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Publication number: BE572686A
Authority: BE

Description


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   La présente invention concerne, de manière générale, de nouveaux composés   steroïdes   et des procédés pour leur préparation. Plus particulièrement, elle est relative   à   de nouvelles 16Ó-alcoyl-11Ó,   17a-dihydroxy-4-prégnène-3,20-dio-   nes et au procédé de préparation de ces composés en partant de 16Ó-alocy1-4- prégnène-3,20-diones. 



   Les nouveaux composés   16-alcoyl-lla,17a-dihydroxy-4-prégnène-3,20   diones préparés conformément à la présente invention peuvent être aisément trans- 
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 formés en l6lx-alcoyl-l7cc,21-dihydroxy-°-prégnène-3,11,20-triones et en 16a-alcoylll3,177a,21-trihydroxy-4-prégnène-3,20-diones, ces composés possédant une activité anti-inflammatoire extrêmement élevée pour le traitement de l'arthrite et de maladies analogues. 



   Pour préparer les nouveaux composés chimiques suivant la présente invention, on utilise, comme matière de départ:,un composé connu qu'est une   16a-alcoyl-4-prégnène-3,20-dione   ayant la formule de struction suivante : 
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 dans laquelle R est un radical alcoyle. 



   Conformément à la présente invention, cette 16a-alcoyl-4-prégnène- 3,20 dione de départ est soumise à l'action d'une enzyme oxydante produite par une souche oxygénante de Dactylium dendroides dans des conditions aérobies pour 
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 former une 16a-alcoyl-lla, 17a-dihydroxy-4-prégnéne-3,20-dione, composé ayant la formule de structure suivante : 
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 dans laquelle R a la signification indiquée plus haut. 
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  La 16a-alcoyl-lla -17a-dihydroxy-4-prégnène-3,20-dione obtenue peut être bromée dans la position 21 avec du brome et du chloroforme, pour former une 16a-alcoyl-21-bromo-lla,l7a-dihydroxy-4-prégnène-320-dione. Par réaction de ce dernier compose avec de l'acétate de potassium, il se forme un 21-acétate de 16a-alcoyl-lla,17OE,21-trihydroxy-4-prégnène-3,20-dione. Ce dernier composé est aisément oxydé avec du bichromate de sodium dans de l'acide acétique, la 16aalcoyl-I7a21-dihydroxy-4-prégnène-3,11,20-trione. 



   La 16a-alcoyl-   17a,   21-dihydroxy-4-prégnène-3,11,20-trione peut être convertie en bis-semicarbazone, réduite avec du borohydrure de sodium et hydroly- 
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 sée, en sorte qu'on obtient la semicarbazone de 16a-alcoyl-ll,17a,21-trihydroxy- 4-prégnène-3,20-dione. 



  Il a été constaté que les 16a-alocyl-l'La,17-u-dihydroxy4-prégnène- 3,20-dione et les 16a-alcoyl-11µ,17a,21-tiihyàroxy-4-prégnène..3,20-dione possèden- une activité anti-inflammatoire extrêmement élevée. 



   Pour l'exécution du procédé suivant la présente invention, des   souche:   de Dactylium dendroides capables d'effectuer l'oxygénation d'une 16a-alcoyl-4- prégnène-3,20-dione peuvent être obtenues à partir de collections de cultures 
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 connues. Par exemple, une telle culture, le ¯D4c¯ty¯1¯+um¯¯¯fiemdrgîdep No NRRL 2574, peut être obtenue des Northern Regional Research Laboratories à Peoria (Illinois - U.S.A) Le microorganisme est développé dans des conditions aérobies dans un 
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 milieu nutritif approprié en contact intime avec la 16a-alcoyl-4-prégnène-3,20- dione à oxygéner, la fermentation ou croissance du microorganisme étant poursui- vie jusqu'à ce que l'oxygénation désirée se soit produite.

   Ainsi, la 16a-alcoyl- 4-prégnène-3,20-dione à oxygéner peut être incorporée directement dans un milieu approprié, qui est alors   .inoculé   à l'aide d'une   Bouche   oxygenante de Dactylium dendroides et incubé dans des conditions aérobies, de manière à réaliser   l'oxygé-   nation désirée. En général, le procédé est, de préférence, exécuté en faisant d'abord pousser le microorganisme dans un milieu de fermentation approprié, puis en ajoutant le   16a-alcoyl-4-prégnène-3,20-dione   et en continuant à cultiver le microorganisme dans des conditions aérobies pendant un temps suffisant pour réaliser l'oxygénation désirée,. 



   Le procédé suivant la présente invention peut être exécuté dans des cultures immobiles et immergées de Dactylium   dendroides   se développant dans des conditions aérobies, bien que, en pratique, ce procédé s'exécute le plus commo- dément en faisant pousser le microorganisme dans des conditions submergées dans un milieu de fermantation aqueux approprié contenant le steroide. La quantité de   steroïde   qui peut être convenablement oxydée par le présent procédé dépend en partie du milieu particulier employé. 



   Les milieux nutritifs aqueux convenant pour la croissance de souches oxygénants de   Dactylium   dendroides doivent contenir des sources de carbone et d'azote assimilable, ainsi que des quantités mineures de sels minéraux. N'importe quelle source usuelle de carbone assimilable, telle que dextrose,   cérélose,   gluco- se, mélasse intervertis et analogue, employée dans les milieux de fermentation peut être utilisée pour exécuter le procédé suivant l'invention.

   De même, les sources complexes d'azote communément utilisés dans les procédés de fermentation commerciaux, telles que les produits de digestion lactalbuminique   ("Edamine")   et la liqueur de macération de mais, ou une source inorganique d'azote, telle que nitrate de sodium, le nitrate d'ammonium et analogues, conviennent pour être utilisées dans les milieux de fermentation. Des quantités mineures de sels inor- ganiques, tels que des sels solubles appropriés de magnésium, de potassium, de sodium et de fer, sont habituellement contenues dans des sources complexes de carbone et d'azote ou peuvent être avantageusement ajoutés au milieu de fermenta- tion en quantités mineures, pour promouvoir une croissance maximum du   microorga-   nisme   exygènant.   

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     On   donnera ci-après un exemple d'un milieu nutritif aqueux approprié, qui peut être utilisé dans le présent procédé d'oxydation de steroïdes : 
MILIEU N  1. 
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  Dextrosp .....O.40¯GO OOOOOÓ0800..o....a. 50.0 ( NH 4 ) 2 HP04 0 0 0 0 o e o e o 0 0 0 0 o e o 0 0 o e w o e e e a 7'5 K2HPO 4 .......... 0 ........ 0 .............. 1.0 KCl e4eeavaaooovoeaaoooeoeoavvraevaoaaveoa zou MgSO 7HO .......................... 0.5 FESO 4 7HG .........0.......'......'. 0 <001 ZnSO 4 . 7.nV a a v s e a o a o c a e e s c o- o e o e o s e e o 0.01 De l'eau distillée est ajoutée pour donner un volume total de 1 litre de milieu nutritif et le pH est ajusté à 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium. 



   L'addition de quantités mineures d'agents antimousse, bien que non essentielle, est souhaitable avec certains milieux de fermentation, afin d'obtenir de. s rendements maxima en produit oxygéné désiré. On a constaté que l'addition à certains lilieux de fermentation d'une oxazaline substituée, qui constitue un agent tensio-actif cationique du type amine non   volatil,   vendu sous le nom   comme#--   
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 cial de "Alkaterge 011, est particulièrement et-..cr.e pour réduire la quantité de mousse, bien que d'autres agents anti-mousse, connus pour leur utilité dans ce domaine, puissent aussi être utilisés. 
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 Par exemple, la 16r-méthyl-°prêgnène-ï20-dinne peut être oxygénée par le mode opératoire suivant :

   
Un milieu de culture stérile, tel que celui indiqué plus haut, est d'abord inoculé en y introduisant une petite quantité de suspension de spores d'une culture végétative d'une souche oxygénante de   Dact lîum   dendroides. 



  Le milieu nutritif inoculé est alors incubé à une température d'environ 27-28 C, tout en étant agité en présence d'oxygène pendant environ 24 à 48 heures. A ce moment, une solution de 16a-méthyl-4-prégnène-3,20-dione dans du propylène glycol est ajoutée au milieu de fermentation et l'agitation et l'aération du milieu nutritif sont poursuivis pendant environ 5 à 30 heures ou jusqu'à ce que l'oxygé- nation soit terminée. 



   Lorsque l'oxygénation est terminée, le steroide oxygéné peut être récupéré du bouillon de fermentation par extraction à l'aide d'un solvant organi- que non miscible à l'eau approprié pour les steroïdes oxygénés. 



  Comme solvants appropriés à cette fin, on peut citer le chloroforme, le chlorure de méthylène, les esters d'acides organiques, les hydrocarbures aromatiques et analogues. La solution contenant le steroide oxygéné désiré peut alors être éva- porée de manière à fournir le produit désiré, qui peut être purifié par recris- tallisation ou par d'autres méthodes courantes dans la technique. 
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  La 16a-alcoyl-lla,l7a-dihydroxy-4-prégnène-3,20-dione obtenue peut être bromée dans la position 21 avec du brome et du chloroforme, de manière à former de la 16a-alcoyl-21-bromo-lla,17a-dihydroxy-4-prégnène-3,20-dione. Par réaction de ce dernier composé avec de l'acétate de potassium, il se forme du 21-acétate de 16a-alcoyl-lla,17a,21-tiihydroxy-4-prégnène-3,20-dione. Ce dernier composé peut alors être oxydé avec du bichromate de sodium dans de l'acide acéti- que glacial, de manière à former de la 16a-alcoyl-17a,21-dihydroxy-4-prégnène- 3,11,20-trione. 



  La 16a-alcoyl-17a,21-dihydroxy-°-prégnène-3,1120-trione peut être convertie en bis-semicarbazone, réduite avec du borohyrure de sodium. Par hydroly- se, on obtient de la semicarbazone de 16a-alcoyl-113,17a,21-trihydroxy-4-prégnène- 3,20-dione. 

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   L'exemple suivant illustre un mode opératoire sur l'exécution du procédé suivant l'invention. 



   Exemple 1. 



   Environ 3,2 litres du milieu nutritif n 1 montré plus haut et la quantité minimum d'une oxazaline substituée ("Alkaterge C") nécessaire pour empêcher le moussage ont été stérilisés pendant   1/2   heure à 100 C. Après stérili- sation, le milieu a été inoculé avec environ 250 ml d'une culture végétative   d'un   souche oxydante de Dactylium dendroides NRRL 2574 de la collection des Northern Regional Research Laboratories de Peoria (Illinois; U. S.A.). Le mélange,a alors été agité en utilisant un agitateur du type à 2 turbines tournant à 560 tours par minutes et on a fait passer de l'air dans le mélange à raison de 3 litres par minute, en maintenant la température à 28 C pendant 24 heures environ. 



   Au bout de la période de 24 heures, 1,28 g de   16a-méthyl-4-prégnène-   3,20-dione dissous dans 160 ml de propylène glycol a été ajouté au milieu ferment et l'agitation du milieu a été poursuivie à la même vitesse. L'aération du milieu a été poursuivie à un débit de 3,0 litres par minute pendant 6 heures, puis in- terrompue pendant 6 heures. Ce mode opératoire a été poursuivi pendant 36 heures après l'addition du steroide. 
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  De la 16a-méthyl-lla,l7a-dihydroxy-4-prégnéne-320-dione cristalline a été isolée du milieu fermenté par extraction avec de l'acétate d'éthyle, évaporation du solvant organique sous vide et recristallisation de la matière résiduel le dans de l'acétate d'éthyle. 



   REVENDICATIONS. 
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  1.- A titre de nouveaux composés, les a-alcoyl-1I,17a-dihydroxy-   4-prégnène-3,20-diones,   
2.- A titre de nouveaux composés, la   16a-méthyl-lla,17a-dihydroxy-   
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 4-prégnène-3e2O-dione. 



  3.- Procédé de production d'une 16a-alcoyi-iia-170e-dihydroxy-4- prégnène-3,20-dione, dans lequel on soumet une   16a-alcoyl-4-prégnène-3,20-dione   à l'action d'une enzyme oxydante produite par une souche oxygénante de Dactylium dendroides dans des conditions aérobies. 
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  4.- Procédé de production de 16a-méthyl-1lc,l7a-dihydroxy-q.-prégnène- 3,20-dione, dans lequel on.soumet de la l6oc-mëthyl4-prégnène-320-dione à l'ac- tion d'une enzyme oxydante produite par une souche oxygénante de Dactylium   dendroides   dans des conditions aérobies. 



   5. Procédé dans lequel on cultive une souche oxygénante de Dactylium dendroides dans un milieu aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables dans des conditions aérobies submergées en contact intime avec une 16a-alcoyl-4-prégnène-3,20-dione, de manière à produire une 16Ó-alcoy1-11Ó, 
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 17a-dihydroxy-4-prégnène-320-dione. 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

6. - Prooédé dans lequel on cultive une souche oxygénante de Dactylium dendroides dans,¯un milieu aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables dans des conditions aérobies submergées en contact intime avec de la 16a-méthyl-4-prégnène-3,20-dione, de manière à produire de la 16Ó-méthyl-11Ó, 17a-dihydroxy-4-prégnène-3,20-dione. **ATTENTION** fin du champ CLMS peut contenir debut de DESC **.