KR970004013B1 - 유기용매를 사용하는 트립토판 합성효소에 의한 엘(l)-트립토판의 개선된 제조방법 - Google Patents

Abstract

요약없음

Description

유기용매를 사용하는 트립토판 합성효소에 의한 엘(L)-트립토판의 개선된 제조방법

제1도는 본 발명의 L-트립토판 합성효소원으로 사용된 균주인 이.콜라이(E.coli)의 배양시간에 따른 균체 및 효소 활성을 나타네는 도면이다.

본 발명은 트립토판 합성효소를 이용하여 인돌 및 세린으로부터 L-트립토판을 제조함에 있어 유기 용매를 사용하여 L-트립토판의 수율을 증대시키는 개선된 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 인돌에 대한 용해도가 매우 높은 수-비혼화성 유기용매와 인돌에 대한 용해도는 비교적 낮지만 효소의 안정성을 증진시키는 수-혼화성 유기 용매를 함께 사용하여 효소반응을 수행함을 특징으로 하는, 개선된 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.

L-트립토판은 무취이며 약간의 쓴맛을 지닌 황백색의 결정으로 인체내에서 합성되지 않는 8가지 필수 아미노산 중의 하나로 식품, 사료 등의 영양강화제 및 의약품으로서 매우 유용하게 이용되는 화합물이다. 특히 옥수수와 같은 일반 곡류에 부족하기 쉬운 아미노산으로 이런 곡물을 주원료로 하는 가축사료에 첨가해주면 사료의 질을 향상시킬 수 있다. 또한 정신분열증 및 알콜중독중의 치료제로서의 가능성을 제시되었다[Bioindustry, 7권 6호, pp.414-429, (1990)]. 이와 같이 L-트립토판은 광범위한 유용성을 갖지만 비교적 고가의 아미노산이란 이유로 그 이용이 제한되어 있는 실정으로 생산 비용을 절감하기 위해 L-트립토판의 생산공정에 대한 지속적인 연구가 수행되고 있다.

L-트립토판의 제조방법은 크게 화학합성법과 생물학적 방법의 2가지로 분류할 수 있다. 화학합성법에는 여러가지 공법이 있는데 주로 베타-시아노프로피온 알데하이드를 출발원료로 하는 방법이 이용되고 있다.

베타-시아노프로피온 알데히드로부터 하이단토인 물질을 합성한 후 환원시키면 5-포르밀에틸하이단토인을 얻게 되는데, 이 물질을 산의 존재하에서 페닐하이드라진과 반응시키면 인돌핵을 형성하여 인돌릴메틸렌 하이단토인을 얻게 되며 이를 알칼리에 의하여 가수분해하면 DL-트립토판을 얻게 된다. 이외에도 인돌을 출발물질로하는 방법이 있지만 수율이 낮아 대부분 상기의 방법을 사용하고 있다. 하지만 이런 화학합성법은 반응 공정이 복잡할 뿐아니라 DL-형의 트립토판을 생산하게 되어 생체적으로 활성을 갖는 L-형의 트립토판을 얻기 위해 광학분할을 해야하는 등의 문제점을 가지고 있다.

생물학적 방법은 미생물을 이용하여 탄소원인 포도당을 출발물질로 하여 이로부터 직접 L-트립토판을 제조하는 직접발효법, L-트립토판 생합성 경로의 중간대사산물을 전구물질로 하는 소위 반발효법, 인돌과세린 또는 인돌과 암모니아 및 피루브산 사이의 효소적 축합반응을 이용하여 한 단계로 전환시키는 효소법등으로 나눌 수 있다.

발효법은 전구물질이 싸고 공정이 간단하다는 장점이 있지만 비교적 낮은 농도의 L-트립토판이 생성된다. 이 문제점을 극복하기 위하여 돌연변이주나 재조합균주들을 이용하고 있지만 여전히 생성물의 최종 농도는 낮은 편이다. 반면에 효소법은 사용하는 기질들이 비교적 비싸다는 단점을 가지고 있지만, 화학합성법에 비해서는 공정이 간단하고 높은 농도의 L-트립토판을 생산할 수 있고 사용하는 기질이 간단하여 분리와 정제가 쉽다는 잇점을 갖는다. 사실 L-트립토판과 같은 생물학적 물질을 제조하는데는 분리와 정제 비용이 전체 비용에 있어 매우 많은 부분을 차지한다는 것은 주지의 사실이다. 이와 같은 이유로 효소를 이용한 반응에 있어서는 전구체가 최종 생성물로 전환되는 반응속도 및 그 수율과 더불어 반응계내의 최종 생성물 농도가 매우 중요한 의미를 갖는다.

그러나 트립토판 합성효소를 이용한 L-트립토판의 제조방법에 있어서 기질로 사용되는 인돌은 800ppm정도의 매우 낮은 농도에서도 트립토판 합성효소의 활성을 저해(일본국 특허 공개 소 59-48093)할 뿐만 아니라 물에 대한 용해도가 매우 낮아 반응계내의 인돌 농도를 높이는 것이 어려운 문제점 등이 있다.

따라서 그동안 이러한 문제점을 해결하기 위한 연구가 여러 연구자들에 의해 진행되어 그 결과 효소 반응계내의 인돌농도를 트립토판 합성효소의 활성을 저해하기 시작하는 저해농도 이하로 유지시키면서 반응의 진행에 따라 인돌을 연속으로 또는 단계적으로 첨가하여 주는 방법(일본국 특허 공개 소64-51093), 인돌에 대한 용해도가 높은 각종 유기용매, 계면활성제 및 비극성 수지 등을 사용하는 방법(일본국 특허 공개소 59-11187, 일본국 특허 공개 소 62-79789, [Biotechnology and Bioengineering XXV, P999-1011, 1983]), 또한 여러가지 천연유지를 사용하는 방법(일본국 특허 공개 소 63-52885)등이 개발되었다. 그러나, 인돌을 단계적으로 첨가하는 경우 효소반응계내의 잔류 인돌농도를 주기적으로 측정하여야 하는 번거로움과 함께 효소반응계에 첨가하여준 인돌결정의 효소-함유 수계로의 용해속도가 매우 낮아 효소반응이 효율적으로 일어나지 못한다는 문제점이 있다. 각종 유기용매, 계면활성제, 천연유지 및 비극성 수지 등에 대한 인돌의 용해도가 물에 비하여 매우 높아 이들이 효소반응계 내에서 물과 혼합되어 있을 경우 이들 물질과 효소-함유 수계간의 인돌의 용해도 차이에 따른 인돌의 분배 계수의 차가 커서 전체 효소반응계내의 인돌농도는 증가시키는 반면 실질적으로 효소반응이 일어나는 효소-함유수계의 인돌농도는 감소시킬 뿐만 아니라 유기 용매에 용해되어 있던 인돌이 반응이 진행됨에 따라 빠른 속도로 효소-함유수계로 용출되어 효소-함유수계에 인돌을 원활히 공급하여 주는 인돌저장 물질의 역할을 함으로써 효소의 반응이 효율적으로 일어나게 한다.

그러나, 지금까지 이용되어온 대부분의 유기용매 및 계면활성제들은 인돌의 용해도가 충분히 높지 않거나 효소에 대한 유기용매 자체의 독성으로 인하여 고농도를 이용할 수 없었기 때문에 비교적 낮은 농도의 인돌을 사용할 경우에는 효소-함유 수계의 인돌 농도를 트립토판 합성효소 저해농도 이하로 충분히 저하시키지만 높은 농도의 인돌을 사용할 경우에는 효소-함유수계의 인돌농도를 충분히 저하시키지 못하여 효소반응계내의 초기인돌 농도를 충분히 증가시킬 수 없기 때문에 대부분의 경우 인돌을 반응이 진행됨에 따라 단계적으로 첨가하여 주어야만 하며, 또한 특정 유기용매를 단독으로 사용함으로써 이들 유기용매에 의한 효소 활성의 저해가 야기되어 반응시간이 경과함에 따라 반응속도가 급격히 떨어지는 문제점 등이 있다.

이에, 본 발명자들은 인돌을 고농도로 첨가하여도 인돌이 트립토판 합성효소의 활성을 저해하지 않고 효소의 활성 및 안정성이 증진되어 트립토판의 최종 생성 농도를 증가시킬 수 있는 방법에 대해 연구를 거듭한 결과, 인돌에 대한 용해도가 높은 수-비혼화성 유기 용매와 인돌에 대한 용해도는 비교적 낮으나 효소의 안정성을 증진시킬 수 있는 수-혼화성 유기 용매를 혼합하여 사용함으로써 L-트립토판의 최종 생성 농도가 증대됨을 발결하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 수-비혼화성 유기용매와 수-혼화성 유기용매를 함께 사용하여 고농도의 인돌에 의한 트립토판 합성효소의 저해효과를 야기하지 않으면서 보다 높은 수율로 L-트립토판을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 인돌을 전체 효소반응계에 고농도로 첨가하여도 효소-함유 수계의 인돌농도는 효소활성 저해농도 이하로 유지시키면서 동시에 효소의 활성 및 안정성이 저하되지 않도록 수-비혼화성 용매와 수-혼화성 유기용매를 적절히 혼합사용하여 효소반응계 내의 초기 인돌 농도를 증가시킴으로써 최종 생성물인 L-트립토판의 농도를 증대시키기 위한 효율적이고 개선된 L-트립토판의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 따르면, 인돌에 대한 용해도가 매우 높은 수-비혼화성 유기 용매와 인돌에 대한 용해도는 비교적 낮으나 효소의 안정성을 증진시키는 수-혼화성 유기용매를 적절히 혼합하여 사용함으로써 트립토판 합성효소의 기질이면 800ppm 이상의 농도에서는 효소 활성을 저해시키는 인돌을 효소반응계에 고농도로 첨가할 경우에도 효소-함유 수계의 인돌 농도는 효소활성 저해농도 이하로 낮게 유지시키면서 이들 유기용매에 의해 효소의 안정성이 저하되는 것을 방지하여 인돌과 세린으로부터 효율적인 효소반응에 의해 L-트립토판의 최종 생성 농도를 보다 증대시킬 수 있다.

상기 수-혼화성 유기 용매에는 알콜, 에테르 등을 들 수 있으며, 수-비혼화성 유기 용매로는 알콜, 알칸, 에테르, 에스테르 및 식물성 유지 등이 포함된다.

사용될 수 있는 수-혼화성 유기 용매에는 알콜류로서 글리세롤, 솔비톨, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜 등이 포함되며, 에테르류로서 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르, 에틸렌글리콜 디메틸 에테르, 에틸렌글리콜 모노에틸 에테르, 에텔렌글리콜 디에틸 에테르, 에틸렌글리콜 모노부틸 에테르, 디엘틸렌글리콜 디엘틸 에테르, 디에틸렌글리콜 모노부틸 에테르등이 포함된다.

수-비혼화성 유기용매인 알칸으로는 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸, 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 노나데칸 및 에이코산 등이 포함되고, 사용가능한 수-비혼화성 알콜류로는 펜타놀, 헥사놀, 헵타놀, 옥타놀, 노나놀, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 노나테칸올, 에이코사놀, 벤질알콜, 페닐알콜 등을 들 수 있다. 또한, 수- 비혼화성 에테르로는 에틸에테르, 프로필 에테르, 디에틸렌글리콜 디부틸에테르 등이 있으며, 에스테르로서는 벤질벤조에이트, 프탈레이트 벤질부틸 에스테르, 프탈레이트 비스(2-에틸헥실)에스테르, 프탈레이트 비스(3,5,5-트리메틸헥실)에스테르, 프탈레이트 디알릴 에스테르, 프탈레이트 디부틸 에스테르, 프탈레이트 디사이클로헥실 에스테르, 프탈레이트 디에틸 에스테르, 프탈레이트 디이소부틸 에스테르, 프탈레이트 디이소헵틸 에스테르 및 트리부틸아세틸 시트레이트 등이 바람직하다. 식물성 유지류로는 옥수수기름, 대두유등이 있다.

이들 유기용매중에서 수-혼화성 유기용매로는 폴리에틸렌글리콜, 수-비혼화성 유기용매로는 디엘틸렌글리콜 디부틸 에스테르가 특히 바람직하다. 상기 유기 용매는 수-혼화성 유기용매와 수-비혼화성 유기용매의 혼합비율이 1 : 5(v/v) 내지 5 : 5(v/v), 바람직하게는 2 : 5 내지 4 : 5가 되도록 혼합 사용하고, 사용되는 유기용매의 총량이 일반적으로 효소반응액의 10 내지 50%(v/v) 범위가 되는 농도로 사용하며, 20 내지 40%의 농도 범위가 바람직하다.

본 발명의 트립토판 합성효소원으로는 에스케리카아 콜라이(Esherichia coli) ATCC 15490, 에스케리키아 콜라이 TRN-4, 에스케리카아 콜라이 JTS-148 등이 사용되나, 이들 대장균에 한정되는 것이 아니고 트립토판 합성효소 활성을 제공하는 것이면 어느 균주나 사용가능하다. 이들 효소원인 균체는 배양액으로부터 수득된 균체 그대로 사용하거나 또는 파쇄등의 처리를 거친 균체 처리물을 효소원으로 사용한다. 이들 효소원인 균체의 사용량은 트립토판 합성효소의 역가에 따라 달라지나 사용되는 균체의 총량이 효소 반응액의 20%(v/v)를 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 트립토판 합성효소원으로 이용되는 균체는 예를들면 다음과 같이 제조할 수 있다 : KN₂PO₄3.0g, K₂HPO₄7.0g, (NH₄)₂SO₄1.5g, MgSO₄·7H₂O 0.1g, FeSO₄·7H₂O, 0.5mg, CaCl₂10.0mg, L-라이신 0.1g, 글리세롤 5.0ml 및 증류수 1.0l의 조성을 갖는 최소배지 5ml를 직경 18mm의 시험관의 분주한 후, 121℃에서 15분간 멸균처리하고, 여기에 이.콜라이 ATCC 15490을 접종한 다음, 37℃에서 20시간 동안 진탕 배양한다. 이 전배양액을 동배지 100ml를 함유한 삼각 플라스크에 2ml씩 접종하고 다시 37℃에서 20시간 동안 진탕 배양한다.

상기와 같이 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 후 이 균체를 생리식염수로 2회 세척한다. 수득된 균체의 트립토판 합성효소의 활성을 레스터(Lester) 및 야노프스키(Yanofsky)법[J. Bacteriol., 81, p81-90, 1961]을 이용하여 측정하고 역가 단위(unit)를 수득된 단위 균체량(mg) 및 단위시간(시간)당 인돌이 트립토판으로 전환된 양(0.1μmole)으로 나타내었다(제1도 참조).

효소 반응은 pH를 7 내지 9로 조정한 0.1M 인산완충액 또는 0.1M 말레산 완충액 중에서 30 내지 40℃의 온도로 통상적으로 약 1내지 72시간 동안 수행한다.

본 발명의 방법으로 수득된 L-트립토판의 분리 및 정제 공정은 당해 분야에 공지된 방법(예를들면, 유럽 특허 제405,524호 참조)을 사용하여 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

하기 실시에들은 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로 이로써 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

참조예

본 발명에 사용되는 각 유기용매의 인돌에 대한 용해도를 알아보기 위해, 하기 표 1에 나타낸 유기용매 각각을 물과 1 : 1로 혼합하고 여기에 1%(v/v)의 인돌을 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합 용액의 각 수용액층만을 취하여 수용액층의 인돌 농도를 측정하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

실시예

실시예 1

하기 표 2의 각 유기용매를 물과 1 : 1로 혼합한 다음 여기에 상기에서 얻은 이.콜라이 균체를 1% 첨가하여 37℃에서 72시간 진탕시켰다. 각 유기용매를 포함한 반응계의 효소-함유 수계중의 트립토판 합성효소의 초기 상대활성(용매를 첨가하지 않은 경우의 활성을 100으로 하여) 및 72시간 후의 잔존활성을 각각 측정하여 그 결과를 표2에 나타내었다.

[표 2]

실시예 2

인돌 10.0g, L-세린 10.0g, 피리독살 5인산 15mg에 표 3에 나타낸 각종의 유기 용매를 첨가하고 상기에서 얻어진 이.콜라이 균체를 트립토판 합성효소의 역가로 확산하여 60,000단위가 되도록 첨가한 후 0.1M 말레산 완충액(pH 8.0)으로 최종부피가 100ml가 되게 하였다. 이 반응액을 37℃에서 60시간 동안 유지시켜 효소 반응을 수행시킨 후 반응액 중의 생성 트립토판을 고속 액체 크로마토그래피(피코-택(Pico-Tag)컬럼, 온도 : 45℃, 용매 : 0.1M 나트륨 아세테이트/60% 아세토니트릴(9/1), 첨출파장 : 254nm)로 정량하여 그 결과를 표3에 나타내었다.

[표 3]

실시예 3

인돌 1.0g, L-세린 1.0g, 피리독살 5인산 1mg에 표 4에 나타낸 각종의 유기 용매를 혼합하여 첨가한 후 실시예 2에서 사용한 바와 동일한 균체를 L 합성효소의 역가로 환산하여 60,000단위가 되도록 첨가혹 0.1M 말레산 완충액(pH 8.0)으로 최종부피가 100ml가 되게 하였다. 이 반응액을 37℃에서 1시간 동안 유지시켜 효소 반응을 수행시킨 후 반응액 중의 생성 트립토판을 고속 액체 크로마토그라피로 정량하여 결과를 표4에 나타내었다.

[표 4]

실시예 4

인돌 15.0g, L-세린 15.0g, 피리독살 5인산 15mg에 표 5에 나타낸 각종의 유기 용매를 혼합하여 첨가한 후 실시예 2에서 사용한 바와 동일한 균체를 트립토판 합성효소의 역가로 환산하여 60,000유니트가 되도록 첨가하고 0.1M 말레산 완충액(pH 8.0)을 최종부피가 100ml가 되게하였다. 이 반응액을 37℃에서 60시간 동안 유지시켜 효소 반응을 수행시킨 후 반응액 중의 생성 트립토판을 고속 액체 크로마토그래피로 정량하여 결과를 표5에 나타내었다.

[표5]

실시예 5

인돌 1.0g, L-세린 20.0g, 피리독살 5인산 15mg에 표 6에 나타낸 각종의 유기 용매를 혼합하여 첨가한 후 실시예 2에서 사용한 바와 동일한 균체를 트립토판 합성효소의 역가로 환산하여 60,000 유니트가 되도록 첨가하고 0.1M 말레산 완충액(pH 8.0)을 최종부피가 100ml가 되게하였다. 이 반응액을 37℃에서 반응을 진행시키면서 반응액 중의 인돌이 완전 전화될 때마다 1.0g의 인돌을 추가로 첨가하여 주며 60시간 동안 반응을 수행한 후 반응액 중의 생성 트립토판을 고속 액체 크로마토그래피로 정량하여 결과를 표 6에 나타내었다.

[표6]

상기 실시예들의 결과에서 알 수 있듯이 용매를 첨가하지 않은 대조용에 비해 유기용매를 첨가한 경우의 L-트립토판 생성량이 월등히 높았으며, 유기용매를 혼합하여 첨가한 경우 고농도의 기질, 특히 고농도의 인돌을 첨가했을시에도 최종 생성물인 L-트립토판이 매우 고농도로 수득되었다.

상기와 같이, 본 발명에 따라 수-비혼화성 유기용매와 수-혼화성 유기용매의 적절한 혼합사용에 의해 매우 낮은 농도에서도 효소활성을 저해하여 최종 생성물의 농도를 저하시키는 인돌을 휠씬 고농도로 사용하여 최종 생성물인 L-트립토판의 수율로 증대시킬 수 있다.

Claims (5)

1. 트립토판 합성효소를 이용하여 인돌 및 세린으로부터 L-트립토판을 제조하는 방법에 있어서, 수-비혼화성 유기 용매와 효소의 안정성을 증진시키는 수-혼화성 유기용매의 혼합 용매를 효소 반응액에 포함시킴을 특징으로 하는 개선된 L-트립토판의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 수-혼화성 유기용매가 수-혼화성 알콜 또는 에테르이고, 상기 수-비혼화성 유기용매가 수-비혼화성 알콜, 에테르, 알칸, 에스테르 및 식물성 유지로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 수-비혼화성 유기용매로는 디에틸렌글리콜 디부틸에테르, 수-혼화성 유기용매로는 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 혼합 유기 용매가 총 효소 반응액의 10내지 50부피%의 양으로 사용되는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 수-비혼화성 유기 용매와 수-혼화성 유기용매의 혼합비가 1 : 5 내지 5 : 5(v/v)인 방법.