JPH1066592A - リプスタチンおよびテトラヒドロリプスタチンの製造方法 - Google Patents
リプスタチンおよびテトラヒドロリプスタチンの製造方法Info
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- JPH1066592A JPH1066592A JP9088066A JP8806697A JPH1066592A JP H1066592 A JPH1066592 A JP H1066592A JP 9088066 A JP9088066 A JP 9088066A JP 8806697 A JP8806697 A JP 8806697A JP H1066592 A JPH1066592 A JP H1066592A
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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- C07D305/10—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings having one or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D305/12—Beta-lactones
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 流加培養法を用いることによって、発酵によ
るリプスタチンの生産の改良された方法を提供するこ
と。 【解決手段】 ａ）リプスタチンを産生する放線菌類
を、脂肪および油を含まない水性培地中で、好気的に培
養する工程、およびｂ）酸化防止剤によって安定化され
ているリノール酸、任意にカプリル酸とともに、および
Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましくはＬ−ロ
イシンを、ブロスに添加する工程を包含する、発酵によ
るリプスタチンの製造方法。さらに、リプスタチンをブ
ロスから単離し、テトラヒドロリプスタチンに水素化す
ることができる。
るリプスタチンの生産の改良された方法を提供するこ
と。 【解決手段】 ａ）リプスタチンを産生する放線菌類
を、脂肪および油を含まない水性培地中で、好気的に培
養する工程、およびｂ）酸化防止剤によって安定化され
ているリノール酸、任意にカプリル酸とともに、および
Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましくはＬ−ロ
イシンを、ブロスに添加する工程を包含する、発酵によ
るリプスタチンの製造方法。さらに、リプスタチンをブ
ロスから単離し、テトラヒドロリプスタチンに水素化す
ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は発酵によるリプスタ
チン生産のための新規な流加方法に関し、この方法は以
下の工程： ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物
を、実質的に脂肪(fat) および油(oil) を含まない水性
培地であって適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩
を含む水性培地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十
分な細胞集団が産生されるまで好気的に培養する工程、
および ｂ）リノール酸、場合によってカプリル酸とともに、こ
こで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もし
くは全部が対応するエステルおよび／または塩で置換さ
れている、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは
好ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であ
って、このリノール酸もしくはそのエステルもしくはそ
の塩が酸化防止剤によって安定化されている工程、を包
含する。
チン生産のための新規な流加方法に関し、この方法は以
下の工程： ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物
を、実質的に脂肪(fat) および油(oil) を含まない水性
培地であって適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩
を含む水性培地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十
分な細胞集団が産生されるまで好気的に培養する工程、
および ｂ）リノール酸、場合によってカプリル酸とともに、こ
こで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もし
くは全部が対応するエステルおよび／または塩で置換さ
れている、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは
好ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であ
って、このリノール酸もしくはそのエステルもしくはそ
の塩が酸化防止剤によって安定化されている工程、を包
含する。
【０００２】
【従来の技術】リプスタチン、発酵によるその製造方
法、ブロスからのその単離方法、ならびにテトラヒドロ
リプスタチン（ＴＨＬ、Orlistat、抗肥満剤）へのその
水素化方法は米国特許第４，５９８，０８９号に記載さ
れている。
法、ブロスからのその単離方法、ならびにテトラヒドロ
リプスタチン（ＴＨＬ、Orlistat、抗肥満剤）へのその
水素化方法は米国特許第４，５９８，０８９号に記載さ
れている。
【０００３】米国特許第４，５９８，０８９号に記載さ
れているリプスタチンを産生する生物は、Streptomyces
toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova （Berg
ey'sManual of Determinative Bacteriology 、第８
版、811 頁参照）である。それは１９８３年６月１４日
にthe Agricultural Research Culture Collection, Pe
oria, Ill.にＮＲＲＬ １５４４３として寄託された。
本発明の方法は、この生物もしくはそれから誘導された
任意の他の株、例えば、より高い生産性を選択するため
の変異株を用いて行うことができる。それはまた、スト
レプトミセス科（streptomycetes）に属するかもしくは
放線菌目の別の科に属する放線菌類の他のリプスタチン
産生生物を用いて行うこともできる。
れているリプスタチンを産生する生物は、Streptomyces
toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova （Berg
ey'sManual of Determinative Bacteriology 、第８
版、811 頁参照）である。それは１９８３年６月１４日
にthe Agricultural Research Culture Collection, Pe
oria, Ill.にＮＲＲＬ １５４４３として寄託された。
本発明の方法は、この生物もしくはそれから誘導された
任意の他の株、例えば、より高い生産性を選択するため
の変異株を用いて行うことができる。それはまた、スト
レプトミセス科（streptomycetes）に属するかもしくは
放線菌目の別の科に属する放線菌類の他のリプスタチン
産生生物を用いて行うこともできる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】米国特許第４，５９
８，０８９号に記載されている発酵系を適用する場合、
培養後の発酵ブロスには、数mg/Lというごく少量のリプ
スタチンが含まれ、経済的にも技術的にも適した方法に
よってそれを単離するのは困難である。
８，０８９号に記載されている発酵系を適用する場合、
培養後の発酵ブロスには、数mg/Lというごく少量のリプ
スタチンが含まれ、経済的にも技術的にも適した方法に
よってそれを単離するのは困難である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、発酵ブロス内
に生じている高濃度のリプスタチンを上記の流加培養法
を用いることによって、発酵によるリプスタチンの生産
の改良された方法を提供する。この方法の第１の工程
ａ）において、リプスタチンを産生する微生物の細胞を
基本培地で増殖させる。この方法の第２の工程ｂ）にお
いて、この基本培地にある成分を添加する。それらは直
接生化学的前駆体として作用するか、あるいは短期の生
化学的変換を受けて生合成経路の前駆体として作用す
る。この系により、その微生物は所望の産物、すなわち
リプスタチンを、かなり高い濃度で合成することが可能
になる。
に生じている高濃度のリプスタチンを上記の流加培養法
を用いることによって、発酵によるリプスタチンの生産
の改良された方法を提供する。この方法の第１の工程
ａ）において、リプスタチンを産生する微生物の細胞を
基本培地で増殖させる。この方法の第２の工程ｂ）にお
いて、この基本培地にある成分を添加する。それらは直
接生化学的前駆体として作用するか、あるいは短期の生
化学的変換を受けて生合成経路の前駆体として作用す
る。この系により、その微生物は所望の産物、すなわち
リプスタチンを、かなり高い濃度で合成することが可能
になる。
【０００６】リプスタチンにいたる生合成経路は、一連
の一般的制御機作、例えば、窒素抑制、の対象である。
容易に利用可能な窒素源、特にアミノ酸およびその誘導
体（Ｌ−ロイシンもしくはＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシン
を含む）を培地に添加することにより、リプスタチンの
形成は強力に抑制される。本発明では、これは、これら
のアミノ酸の添加を生合成酵素の形成後にのみ開始する
ことにより克服され、その結果、もはや遺伝子レベルで
は抑制されなくなる。さらに、Ｌ−ロイシンもしくはＮ
−ホルミル−Ｌ−ロイシンをそのように添加すると、ブ
ロス中のそれらの濃度は低いままである。
の一般的制御機作、例えば、窒素抑制、の対象である。
容易に利用可能な窒素源、特にアミノ酸およびその誘導
体（Ｌ−ロイシンもしくはＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシン
を含む）を培地に添加することにより、リプスタチンの
形成は強力に抑制される。本発明では、これは、これら
のアミノ酸の添加を生合成酵素の形成後にのみ開始する
ことにより克服され、その結果、もはや遺伝子レベルで
は抑制されなくなる。さらに、Ｌ−ロイシンもしくはＮ
−ホルミル−Ｌ−ロイシンをそのように添加すると、ブ
ロス中のそれらの濃度は低いままである。
【０００７】好都合なことに、リプスタチンを産生する
放線菌類は、１以上の炭素源、例えば、デンプン、デン
プン加水分解物および糖類（例えば、グルコースおよび
／またはスクロース）、グリセロール、リン脂質、なら
びに１以上の窒素源、例えば、ダイズ細粉、綿花種子細
粉(cotton seed flour) 、コーンスティープパウダーも
しくはコーンスティープリカーおよびイーストエクスト
ラクトを含む適切な水性基本培地中で増殖する。炭素源
および窒素源はどちらも十分な増殖を可能とする量で供
給され、代表的には培地１L 当たり、各炭素源および各
窒素源が５〜５０ｇの範囲である。さらに、この培地に
はマクロエレメント（例えば、リン酸塩、マグネシウム
イオン、カルシウムイオンなど）およびミクロエレメン
ト（例えば、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオンな
ど）が添加される。それらは複合培地成分に含まれる
か、もしくは無機塩として添加される。
放線菌類は、１以上の炭素源、例えば、デンプン、デン
プン加水分解物および糖類（例えば、グルコースおよび
／またはスクロース）、グリセロール、リン脂質、なら
びに１以上の窒素源、例えば、ダイズ細粉、綿花種子細
粉(cotton seed flour) 、コーンスティープパウダーも
しくはコーンスティープリカーおよびイーストエクスト
ラクトを含む適切な水性基本培地中で増殖する。炭素源
および窒素源はどちらも十分な増殖を可能とする量で供
給され、代表的には培地１L 当たり、各炭素源および各
窒素源が５〜５０ｇの範囲である。さらに、この培地に
はマクロエレメント（例えば、リン酸塩、マグネシウム
イオン、カルシウムイオンなど）およびミクロエレメン
ト（例えば、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオンな
ど）が添加される。それらは複合培地成分に含まれる
か、もしくは無機塩として添加される。
【０００８】前記の水性培養培地は、実質的に脂肪(fa
t) および油(oil) を含まず、そしてトリグリセリドを
培地１L 当たり１０ｇより少なく含む。この場合、例え
ば、ストレプトミセス科の微生物を培養する。適切に
は、リノール酸および／またはカプリル酸および／また
はそれらのエステル若しくは塩は、ブロス中で自由に用
いることができるがそれらの蓄積を防止するような速さ
で供給され、特に１０〜１０００mg/L/ 時間、好ましく
は１００〜３００mg/L/ 時間の速度である。リノール酸
およびカプリル酸および／またはそれらの塩若しくはそ
れらのエステルの供給は、好ましくは、ブロス中のそれ
らの濃度が、１０００mg/L、好ましくは３００mg/Lより
低く維持されるように行われ、そしてこのブロスが実際
に上記脂肪酸および／またはそのエステル若しくは塩を
含まないようにリプスタチンが単離される前に停止され
る。適切には、リノール酸およびカプリル酸は、リノー
ル酸１〜１０重量部、好ましくは１．５〜３重量部に対
してカプリル酸１重量部の比でブロスに添加される。適
切には、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましく
はＬ−ロイシンが、その濃度が２５mMより低く維持され
るように、１〜１００mg/L/ 時間、好ましくは５〜５０
mg/L/ 時間の速度でブロスに添加される。
t) および油(oil) を含まず、そしてトリグリセリドを
培地１L 当たり１０ｇより少なく含む。この場合、例え
ば、ストレプトミセス科の微生物を培養する。適切に
は、リノール酸および／またはカプリル酸および／また
はそれらのエステル若しくは塩は、ブロス中で自由に用
いることができるがそれらの蓄積を防止するような速さ
で供給され、特に１０〜１０００mg/L/ 時間、好ましく
は１００〜３００mg/L/ 時間の速度である。リノール酸
およびカプリル酸および／またはそれらの塩若しくはそ
れらのエステルの供給は、好ましくは、ブロス中のそれ
らの濃度が、１０００mg/L、好ましくは３００mg/Lより
低く維持されるように行われ、そしてこのブロスが実際
に上記脂肪酸および／またはそのエステル若しくは塩を
含まないようにリプスタチンが単離される前に停止され
る。適切には、リノール酸およびカプリル酸は、リノー
ル酸１〜１０重量部、好ましくは１．５〜３重量部に対
してカプリル酸１重量部の比でブロスに添加される。適
切には、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましく
はＬ−ロイシンが、その濃度が２５mMより低く維持され
るように、１〜１００mg/L/ 時間、好ましくは５〜５０
mg/L/ 時間の速度でブロスに添加される。
【０００９】リノール酸もしくはそのカプリル酸との混
合物の一部（もしくは全部）と置換することができる塩
およびエステルの例は、アルカリもしくはアルカリ土類
金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウ
ム塩、もしくはマグネシウム塩）および低級アルキルエ
ステル（例えば、メチルエステル）、もしくはグリセリ
ドである。
合物の一部（もしくは全部）と置換することができる塩
およびエステルの例は、アルカリもしくはアルカリ土類
金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウ
ム塩、もしくはマグネシウム塩）および低級アルキルエ
ステル（例えば、メチルエステル）、もしくはグリセリ
ドである。
【００１０】リノール酸〔またはそのエステル若しくは
塩〕の酸化を防止するため、酸化防止剤（例えば、アス
コルビン酸パルミチン酸エステル(ascorbyl palmitat
e)、トコフェノール、レシチン、もしくはそれらの混合
物）、および／または遊離基捕捉剤（例えば、ＢＨＡ
（ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−アニソール）もしくは
ＢＨＴ（２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）を
リノール酸〔またはそのエステル若しくは塩〕と混合す
る。
塩〕の酸化を防止するため、酸化防止剤（例えば、アス
コルビン酸パルミチン酸エステル(ascorbyl palmitat
e)、トコフェノール、レシチン、もしくはそれらの混合
物）、および／または遊離基捕捉剤（例えば、ＢＨＡ
（ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−アニソール）もしくは
ＢＨＴ（２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）を
リノール酸〔またはそのエステル若しくは塩〕と混合す
る。
【００１１】本発明はさらにテトラヒドロリプスタチン
の製造方法に関し、その方法は、以下の工程 ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物
を、実質的に脂肪および油を含まない水性培地であって
適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培
地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十分な細胞集団
が産生されるまで好気的に培養する工程、 ｂ）リノール酸、好ましくはカプリル酸とともに、ここ
で、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしく
は全部が対応するエステルおよび／または塩で置換され
ている、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好
ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であっ
て、このリノール酸もしくはそのエステルもしくはその
塩が酸化防止剤によって安定化されている工程、 ｃ）このブロスからリプスタチンを単離し、リプスタチ
ンをテトラヒドロリプスタチンに水素化する工程、を包
含する。
の製造方法に関し、その方法は、以下の工程 ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物
を、実質的に脂肪および油を含まない水性培地であって
適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培
地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十分な細胞集団
が産生されるまで好気的に培養する工程、 ｂ）リノール酸、好ましくはカプリル酸とともに、ここ
で、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしく
は全部が対応するエステルおよび／または塩で置換され
ている、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好
ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であっ
て、このリノール酸もしくはそのエステルもしくはその
塩が酸化防止剤によって安定化されている工程、 ｃ）このブロスからリプスタチンを単離し、リプスタチ
ンをテトラヒドロリプスタチンに水素化する工程、を包
含する。
【００１２】発酵ブロスからのリプスタチンの単離は、
それ自体公知であり、かついかなる当業者も通じている
方法に従って実施することができる。例えば、それは以
下のように実施することができる：
それ自体公知であり、かついかなる当業者も通じている
方法に従って実施することができる。例えば、それは以
下のように実施することができる：
【００１３】発酵が完了した後、発酵ブロスを遠心分離
する。次いで、得られた細胞集団を低級アルカノール
（例えば、メタノールもしくはエタノール）で処理し、
同じ溶媒で抽出する。遠心分離物は適切な有機溶媒（例
えば、塩化メチレンもしくは酢酸エチル）で抽出するこ
とができる。抽出物から生成された物質は所望のリプス
タチンを含んでおり、クロマトグラフィー法により濃縮
および精製することができる（例えば、米国特許第４，
５９８，０８９号に記載のように）。
する。次いで、得られた細胞集団を低級アルカノール
（例えば、メタノールもしくはエタノール）で処理し、
同じ溶媒で抽出する。遠心分離物は適切な有機溶媒（例
えば、塩化メチレンもしくは酢酸エチル）で抽出するこ
とができる。抽出物から生成された物質は所望のリプス
タチンを含んでおり、クロマトグラフィー法により濃縮
および精製することができる（例えば、米国特許第４，
５９８，０８９号に記載のように）。
【００１４】リプスタチンのテトラヒドロリプスタチン
への水素化は、適切な触媒の存在下で、それ自体公知の
方法（例えば、米国特許第４，５９８，０８９号に記載
の）に従って実施できる。用いることのできる触媒の例
は、パラジウム／炭素、プラチナ酸化物(platinum oxid
e)、パラジウムなどである。適切な溶媒は、例えば、メ
タノールおよびエタノールのような低級アルコールであ
る。水素化は、好ましくは低い水素圧で、および室温で
実施される。
への水素化は、適切な触媒の存在下で、それ自体公知の
方法（例えば、米国特許第４，５９８，０８９号に記載
の）に従って実施できる。用いることのできる触媒の例
は、パラジウム／炭素、プラチナ酸化物(platinum oxid
e)、パラジウムなどである。適切な溶媒は、例えば、メ
タノールおよびエタノールのような低級アルコールであ
る。水素化は、好ましくは低い水素圧で、および室温で
実施される。
【００１５】
実施例１ ａ）以下の前培養培地からなるシード培養物を調製し
た：１０ｇの脱脂ダイズ細粉、１０ｇのグリセロール、
５ｇのイーストエクストラクト、および１L とするため
の水。ｐＨは２８％のＮａＯＨで７．０に調整し、滅菌
後に６．８となるようにした。この培地１００mlを５０
０mlの三角フラスコに入れて綿栓で塞ぎ、滅菌した。次
いで、これにStreptomyces toxytriciniのＮＲＲＬ １
５４４３株の胞子を１白金耳接種し、続いて振盪しなが
ら２７℃で２４時間インキュベーションした。
た：１０ｇの脱脂ダイズ細粉、１０ｇのグリセロール、
５ｇのイーストエクストラクト、および１L とするため
の水。ｐＨは２８％のＮａＯＨで７．０に調整し、滅菌
後に６．８となるようにした。この培地１００mlを５０
０mlの三角フラスコに入れて綿栓で塞ぎ、滅菌した。次
いで、これにStreptomyces toxytriciniのＮＲＲＬ １
５４４３株の胞子を１白金耳接種し、続いて振盪しなが
ら２７℃で２４時間インキュベーションした。
【００１６】ｂ）このシード培養物１００mlを用いて、
８L の生産用培地の入った容器サイズが１４L の発酵槽
に接種した。生産用培地には１L 当たり：３２ｇの脱脂
ダイズ細粉、２０ｇのグリセロール、１４ｇのレシチ
ン、消泡剤として０．２５mlのポリプロピレングリコー
ルが含まれており、ｐＨは２８％のＮａＯＨで７．４に
調整した。この培地は１L 当たり５ｇ未満のトリグリセ
リドを含んでいた。
８L の生産用培地の入った容器サイズが１４L の発酵槽
に接種した。生産用培地には１L 当たり：３２ｇの脱脂
ダイズ細粉、２０ｇのグリセロール、１４ｇのレシチ
ン、消泡剤として０．２５mlのポリプロピレングリコー
ルが含まれており、ｐＨは２８％のＮａＯＨで７．４に
調整した。この培地は１L 当たり５ｇ未満のトリグリセ
リドを含んでいた。
【００１７】ｃ）４７時間の増殖相の後、流加(feedin
g) を開始した。流加は、脂肪酸リノール酸、およびカ
プリル酸からなり、ここで、７０％(w/w) のレシチン、
２５％のアスコルビン酸パルミチン酸エステル、および
５％のトコフェノールからなる０．２％(w/w) の酸化防
止剤(RONOXAN A) の添加によりリノール酸は安定化され
た。これらの脂肪酸を１３６〜１９０mg/L/ 時間の割合
で添加し、添加の速度は、リノール酸およびカプリル酸
各々の濃度が７０mg/Lより低くとどまるような方法で調
整した。発酵の進行中に添加した総量はリノール酸が１
０８ｇ、カプリル酸が５４ｇであった。Ｌ−ロイシン
を、流加１L 当たり８０ｇのロイシンを含む水性溶液と
して、１４．４mg/L/ 時間の速度で添加し、２８％のＮ
ａＯＨでｐＨを１１に調整した。合計１０．２ｇのＬ−
ロイシンを添加した。
g) を開始した。流加は、脂肪酸リノール酸、およびカ
プリル酸からなり、ここで、７０％(w/w) のレシチン、
２５％のアスコルビン酸パルミチン酸エステル、および
５％のトコフェノールからなる０．２％(w/w) の酸化防
止剤(RONOXAN A) の添加によりリノール酸は安定化され
た。これらの脂肪酸を１３６〜１９０mg/L/ 時間の割合
で添加し、添加の速度は、リノール酸およびカプリル酸
各々の濃度が７０mg/Lより低くとどまるような方法で調
整した。発酵の進行中に添加した総量はリノール酸が１
０８ｇ、カプリル酸が５４ｇであった。Ｌ−ロイシン
を、流加１L 当たり８０ｇのロイシンを含む水性溶液と
して、１４．４mg/L/ 時間の速度で添加し、２８％のＮ
ａＯＨでｐＨを１１に調整した。合計１０．２ｇのＬ−
ロイシンを添加した。
【００１８】前述のシード培養物による播種後であって
前述の脂肪酸およびＬ−ロイシンを流加中の培地を撹拌
しながらインキュベーションし、空気を４L/分の速度で
通気して培養物を好気的に維持した。pHを硫酸または水
酸化ナトリウム溶液の自動添加により６．１〜７．３に
維持した。溶解した酸素濃度が１０％の飽和濃度を下回
るのを撹拌速度を調整することにより防止した。回収時
には、培養物は実際にリノール酸もカプリル酸も含まな
かった。リプスタチンの力価、すなわち、培養培地中の
その濃度は、１３８時間のインキュベーション時間後に
１５０mg/Lであった。
前述の脂肪酸およびＬ−ロイシンを流加中の培地を撹拌
しながらインキュベーションし、空気を４L/分の速度で
通気して培養物を好気的に維持した。pHを硫酸または水
酸化ナトリウム溶液の自動添加により６．１〜７．３に
維持した。溶解した酸素濃度が１０％の飽和濃度を下回
るのを撹拌速度を調整することにより防止した。回収時
には、培養物は実際にリノール酸もカプリル酸も含まな
かった。リプスタチンの力価、すなわち、培養培地中の
その濃度は、１３８時間のインキュベーション時間後に
１５０mg/Lであった。
【００１９】実施例２ 上記の実施例１ａ）と同じシード培養物を用いて、米国
特許第４，５９８，０８９号に記載の生産用培地、すな
わち、実施例１の生産用培地Ｎ７を有する１４L 発酵槽
に接種した。この培地は、８L 当たり：８０ｇの馬鈴薯
デンプン、４０ｇのグルコース、８０ｇのリボース、４
０ｇのグリセロール、１６ｇのペプトン、１６０ｇのダ
イズ細粉、１６ｇの硫酸アンモニウムを含んでいた。消
泡剤（培地１L 当たり０．２５mlのポリプロピレングリ
コール）を上記実施例１ｂ）のように添加した。pHは滅
菌前に２８％のＮａＯＨで７．０に調整した。４００rp
mで撹拌し、１分当たり空気４L の通気速度で好気的に
インキュベーションを行った。
特許第４，５９８，０８９号に記載の生産用培地、すな
わち、実施例１の生産用培地Ｎ７を有する１４L 発酵槽
に接種した。この培地は、８L 当たり：８０ｇの馬鈴薯
デンプン、４０ｇのグルコース、８０ｇのリボース、４
０ｇのグリセロール、１６ｇのペプトン、１６０ｇのダ
イズ細粉、１６ｇの硫酸アンモニウムを含んでいた。消
泡剤（培地１L 当たり０．２５mlのポリプロピレングリ
コール）を上記実施例１ｂ）のように添加した。pHは滅
菌前に２８％のＮａＯＨで７．０に調整した。４００rp
mで撹拌し、１分当たり空気４L の通気速度で好気的に
インキュベーションを行った。
【００２０】インキュベーション後、１０mg/L未満のリ
プスタチン濃度が培養培地中で見られた。
プスタチン濃度が培養培地中で見られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター・シュトーラー スイス国、ツェーハー−4415 ローゼン、 ブリュールシュトラーセ 48 (72)発明者 ヴォルフガング・ヴェーバー ドイツ連邦共和国、デー−79639 グレン ツァハ−ヴィーレン、レットラー・リンク ７
Claims (2)
- 【請求項１】 発酵によるリプスタチンの製造方法であ
って、以下の工程 ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物
を、実質的に脂肪および油を含まない水性培地であって
適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培
地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十分な細胞集団
が産生されるまで好気的に培養する工程、および ｂ）リノール酸、場合によってカプリル酸とともに、こ
こで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もし
くは全部が対応するエステルおよび／または塩で置換さ
れている、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは
好ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であ
って、該リノール酸もしくはそのエステルもしくはその
塩が酸化防止剤によって安定化されている、工程；を包
含する方法。 - 【請求項２】 テトラヒドロリプスタチンの製造方法で
あって、以下の工程 ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物
を、実質的に脂肪および油を含まない水性培地であって
適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培
地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十分な細胞集団
が産生されるまで好気的に培養する工程、および ｂ）リノール酸、好ましくはカプリル酸とともに、ここ
で、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしく
は全部が対応するエステルおよび／または塩で置換され
ている、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好
ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であっ
て、該リノール酸もしくはそのエステルもしくはその塩
が酸化防止剤によって安定化されている、工程； ｃ）該ブロスからリプスタチンを単離し、リプスタチン
をテトラヒドロリプスタチンに水素化する工程、を包含
する方法。
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| CN102268466B (zh) * | 2011-07-23 | 2013-06-12 | 鲁南新时代生物技术有限公司 | 一种发酵生产利普司他汀的方法及其培养基组份 |
| CN103820510B (zh) * | 2014-01-17 | 2016-01-20 | 浙江工业大学 | 一种微生物发酵生产利普司他汀的方法及培养基 |
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1996
- 1996-12-20 MY MYPI96005405A patent/MY116591A/en unknown
-
1997
- 1997-03-25 ID IDP970979A patent/ID16410A/id unknown
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- 1997-04-07 JP JP08806697A patent/JP4094698B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-10 TR TR97/00289A patent/TR199700289A3/tr unknown
- 1997-04-18 DE DE69717530T patent/DE69717530T2/de not_active Expired - Lifetime
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- 1997-04-18 EP EP97106445A patent/EP0803576B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-18 PT PT97106445T patent/PT803576E/pt unknown
- 1997-04-18 DK DK97106445T patent/DK0803576T3/da active
- 1997-04-18 ES ES97106445T patent/ES2186818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-24 AR ARP970101680A patent/AR006831A1/es active IP Right Grant
- 1997-04-25 CN CN97109732A patent/CN1128224C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 BR BR9701953A patent/BR9701953A/pt not_active Application Discontinuation
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2002
- 2002-04-17 US US10/124,115 patent/US20020110873A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
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