-me-15 82898 15 tanol (9:1), oznaczajac w poszczególnych frak¬ cjach aktywnosc antytoiotyczna. Wszystkie eluaty, zawierajace antybiotyk, laczy sie i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymu¬ jac okolo 5 g antybiotyku A-2G1B, który w tem¬ peraturze 25°C jest olejem o barwie bialej do jasnobrazowej. PL