PL47858B1 - - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wego antybiotyku okreslanego numerem 9.671 R.P. Ten nowy antybiotyk ma specjalne znacze¬ nie ze wzgledu na silna aktywnosc bakteriobój¬ cza w stosunku do bakterii gram-dodatnich (a zwlaszcza stafilokoków i streptokoków).Nowy antybiotyk otrzymuje sie w warunkach sztucznych z kultury mikroorganizmu opisane¬ go dokladnie ponizej, a nalezacego do grupy Streptomyces i oznaczonego przez „Streptomy- ces 40.037" lub „Streptomyces actuosus".Krystaliczny 9.671 R.P. rozpuszcza sie w chlo¬ roformie, dioksanie, pirydynie, dwumetylofor- mamidzie i sulfotlenku metylu, slabo rozpuszcza sie w metanolu, etanolu, octanie etylu i benze¬ nie. Nierozpuszczalny jest w wodzie i eterze naftowym. 9.671 R.P. daje negatywne próby w nastepuja¬ cych reakcjach: w reakcji biuretowej, w reakcji Sakaguchi, w reakcji ninhydrynowej, w reakcji Millon'a w reakcji Folin — Denis'a, w reakcji chlorku zelazowego, w reakcji MoIisch'a, w re¬ akcji z roztworem Fehlinga, w reakcji Tollens'a w reakcji Ehrlich'a, w reakcji soli zelazowej maltolu, w reakcji Zimmermann'a. Pozytywne próby daje w reakcji ninhydrynowej po hydro¬ lizie, co wskazuje na obecnosc lancucha wielo- peptydowego.Antybiotyk zawiera wegiel, wodór, tlen, azot i siarke. Jego sklad elementarny jest naste¬ pujacy: Co/0 = 49,6 H% = 4,0 0% = 16,7 NVo= 14,4 S% = 15,8Charakteryzuje sie on nastepujacymi wlasci¬ wosciami fizycznymi: Wyglad: Temperatura topnienia: Skrecalnosc: Widmo w ultrafiolecie: proszek mikrokrystali¬ czny (igielki) zólty 310 — 320° (rozklad) (w bloku Maquenne'a) (a) g = + 38o (c = l, pirydyna) (oznaczenie wykonano wychodzac z roztworu 10 ^g/cm3 w wodzie, za¬ wierajacej 1% dwume- tyloformamidu) Maximum absorpcji przy 242 m^ — EI1c°i = = 525 Maximum absorpcji przy 322 mp —'E$jk = = 229 Widmo w podczerwieni: (oznaczenie wykonano na pastylkach w mie¬ szaninie z KBr).Widmo to przedstawiono na zalaczonym wy¬ kresie. Na odcietych naniesiono dlugosci fal z jednej strony w mikronach (skala nizsza) i w cra-i (skala wyzsza), a na rzednych naniesiono % transmisji.W tablicy I podano glówne pasma absorpcyj¬ ne w podczerwieni dla tego produktu. 3350 F 3125 ep 2930 ep 1745 m 1655tF 1532 tF 1484 F 1425 m 1385 f 1342 m 1308 m 1235 m 1210 m 1168 m 1150 m 1112 sp Ta 1101 m 1061 m 1017 m 990 f 940 f 918 m 890 ep 843 m 822 f 790 m 752 F blica I.Absorpcja tF — bardzo silna F — silna m — srednia f — slaba ep — slady / Antybiotyk 9.671 R.P. mozna zidentyfikowac za pomoca chromatografii bibulowej. Antybio¬ tyk chromatografuje sie na papierze Arches nr 302 nasyconym roztworem buforowym fosfora¬ nu M/15 o pH 7, przy zastosowaniu techniki splywowej z rozwinieciem za pomoca róznych rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalni¬ ków. Chromatogramy rozwija sie (wywoluje) za pomoca bioautografii na plytkach z agarem ja¬ ko pozywke obsianych bakteriami S.aureus lub B.subtilis. Otrzymane Rf podano w tablicy II.Tablica II.Rozpuszczalnik rozwijajacy (górna warstwa mieszaniny róznych skladników) Rf benzen + n butanol + woda (95 : 5 :25 objetosciowo) octan etylu + metyloizobutyloketon + woda (20 :80 :25 objetosciowo) octan etylu + metyloizobutyloketon + woda (50 :50 :25 objetosciowo) octan etylu + benzen -f- woda (40 :60 :25 objetosciowo) cykloheksan + n butanol + woda (80 :20 :25 objetosciowo) octan etylu nasycony woda 0,15 0,15 0,30 0,05 0 0,50 Aktywnosc bakteriostatyczna antybiotyku 9.671 R.P. w stosunku do bakterii okreslono za pomoca jednej z metod rozcienczania, stosowa¬ nych do tego celu. Okreslono dla kazdej bakterii najmniejsze stezenie substancji, które wstrzy¬ muje calkowicie dajacy sie zauwazyc rozwój w odpowiednim bulionie-pozywce. Wyniki róz¬ nych oznaczen podano w przytoczonej ponizej tablicy III, w której minimalne stezenia bakte- riostatyczne wyrazone sa w mikrogramaeh sub¬ stancji na cm3 badanego srodowiska. — 2 —Tablica III Staphylococcus aureus, szczep 209 P — ATCC 6538 P „ „ , szczep 133 (Jnstitut Pasteur) „ „ , szczep B3 (odporny na streptomycyne i na penicyline) „ „ , szczep Hb (odporny na tetracykline i na penicyline) „ „ , szczep Launoy 1 (odporny na tetracykline, na streptomycy¬ ne, na chloramfenikol i na penicyline) „ „ , szczep Launoy 2 (odporny na tetracykline, na streptomycy¬ ne i na penicyline) „ „ , szczep Beaujon 3 (odporny na tetracykline, na streptomycy¬ ne, na chloramfenikol i* na penicyline) „ „ , szczep 2700 R — odporny na streptotrycyne „ „ , szczep 1142 R — odporny na kongocydyne „ „ , szczep 3486 R — odporny na spiramycyne „ „ , szczep odporny na karbomycyne „ „ , szczep odporny na erytromycyne „ „ , szczep odporny na chloramfenikol Staphylococcus aureus, szczep odporny na nowobiocyne „ „ , szczep odporny na aktynomycyne Micrococcus citreus — ATCC 8411 „ lysodeikticus — ATCC 4698 Gaffkya tetragena (Fac. Phie) Sarcina lutea — ATCC 934l „ alba (Fac. Phie) Streiptocuccus faecalis (Enterocoaue de Thiercelin Fac. Phie) Streptococcus faecalis — ATCC 9790 Streptococcus viridans (Institut Pasteur) Sterptococcus pyogenes hemolyticus (szczep Dig. 7 Institut Pasteur) Diplococcus pneumoniae (szczep Til, Institut Pasteur) Neisseria catarrhalis (Fac, Phie) Lactobacillus casei — ATCC 7469Badany mikroorganizm Minimalne stezenie bakterio- statyczne [Ag/cm3 0,003 0,01 0,13 0,0071 138 0,0043 138 5,07 138 0,17 19,2 138 138 138 138 138 138 138 0,0015 138 138 138 138 138 138 0,0024 Bacillus subtilis — ATCC 6633 „ „ — (szczep ZO 5 A, Fac. Phie) „ — (szczep 3 R 9675, Merck) — ATCC 9524 „ cereus — ATCG 6630 „ brevis — ATCC 2185 „ mycoides Mycobacterium smegmatis — ATCC 607 Mycobacterium smegmatis — ATCC 607 NR (szczep odporny na neomycyne) „ „ — ATCC 607 SR (szczep odporny na streptomycyne) „ phlei — (Institut bacteriologiaue de Lyon) „ para-smegmatis (A 75 — Lausanne) Escherichia coli — ATCC 9637 Shigella dysenteriae — Shiga L (Institut Pasteur) Salmonella typhimurium (Institut Pasteur) Salmonella paratyphi A (Lacasse, Institut Pasteur) Salmonella schottmuelleri (paratyphi B) — (Fougenc, Institut Pasteur) Bacillus lactis aerogenes (Fac. Phie) Aerobacter aerogenes — ATCC 8308 Alcaligenes faecalis — ATCC 8740 Proteus vulgaris (Fac. Phie) „ X 19 KLebsiella pneumoniae — ATCC 10.031 Serratia marcescens (A. 476, Lausanne) Pseudomonas aeruginosa (szczep Bass — Institut Pasteur) Brucella bronchiseptica (CN 387 — Welcome Institute) Pasteurella multocida (A. 125, Institut Pasteur) Z zestawienia danych wynika, ze antybiotyk 9.671 R.P. oddzialowuje bakteriostatycznie zwla¬ szcza na bakterie, przyjmujace zabarwienie ba¬ kterii Gram. Ponadto antybiotyk ten dziala na szczepy stafilokoka (gronkowca) uodpornione na jeden lub kilka z nastepujacych antybiotyków: penicylina, streptomycyna, tetracyklina, chlo¬ ramfenikol, erytromycyna, nowobiocyna, akty- nomycyna, streptotrycyna, kongocydyna, spira- mycyna, karbomycyna.Antybiotyk 9.671 R.P. nie dziala na nastepu¬ jace grzybki w postaci drozdzy lub wlókniste: Pestalozzia palmarum, Saccharomyces pastoria- nus, Stemphyliuin radicinum, Aspergillus niger, Candida albicans, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum. 4 —Ponadto laboratoryjnie wykazano, ze antybio¬ tyk 9.671 R.P. dziala zwlaszcza na infekcje sta- filokokami u myszy, jezeli stosowac go in situ.Toksycznosc antybiotyku badano glównie na myszy. Maksymalna dopuszczalna dawke, to jest dawke maksymalna przy której nie wystepuje smiertelnosc u zwierzat (DL0) okreslono przez podawanie produktu droga podskórna, doustnie i do otrzewnej.Droga podskórna DL0 powyzej lub równe 1 g/kg, droga doustna DL0 powyzej lub równe 2,5 g/kg, droga do otrzewnej DL0 = 0,5 g/kg.Slabo toksyczny dla myszy i dobrze znoszony przez królika przy zastosowaniu na blonach sluzowych, produkt ten stanowi doskonaly lek do leczenia lokalnych zakazen wywolanych przez bakterie koki igram-dodatnie u ludzi i zwierzat.Jest on zwlaszcza bardzo skuteczny przy lecze¬ niu zapalenia wymion u krów.Organizm wytwarzajacy antybiotyk 9.671 R.P. nalezy do gatunku streptomyces i okreslany jest nazwa „Streptomyces 40.037".Organizm ten zostal wyosobniony z próbki ziemi pobranej kolo Corrientes w Argentynie.Sposób wyosobnienia jego jest nastepujacy: z pobranej ziemi tworzy sie zawiesine w desty¬ lowanej, wyjalowionej wodzie, po czym zawie¬ sine rozciencza sie do uzyskania róznych stezen.Z kazdego rozcienczenia mala objetosc zawiera¬ jaca pozywke Emersona lub inne odpowiednie srodowisko umieszcza sie na plytce Petriego.Po kilkudniowym okresie hodowli w temperatu¬ rze 26° kolonie mikroorganizmów, które chce sie wyosobnic zaszczepia sie na agarze — pozywce, skosnie ustawionym w celu otrzymania wiek¬ szych ilosci mikroorganizmów.Przy zastosowaniu klasyfikacji Bergeys'a „Ma¬ nual of determinative Bacteriology" (VII wyda¬ nie 1957) dla gatunku streptomyces, nie znale¬ ziono zadnego opisu organizmu, którego wlasci¬ wosci rozwojowe i biochemiczne odpowiadalyby wlasciwosciom Streptomyces 40.037. Z tego wla¬ snie powodu organizm ten mozna uwazac za no¬ wy gatunek, któremu nadano nazwe „Strepto¬ myces actuosus" z powodu jego duzej aktyw¬ nosci.Morfologia mikroskopowa.Hodowle na plytkach z srodowiskiem Ben- netta badane pod mikroskopem wykazaly two¬ rzenie sie nitek rozgalezionych grzybni, jak rów¬ niez lancuchów zarodników, charakterystycz¬ nych dla gatunku streptomyces. Nitki grzybni nosza bardzo liczne lancuchy zarodników. Nitki zarodników sa wygiete i maja rózna dlugosc.Zarodniki sa owalne o szerokosci okolu i /* i dlugosci okolo 1,5 /*. Nitki grzybni sa ciensze od nitek zarodnikowych. Ich szerokosc wynosi okolo 0,6 — 0,8 fi.Gechy ogólne.W srodowiskach zwanych „syntetycznymi" S. actuosus stanowi ogólnie grzybnie wegeta¬ tywna, bezbarwna do blado pomaranczowego koloru i nie wytwarza pigmentu rozpuszczalne-. go slabych pigmentów o kolorze ochrowym lub brazowym. W srodowiskach zwanych „organicz¬ nymi" wytwarza on grzybnie wegetatywna o ko¬ lorze przechodzacym od forazowo-zóltego do ciemnp-brazowego i rozpuszczalne pigmenty brunatne, mniej lub wiecej intensywne, zaleznie od srodowiska i wieku hodowli. -Grzybnia napo¬ wietrzna nie wystepuje w tych srodowiskach.Jesli sie ja wytworzy, to zabarwienie jej jest poczatkowo biale, a nastepnie przechodzi w szare.Postac wyosobnionych kolonii.Pojedyncze hodowle zarodnikowe na plytkach Petriego w srodowisku Bennetfa daja kolonie okragle, o brzegach niewystrzepionyeh. Kolonie te sa dosyc wypukle, przy czym moga wykazy¬ wac centralne wybrzuszenie. Grzybnia wegeta¬ tywna posiada liczne faldy wzdluz promieni.Jest ona zabarwiona na kolor blado pomaran¬ czowy, tak samo jak jej dolna strona. Grzybnia napowietrzna powstaje dosyc wczesnie. Poczat¬ kowo biala w miare rozwoju staje sie* szara.Wytwarza sie lekki pigment brazowy w pozyw¬ ce agarowej.Cechy charakterystyczne hodowli i wlasciwosci biochemiczne.Warunki hodowlane i wlasciwosci biochemi¬ czne szczepu Streptomyces actuosus badano na pozywkach agarowych i bulionach-pozywkach, zwykle stosowanych do identyfikowania szcze¬ pów Streptomyces. Dokonane obserwacje poda¬ no w ponizszej tablicy IV. Dane dotycza hodo¬ wli po 27-miodniowym wyleganiu w temperatu¬ rze 26°. Wiekszosc srodowisk hodowlanych zo-'., stala przygotowana wedlug danych zawartych w „The Actinomycetes", S.A. Waksman, strona 193 — 197, Chronica Botanica Company, Wal- tham (Mass.), USA 1950 i w przypadku tym po¬ dano odpowiedni numer z „The Actinomycetes". — 5 —Tablica IV Srodowisko hodowlane Agar Bennetfa (ref. A) Agar z gliceryna i asparagina (3) Agar syntetyczny (skrobia — sole nieorganiczne) (ref. J) Agar z maltoza i tryptonem (ref. B) Agar syntetyczny (srodowisko Czapka) (1) Agar syntetyczny z glukoza (ref. C) Agar Emerson'a (23) Agar z glukoza i asparagina (2) Agar z pozywka (5) Agar z glukoza (7) Agar ze skrobia (10) Agar z jablcza- nem wapniowym (ref. D) Stopien rozwoju dobry umiarkowany umiarkowany silny dobry dobry dobry umiarkowany slaby dobry umiarkowany umiarkowany Grzybnia wegetatywna iekko sfaldowana slabo rozwijajaca sie bezbarwna bezbarwna, slabo rozwijajaca sie gesta i silnie zabarwiona (czarno), sfaldowana bezbarwna, lekko rozwijajaca sie bezbarwna lekko rozwijajaca sie sfaldowana i lsniaca jasno-brunatna bezbarwna matowa, koloru ochry, brunatno-zólta gladka, blyszczaca bezbarwna lub blado pomaranczowa bezbarwna Grzybnia napowietrzna obfita, przecietnie szara lekka, biala przechodzaca w srednio szara lekka, poczatkowo biala, przecho¬ dzaca nastepnie w szara biala o wygladzie kredowym, przechodzaca w kolor szary obfita po pojawieniu sie wydaje sie, ze staje sie szara, Jecz pozostaje blada biala, w postaci proszku, przechodzaca w blado szara bialo-szarawa jasno-szara z kilkoma malymi bialymi kepkami brak poczatkowo bialo-szarawa, o wygladzie kredowym przechodzacym w blado-szary, lekko rózowa z odcinkami ja¬ snymi i ciemny¬ mi przy czym przewazaja odcinki jasne biala przechodzaca w odcien szary biala przechodzaca w odcien szary Rozpuszczalny pigment brazowy o sredniej intensywnosci slaby, o zabarwieniu ochry slaby, o zabar¬ wieniu zóltej ochry intensywny brazowy dosyc obfity, o zabarwieniu ochry dosyc obfity, o zabarwieniu ochry jasno-brunatny nie ma koloru ochry, brunatno-zólty nie ma koloru ochry rózowy brak Wlasciwosci biochemiczne tworzenie sie krysztalów w agarze roztwarzanie jablczanu wapniowego | — 6 —Srodowisko hodowlane Agar z tyrozyna (ref. E) Zelatyna czysta 12% (ref. F) Kartofle (27) Roztwór skrobi (19) Bulion Czapka (18) Bulion Czapka z glukoza (ref. G) Bulion — pozywka z azotanem (ref. H) Mleko odtluszczone (ref. K) Stopien rozwoju umiarkowany umiarkowany silny umiarkowany umiarkowany umiarkowany umiarkowany dobry Grzybnia wegetatywna jasno-brazowa klaczki na powierzchni ze¬ latyny sfaldowana ziarnista mgla na powierzchni, w glebi klaczki, przewaznie przyklejone do scianek probówki klaczki w glebi probówki klaczki w glebi probówki ziarnista mgla na powierzchni i male kolonie w glebi, przyle¬ gajace do scianek obraczka ciemno brunatna i mgla Grzybnia napowietrzna brak brak biala na brzegach, szara w srodku brak brak brak brak slady, biala Rozpuszczalny pigment brunatny brunatno-zólty zólty produkt wypacanie w kropelkach na powierzchni grzybni napowietrznej, rozpuszczalny brunatny pigment nie ma lekki i zólty, intensywniejszy w kierunku powierzchni niz ku glebi lekki i zólty, intensywniejszy w kierunku powierzchni niz ku glebi nie ma poczatkowo ciemno brunatny na po- wieTzchni, w glebi jasniejszy.Nastepnie brunatny pigment ogarnia cale srodowisko Wlasciwosci biochemiczne nie ma roztwarzania tyrozyny przejscie w stan ciekly na 1/3 wy¬ sokosci w ciagu 12 dni, na wyso- 1 kosci 2/3 w cia¬ gu 27 dni hydroliza skrobii nie jest calkowi¬ ta po 12 dniach | (reakcja w roz¬ tworze jodu w jodku), po 27 dniach pozostaja tylko dekstryny dodatnia reakcja na azotyny 12-go dnia nie ma koagula¬ cji pH = 6,8. 27-go dnia nastepuje calkowita peptonizacja, pH = 7,2Odnosniki literaturowe i sklad chemiczny sro¬ dowisk nieopisanych w „The Actinomycetes".A: K.L. Jones, J. Bacteriology 57, 142 (1949).B: A.H. Williams, E.Mc Coy, App. Microbiolo- gy 1, 307 (1953).C: Otrzymane przez zastapienie w przepisie po¬ danym przez Waksman^ dla „Agaru synte¬ tycznego Czapka" (1) sacharozy przez 3% glukozy.D: 1% jablczanu wapniowego; 0,05% NH4C1; 0,050/0 K2HP04; 2% agaru.E: 0,5% peptonu; 0,3% ekstraktu miesnego; 0,5% tyrozyny; 2% agaru.F: „Zelatyna czysta" wytworzona wedlug wska¬ zówek z „Manual of methods for pure Cultu- re Study of Bacteria " — Society of Ameri¬ can Bacteriologists (II50 — 18).G: Otrzymane przez zastapienie w przepisie po¬ danym przez Waksman'a dla „Bulionu Czap¬ ka z sacharoza" (18), sacharozy przez 3% glukozy.H: Wedlug przepisu podanego w „Manual of methods for pure Culture Study of Bacte¬ ria" — Society of American Eacteriologicts (IIso — 18).J: Grundy i coli. Antibioties and Chemothera- py, 1, 309 (1951).K: Wytworzone ze zbieranego mleka w proszku marki Gayelord Hauser.Wykorzystanie róznych skladników weglowo¬ dorowych wedlug metody Pridham (T.G.) [Gott- lieb (D) — J. Bact. 56, 167 (1948)].Hodowle prowadzono na agarze — pozywce, skosnie ustawionym. Inkubacja odbywala sie w temperaturze 26°. Do skladników powodujacych szybki i pelny wzrost z powstaniem grzybni na¬ powietrznej i zarodników w ciagu 10 dni, nale¬ za: glukoza, maltoza, laktoza, sacharoza, skrobia, dekstryna, ksyloza, rafinoza, ryboza, inulina, fruktoza, mannoza, arabinoza, ramnoza, galakto- za, mannit, inozyt, mezoinozyt, gliceryna, octan sodowy, cytrynian sodowy, kwas bursztynowy.Sorboza, sorbit, erytryt, adonit, dulcyt nie po¬ zwalaja na rozwój lub jest on bardzo ograniczo¬ ny. Mozna wiec powiedziec, ze skladników tych nie stosuje sie. Porównanie miedzy S.actuosus a dwoma szczepami streptomycyny opisanymi w „Bergey's Manual of determinative Bacterio¬ logy".Te dwa szczepy, Streptomyces fasciculus (opi¬ sany pierwotnie przez Krassilnikowa) i Strep¬ tomyces carnosus (opisany przez Miliarda i Bur- ra) sa szczepami najbardziej zblizonymi do szczepu wytwarzajacego antybiotyk 9.671 R.P., nazwanego w opisie Streptomyces actuosus.Róznice we wlasciwosciach rozwojowych i bio¬ chemicznych uwidocznione sa w przytoczonej tablicy V.Nitki zarodnikowe Ksztalt zarodników Agar syntetyczny z sacharoza (1) Agar syntetyczny i z glukoza (C) Agar z pozywka (5) Zelatyna (tf) . Mleko (K) Skrobia (19) Azotan (H) Tabl S. fasciculus proste podluzny grzybnia napowietrz¬ na, slabo rozwinieta, szara przejscie w stan cie¬ kly przecietne koagulacja i peptoni- zacja szybkie hydroliza szybka redukcja do azotynu slaba ic a V S.carnosus — walcowaty grzybnia wegetatyw¬ na, szara, opary bla¬ de, bezbarwny pro¬ dukt wypacania w kropelkach na calej powierzchni grzybnia wegetatyw¬ na , szara, blado oliw¬ kowa przejscie w stan cie¬ kly szybkie po koagulacji naste¬ puje przejscie w stan ciekly hydroliza redukcja S.actuosus wygiete owalny grzybnia wegetatyw¬ na bezbarwna, brak produktu wypacania grzybnia wegetatyw¬ na bezbarwna brak grzybni napo¬ wietrznej przejscie w stan cie¬ kly powolne i niecal¬ kowite nie ma koagulacji, peptonizacja powolna hydroliza powolna i niepelna (zatrzymana przy stadium dekstry¬ ny) redukcja dobraSposób Wytwarzania antybiotyku 9.671 R.P. polega zasadniczo na hodowaniu szczepu Strep¬ tomyces 40.037 lub jego mutacji w odpowiednim srodowisku i warunkach i na nastepnym wy¬ osobnieniu antybiotyku, wytworzonego podczas tej hodowli.Szczep Streptomyces 40.037 mozna hodowac stosujac kazda metode aerobowej hodowli po¬ wierzchniowej lub podpowierzchniowej, przy czym ta ostatnia jest korzystniejsza ze wzgledu na wygode. Do tego celu stosuje sie róznego ro¬ dzaju aparature, uzywana powszechnie w prze¬ mysle fermentacyjnym.Mozna stosowac zwlaszcza nastepujacy tok operacji: Streptomyces 40.037 — produkt wyjsciowy Hodowla na agarze Hodowla w kolbie wstrzasanej Posiew w zbiorniku fermentacyjnym Hodowla produkcyjna w zbiorniku fermenta¬ cyjnym.Srodowisko fermentacyjne powinno zasadni¬ czo zawierac zródlo przyswajalnego wegla i azo¬ tu, skladniki mineralne i ewentualnie czynniki wplywajace na wzrost, przy czym wszystkie te skladniki mozna wprowadzac w postaci sub¬ stancji okreslonych lub mieszanin zlozonych, jakie wystepuja w substancjach biologicznych róznego pochodzenia.Jako zródlo wegla przyswajalnego mozna sto¬ sowac weglowodany, takie jak glukoza, sacha¬ roza, laktoza, dekstryny, skrobia, melas lub inne substancje weglowodorowe, jak alkoholo-cukry: gliceryna, mannit, lub niektóre kwasy organicz¬ ne: kwas mlekowy, cytrynowy, winowy. Pewne oleje zwierzece lub roslinne, jak olej smalcowy lub olej sojowy moga z korzyscia zastapic te rózne zródla weglowodorowe lub moga byc tez do nich dodane.Odpowiednimi zródlami azotu przyswajalne¬ go moga byc bardzo rózne substancje. Moga nimi byc substancje chemiczne bardzo proste jak azotany, nieorganiczne i organiczne sole amonowe, mocznik, aminokwasy. Mozna je tak¬ ze wprowadzac poprzez substancje zlozone za¬ wierajace azot glównie w postaci proteidów: ka¬ zeiny, albuminy mleka, glutenu i ich produktów hydrolizy, maki sojowej, z orzeszków ziemnych, maczki rybnej, ekstraktów miesnych, drozdzy, distillers solubles, namok kukurydziany.Niektóre sposród dodawanych skladników nieorganicznych moga dzialac jako mieszaniny buforowe lub neutralizujace, jak fosforany me¬ tali alkalicznych lub mejtali ziem alkalicznych albo weglany wapnia i magnezu.Inne wplywaja na równowage jonowa po¬ trzebna dla rozwoju szczepu Streptomyces 40.037 i do wytworzenia antybiotyku i sa nimi chlorki i siarczany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych. Wreszcie niektóre dzialaja zwlasz¬ cza jako aktywatory reakcji przemiany materii Streptomyces 40.037 i sa nimi sole cynku, kobal¬ tu, zelaza, miedzi, manganu.Wartosc pH srodowiska fermentacyjnego przy rozpoczeciu hodowli winna wynosic 6,0 — 7,5.Temperatura optymalna dla fermentacji jest 26 — 27°, lecz zadawalajacy rozwój hodowli produkcyjnej uzyskuje sie juz w temperaturach zawartych miedzy 23° a 35°. Napowietrzanie sro¬ dowiska fermentacyjnego moze zmieniac sie w szerokich granicach. Stwierdzono jednakze, ze doprowadzanie powietrza w ilosci 0,5 — 2 li¬ trów na litr bulionu na minute jest specjalnie korzystne. Najlepsza wydajnosc antybiotyku uzyskuje sie po 3 — 5 dniach rozwoju hodowli, przy czym czas ten zalezy zasadniczo od zasto¬ sowanego srodowiska.W zwiazku z powyzszym uwaza sie, ze ogólne warunki hodowli szczepu Streptomyces 40.037 dla wytwarzania antybiotyku moga zmieniac sie w szerokich granicach i mozna je dostoso¬ wac w zaleznosci od potrzeby.Antybiotyk 9.671 R.P. mozna wyosobnic z brzeczki fermentacyjnej róznymi sposobami.Brzeczke fermentacyjna mozna przesaczac przy pH 6 — 9, lecz w tym przypadku znaczna czesc aktywnej substancji pozostaje w placku filtra¬ cyjnym, z którego nalezy wyekstrahowac reszte substancji czynnej. Korzystniej jest wiec prze¬ saczac brzeczke przez pH miedzy 1 — 6, bowiem w tych warunkach substancja czynna pozostaje w placku filtracyjnym, skad ekstrahuje sie ja za pomoca rozpuszczalnika nalezacego do grupy alkoholi alifatycznych, takich jak metanol, eta¬ nol, propanole lub butanole, do grupy ketonów, jak aceton lub metyloizobutyloketon, do grupy estrów, jak octan etylu. Mozna takze brzeczke fermentacyjna ekstrahowac rozpuszczalnikiem organicznym, nie mieszajacym sie z woda, nale¬ zacym do grupy alkoholi alifatycznych o C4 lub C5, do ketonów lub estrów. W przypadku tym substancja czynna przechodzi do fazy organicz¬ nej, która oddziela sie od fazy wodnej przez od¬ saczenie lub odwirowanie.Surowy produkt mozna wyosobnic z wyzej podanych roztworów organicznych przez zagesz¬ czenie roztworu organicznego do malej objeto¬ sci. Przez oziebienie lub dodanie rozpuszczalni¬ ka, w którym antybiotyk nie rozpuszcza sie, ta¬ kiego jak eter naftowy lub cykloheksan, surowy 9antybiotyk wytraca sie. Jezeli antybiotyk znaj¬ duje sie w przesaczu brzeczki hodowlanej, to roztwór ten ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda, takim jak alkohol alifatyczny o C4 lub C5, keton, jak metyloizobu- tyloketon, ester jak octan etylu lub amylu albo rozpuszczalnik chlorowany, jak chloroform albo dwuchlorooctan. Nastepnie postepuje sie jak podano powyzej, to jest zageszcza sie do malej objetosci i wytraca.Antybiotyk 9.671 R.P. mozna nastepnie prze- krystalizowac przez rozpuszczenie otrzymanego osadu w kwasie octowym przy lekkim ogrze¬ waniu i przez nastepne oziebienie. Jezeli suro¬ wy produkt jest za bardzo zanieczyszczony, aby go mozna bezposrednio przekrystalizowac lub jezeli pozadane jest otrzymanie produktu bar¬ dzo czystego, korzystnie jest surowy antybiotyk dwa razy oczyszczac. Pierwsze oczyszczanie po¬ lega na przemyciu surowego antybiotyku roz¬ puszczalnikiem organicznym,w którym antybio¬ tyk rozpuszczalby sie slabo lub w ogóle nie, jak na przyklad metanol, etanol, benzen, lub eter naftowy, nastepnym odsaczeniu i wysuszeniu.Drugie oczyszczanie polega na chromatografo- waniu antybiotyku czesciowo juz oczyszczonego przez wyzej wspomniane przemycie. Chromato- grafuje sie stosujac kolumne z tlenkiem glino¬ wym, przez która przepuszcza sie roztwór pro¬ duktu w odpowiednim rozpuszczalniku. Jako rozpuszczalnik mozna stosowac na przyklad roz¬ puszczalnik chlorowany jak chloroform lub dwu- chloroetan albo mieszanine jednego z tych chlorowanych rozpuszczalników z rozpuszczal¬ nikiem, w którym antybiotyk slabo sie rozpusz¬ cza, jak na przyklad metanol lub etanol. Pro¬ dukt eluuje sie tym samym rozpuszczalnikiem.Eluat zateza sie i antybiotyk wytraca przez do¬ danie rozpuszczalnika, w którym antybiotyk nie rozpuszcza sie jak podano powyzej.W ten sposób oczyszczone produkty rozpusz¬ cza sie przy lekkim ogrzewaniu w kwasie octo¬ wym lodowatym lub w roztworze wodnym kwa¬ su octowego. Po przesaczeniu roztworu i doda¬ niu wody nastepuje krystalizacja przy oziebia¬ niu i lagodnym mieszaniu.Rozumie sie, ze powyzsze rózne metody mozna stosowac kolejno, w dowolnym porzadku lub powtarzac kilkakrotnie, zaleznie od wymagan produkcyjnych dla otrzymania antybiotyku 9.671 R.P. w postaci odpowiedniej dla branego pod uwage zastosowania.Ponizsze przyklady nie ograniczajac wynalaz¬ ku wyjasniaja jak mozna stosowac go w prakty¬ ce. W przykladach tych aktywnosc okreslano metoda turbidymetrii (oznaczanie ilosci substan¬ cji przez pomiar zmetnienia), przy uzyciu Sta- phylococcus aureus 209 P jako czulego zarodka i przez porównanie z próbka produktu czyste¬ go i krystalicznego jako wzorca. Aktywnosc okreslana jest wiec w mikrogramach (jug) kry¬ stalicznego produktu wzorcowego na l*mg pro¬ duktu stalego i w fig krystalicznego produktu wzorcowego na 1 cm3 roztworu.Przyklad I. Do zbiornika fermentacyjnego o pojemnosci 75 litrów wprowadza sie: namok kukurydziany (50% suchej substancji) ...... ; 800 g sacharoza . 1200 g siarczan amonowy . . . . 80 g woda wodociagowa . . . . 35 1 Wartosc pH doprowadza sie do okolo 5,2 przez dodanie 20 cm3 roztworu wodorotlenku sodowego (d = 1,33). Nastepnie dodaje sie: weglan wapniowy .... 300 g Srodowisko sterylizuje sie w temperaturze 122° w ciagu 40 minut przez wprowadzanie pa¬ ry za pomoca belkotki. Po zakonczonej stery¬ lizacji i oziebieniu do temperatury 27° objetosc koncowa bulionu wynosi 40 litrów, a pH = 7,15.Nastepnie srodowisko posiewa sie 250 cm3 kul¬ tury szczepu Streptomyces 40.037 znajdujacej sie we wstrzasanej erlenmeyerce.Kulture w zbiorniku fermentacyjnym napo¬ wietrza sie powietrzem wyjalowionym wpro¬ wadzonym w ilosci 3 m3/godzine i miesza za pomoca smigla o 400 obrotach na minu¬ te. Utrzymuje sie temperature 27°. Wartosc pH osrodka nie zmienia sie (7,15) w ciagu 4 go¬ dzin, a nastepnie powoli obniza sie do 6,85.Temu spadkowi wartosci pH odpowiada rozwój grzybka i jest odpowiednia pora na wprowa¬ dzenie do zbiornika fermentacyjnego kultury produkcyjnej w 28 godzin po posianiu srodo¬ wiska.Kulture produkcyjna doprowadza sie do zbiornika fermentacyjnego o objetosci 350 li¬ trów, który zaladowany jest nastepujacymi sub¬ stancjami: maczka sojowa . . . ..'•.' 8 kg distillers solubles 1 kg glukoza (uwodniona) .... 1 kg olej sojowy . . ... . 41 weglan wapniowy . . . . 2 kg chlorek sodowy ... ... 2 kg woda . 175 1Wartosc pH srodowiska przed sterylizacja wynosi 6,95. Srodowisko sterylizuje sie w tem¬ peraturze 122° w ciagu 40 minut przez wpro¬ wadzanie pary za pomoca belkotki. Po zakon¬ czonej sterylizacji i oziebieniu do 27°, obje¬ tosc koncowa bulionu wynosi 200 litrów, a jego pH = 7,20. Nastepnie srodowisko to posiewa sie 20 litrami kultury poprzedniej ze zbiornika fermentacyjnego o pojemnosci 75 litrów. Srodo¬ wisko miesza sie za pomoca mieszadla tur¬ binowego z szybkoscia 205 obrotów na minute, napowietrze 10 m3 wyjalowionego powietrza na godzine i utrzymuje temperature 27°.Wartosc pH w ciagu 24 godzin powoli opada, po czym nastepuje jego wzrost. Z chwila wzro¬ stu pH rozpoczyna sie wytwarzanie antybio¬ tyku. Zakonczenie fermentacji nie jest niczym zaznaczone na krzywej zmian pH. Ma ono miej¬ sce po okolo 90 godzinach. Aktywnosc srodo¬ wiska wynosi wówczas 295 //g/cm3.Przyklad II. 190 litrów brzeczki fermen¬ tacyjnej (aktywnosc 295 pg/cm* z przykladu I) umieszcza sie w zbiorniku zaopatrzonym w mie¬ szadlo. Brzeczke miesza sie w ciagu godziny z 110 litrami butanolu, doprowadzajac pH do 5 za pomoca rozcienczonego kwasu solnego, po czym dodaje 19 kg pomocniczego srodka filtra¬ cyjnego. Mieszanine przesacza sie przez prase filtracyjna, a placek filtracyjny przemywa 50 li¬ trami wody. Faze organiczna oddziela sie, po czym przemywa 11 litrami wody o pH = 9, a nastepnie 11 litrami wody o pH = 5. Ponow¬ nie oddziela sie warstwe organiczna, po czym zageszcza ja pod zmniejszonym cisnieniem do 1/100 poczatkowej objetosci brzeszki, badz do 1,9 litra. Nastepnie wstawia sie do lodówki na okres 24 godzin, po czym wytracony osad odsa¬ cza, przemywa i suszy. Otrzymuje sie 88 g su¬ rowego produktu o aktywnosci 434 //g/mg.Przyklad III. Z 70 g produktu otrzyma¬ nego w przykladzie II o aktywnosci 434 /tg/mg, tworzy sie zawiesine w 1400 cm3 metanolu i mie¬ sza w ciagu godziny w temperaturze 30°. Sub¬ stancje nierozpuszczona odsacza sie i suszy.Otrzymuje sie 29 g produktu o aktywnosci 825 //g/mg.Produkt ten rozpuszcza sie w 750 cm3 miesza¬ niny chloroformu i metanolu (90:10 objetoscio¬ wo). Roztwór przesacza sie i nastepnie chroma¬ tografuje w kolumnie zawierajacej 600 g tlenku glinowego (wysokosc kolumny 61 cm, srednica 3,5 cm). Chromatogram rozwija sie i eluuje za pomoca 1500 cm3 tej samej mieszaniny chloro¬ formu i metanolu.Frakcje bogate laczy sie, zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do 40 cm3 i straca za pomoca 400 cm3 heksanu. Osad odsacza sie, przemywa i suszy. Otrzymuje sie 23 g produktu o aktywnosci 950 ^g/mg.Zawiesine 10 g tego ostatniego produktu (aktywnosc 950 //g/mg) w 200 cm3 lodowatego kwasu octowego ogrzewa sie do 50° w ciagu w ciagu 5 minut. Roztwór przesacza sie, dodaje do niego 2,5 cm3 wody i powoli oziebia. Otrzy- nane krysztaly odsacza sie, przemywa i suszy.Otrzymuje sie 8 g czystego produktu o aktyw¬ nosci 1000 //g/mg.Przyklad IV. 170 litrów brzeczki fermen¬ tacyjnej o aktywnosci 166 fig/cm3 umieszcza sie w zbiorniku zaopatrzonym w mieszadlo. War¬ tosc pH doprowadza sie do 5 za pomoca roz¬ cienczonego kwasu siarkowego. Dodaje sie 95 litrów octanu etylowego i mieszanine miesza w ciagu godziny. Faze organiczna oddziela sie przez odwirowanie na wirówce zdolnej oddzie¬ lic rozpuszczalnik organiczny z wodnej zawie¬ siny substancji nierozpuszczalnych (Westphalia SKOG 205). Otrzymuje sie 82 litry roztworu organicznego, który przemywa sie, a nastepnie zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do ob¬ jetosci 1,7 litra. Po obróbce wedlug przykladu II otrzymuje 320 //g/mg. 35 g tego produktu zawiesza sie w 700 cm3 metanolu i miesza w ciagu godziny w tempera¬ turze 30°. Osad odsacza sie i suszy. Otrzymuje sie 11,1 g produktu o aktywnosci 725 //g/mg.Przez rozpuszczenie 10 g tego produktu w 200 cm3 lodowatego kwasu octowego i po obróbce wedlug przykladu III, otrzymuje sie 6,3 g kry¬ stalicznego produktu o aktywnosci 925 //g/mg. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku oznaczonego numerem 9.671 R.P., znamienny tym, ze do jego wytwarzania stosuje sie orga¬ nizm oznaczony jako szczep Streptomyces actuo- sus lub jeden z jego mutantów, którego kultu¬ ra zaszczepia sie srodowisko wodne pozywki zawierajace zródla przyswajalnego wegla, azotu i soli mineralnych i prowadzi fermentacje aero- bowa tego srodowiska az do wytworzenia odpo¬ wiedniej aktywnosci antybiotycznej, po czym wyosabnia antybiotyk ze srodowiska fermenta¬ cyjnego. Rhóne — Poulenc S.A. Zastepca: inz. Józef Felkner rzecznik patentowyDo opisu patentowego nr 47858 [ iar T VI 4 Il l •i I 1P r t l i / V V J ( F32 * A ¦ a —-1 F~ ^ a a 1 , ^r Mu A i r T I —T— 1 fl / r U 1/ i « i < V *d A/. ;- 1 : 0 0 0 0 A\ 1 *' 0 o ) A A "J rr i l 1 ii, ATjSl T T i 1/ V TT 1 | 7 ^/V -1 i = p— ) ^ l t b= f \f f J =3 1 ff \ 7 V, H 4 1 B= ) t - r~ % V \ \ —* 1 • T 1 i ,tt i a 1 < TJ D 9 0 e i ) » \ na "i Tl •J- i 70 1 l.° 1 ?0 1 I I JJ Z.G. „Ruch" W-wa, zam. 1159-63 naklad 100 egz. PL