CN103820510B - 一种微生物发酵生产利普司他汀的方法及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物发酵生产利普司他汀的方法，以及所用的发酵培养基。所述方法包括：将毒三素链霉菌（Streptomyces？toxytricini）接种至发酵培养基，培养基中添加Mg2+、Co2+和Zn2+的终浓度分别为10～15mmol/L、0.5～2.0mmol/L和0.1～0.5mmol/L，在28℃、220r/min下进行发酵培养，并在发酵培养第4天添加亮氨酸至其终浓度为40～50mmol/L、第6天添加正辛酸至其终浓度为30～40mmol/L，总发酵培养时间为150～180h，发酵结束后，于发酵液中获得所述利普司他汀；本发明对影响利普司他汀发酵合成的前体物以及金属离子的添加组合进行了优化，找到了最佳的前体物和金属离子的组合，显著提高了利普司他汀的产量，应用于工业化生产利普司他汀可以显著提高效价，降低成本。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种微生物发酵生产利普司他汀的方法，以及所用的发酵培养基。
(二)背景技术
利普司他汀(Lipstatin)是由毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)经发酵产生的代谢产物，其四氢衍生物为奥利司他(olistat)是罗氏公司(Roche)成功开发的减肥药(赛尼可)，奥利斯他是第一个胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活，减少脂肪的分解和吸收，从而达到控制体重的作用。奥利斯他是目前唯一的不进入血液、不作用于中枢神经系统的减肥药。
奥利司他可以通过全化学合成法或先通过发酵合成法产生利普司他汀后进行氢化合成。由于全合成法生产成本比较高，目前主要由微生物发酵合成法生产，该法成本较低，环境友好，适合大规模生产。
发酵法生产中，主要通过毒三素链霉菌发酵生产。因此，通过对该菌菌株的改良、培养基以及发酵工艺条件的优化来提高利普司他汀的发酵效价都是研究的目标。国内外有不少利普司他汀发酵生产的相关专利。美国专利US4598089、US2005089978A1描述了利用毒三素链霉菌菌株NRRL15443进行利普司他汀发酵生产的工艺。欧洲专利EP0803576描述了发酵过程中通过添加亚油酸、辛酸和N-甲酰基-L-亮氨酸或亮氨酸来提高利普司他汀的工艺，但是发酵水平比较低，低于lg/L。国际专利WO03/048335描述了用油替代具体脂肪酸生产脂肪酸的方法。国际专利W02004003212中描述了利用不同淀粉底物的培养基，发酵水平为1.486g/L。国际专利W003048335发酵水平为1.8g/L。美国最新的美国专利US8501444(2013年8月)描述了亚油酸和ω-9脂肪酸的结合使用，显著提高了利普司他汀的产量。中国专利CN102268466B描述了通过在发酵过程中流加亚油酸和亮氨酸以及控制发酵工艺提高了利普司他汀发酵效价的方法，其中利用发酵罐生产利普司他汀的效价可以达到5g/L以上。
(三)发明内容
本发明目的是提供了一种通过给该菌的发酵培养基中补加微量元素、补加前体物质来提高来提高利普司他汀发酵单位的方法，尤其是通过补加微量元素和前体物质的组合优化工艺来显著提高利普司他汀产量。
本发明采用的技术方案是：
一种微生物发酵生产利普司他汀的方法，所述方法包括：将毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)接种至发酵培养基，在28℃、220r/min下进行发酵培养，并在发酵培养第4天添加亮氨酸至其终浓度为40～50mmol/L、第6天添加正辛酸至其终浓度为30～40mmol/L，总发酵培养时间为150～180h，发酵结束后，于发酵液中获得所述利普司他汀；所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉30～40g/L，玉米蛋白粉5～10g/L，葵花油80～120g/L，大豆卵磷脂20～30g/L，甘油20～30g/L，吐温-800.01～0.1g/L，碳酸钙0.1～1.0g/L，维生素E0.01～0.5g/L，维生素C0.05～0.5g/L，MgSO410～15mmol/L，CoSO4·7H2O0.5～2.0mmol/L，ZnSO4·7H2O0.1～0.5mmol/L，溶剂为水，pH7.0～7.5。所述毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)菌株为本领域已知可用于生产利普司他汀毒三素链霉菌菌株，可市购或者从菌种库购买获得。
优选的，所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉32.5g/L，玉米蛋白粉8g/L，葵花油100g/L，大豆卵磷脂25g/L，甘油22.5g/L，吐温-800.05g/L，碳酸钙0.8g/L，维生素E0.025g/L，维生素C0.125g/L，MgSO412mmol/L，CoSO4·7H2O1mmol/L，ZnSO4·7H2O0.25mmol/L，溶剂为水，pH7.1。
优选的，所述亮氨酸添加量为45.72mmol/L、正辛酸添加量为31.1985mmol/L。
在发酵培养之前，菌株通常需要进行常规种子斜面活化培养和种子扩大培养，具体可如下：
斜面活化培养：培养温度28℃，培养周期166h～192h，得到活化菌种；斜面培养基组成：可溶性淀粉10g/L，麦粉5g/L，酵母提取物1g/L，干酪素1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.1，121～125℃灭菌20min后制成斜面。
种子扩大培养：培养温度28℃，1000mL三角瓶装量100mL，摇床转速220r/min，培养时间30h，得到种子液；种子培养基组成：黄豆饼粉20g/L，甘油20g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为水，pH7.1，121～125℃灭菌20min。所得种子液以5～15％体积比接种至发酵培养基进行发酵培养即可。
本发明还涉及一种用于微生物发酵生产利普司他汀的发酵培养基，其组成如下：黄豆饼粉30～40g/L，玉米蛋白粉5～10g/L，葵花油80～120g/L，大豆卵磷脂20～30g/L，甘油20～30g/L，吐温-800.01～0.1g/L，碳酸钙0.1～1.0g/L，维生素E0.01～0.5g/L，维生素C0.05～0.5g/L，MgSO410～15mmol/L，CoSO4·7H2O0.5～2.0mmol/L，ZnSO4·7H2O0.1～0.5mmol/L，溶剂为水，pH7.0～7.5。
本发明培养基与现有培养基相比，增加了金属离子种类和用量，增加了利普司他汀前体物亮氨酸和正辛酸，以及金属离子和前体物的组合优化。利普司他汀的微生物发酵中，合成途径相关的酶起着关键的作用，这些酶的催化作用往往是金属离子依赖性的，因此，本发明通过筛选不同的金属离子及浓度来提高利普司他汀发酵效价。发现同时加入Mg2+、Co2+和Zn2+能显著提高利普司他汀发酵效价。另外，还发现Cu2+对利普司他汀的发酵有显著的抑制作用，因此在培养基中应避免Cu2+的进入。
本发明的有益效果主要体现在：本发明对影响利普司他汀发酵合成的前体物以及金属离子的添加组合进行了优化，找到了最佳的前体物和金属离子的组合，显著提高了利普司他汀的产量，应用于工业化生产利普司他汀可以显著提高效价，降低成本。
(四)附图说明
图1为发酵液中补加亮氨酸和正辛酸对利普司他汀产量的影响；
图2为金属离子对利普司他汀发酵合成的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1、菌株：
毒三素链霉菌(Stretomycestoxytricini)突变株XC-lp-69(浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供)。
2、培养基：
斜面培养基配制：可溶性淀粉10g，麦粉5g，酵母提取物1g，干酪素1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，加水定容到1L，pH值调到7.1，121～125℃，灭菌20min。该培养基用于菌种活化。
种子培养基配制：黄豆饼粉20g，甘油20g，酵母提取物5g，加水定容到1L，pH值调到7.1，121～125℃，灭菌20min。该培养基用于种子液制备。
初始发酵培养基：黄豆饼粉32.5g，玉米蛋白粉8g，葵花油100g，大豆软磷脂25g，甘油22.5g，吐温-800.05g，碳酸钙0.8g，维生素E0.025g，维生素C0.125g，加水定容到1L，pH调到7.1，121～125℃，灭菌20min。该培养基用于发酵生产利普司他汀。
3、培养和发酵条件:
斜面培养：培养温度28℃，培养周期166h～192h，得活化菌种；
种子培养：培养温度28℃，1000mL三角瓶装量100mL种子培养基，接种活化后的菌种，摇床转速220r/min，培养时间30h，得种子液；
发酵培养：培养温度28℃，500mL三角瓶装量50mL发酵培养基，以10％体积比接种种子液，摇床转速220r/min，总培养时间168h，得发酵液。
4、利普司他汀的测定方法
发酵液中利普司他汀采用HPLC分析：取发酵液0.5mL，加丙酮4.5mL，摇匀，超声20min，浸泡过夜，取上清液1mL离心(12000r/min)3min，上清液经聚偏氟乙烯微孔滤膜(0.22μm)过滤后进样测定。HPLC波长210nm分析上清液。流动相为乙腈：水＝85：15，流速1.0mL/min。
5、金属离子、前体物、发酵条件研究
发酵培养基前体物添加、金属离子的添加以及发酵条件的改良和优化是在上述发酵培养基及条件的基础上进行添加和改变。
5.1不同前体物对对利普司他汀发酵的影响
亮氨酸和正辛酸是利普司他汀生物合成的重要前体物质，因而在培养基中添加适量的前体物质可促使利普司他汀产量的提高。根据表1设置分批对发酵液进行前体物添加试验，考察其对利普司他汀产量的影响。
表1：亮氨酸和正辛酸补加方案
| 组别 | 不同处理方式 |
| I | 阴性对照 |
| II | 第4d补亮氨酸，终浓度15.24mmol/L |
| III | 第4d补亮氨酸，终浓度30.48mmol/L |
| IV | 第6d补亮氨酸，终浓度15.24mmol/L |
| V | 第6d补亮氨酸，终浓度30.48mmol/L |
| VI | 第4d补正辛酸，终浓度13.866mmol/L |
| VII | 第6d补正辛酸，终浓度13.866mmol/L |
结果显示，在第4d添加终浓度为30.48mmol/l的亮氨酸和第6d添加终浓度为13.866mmol/l的正辛酸时，利普司他汀的产量可达到对照的2倍。其中以第6d添加终浓度为13.866mmol/l的正辛酸时的利普司他汀产量最高为2637.55mmol/l。结果见图1。
5.2培养基中不同金属离子的添加对利普司他汀发酵的影响
许多无机金属离子作为微生物生理活性物质或生理活性作用的调节物，一般在低浓度时对微生物的生长和产物的合成有促进作用，在高浓度时常表现出抑制作用。而且产物合成对这些物质的最适浓度要求均各不相同，本发明考察了Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+这六个金属离子对利普司他汀合成的影响，通过添加MgSO4、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O来实现。添加浓度为0.5mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/Land8mmol/L。结果显示，当Mg2+、Zn2+和Co2+浓度分别为8mmol/L、0.5mmol/L和0.5mmol/L时效价达到了最高，依次为3506.44μg/ml、2803.59μg/ml、3275.775μg/ml。而Cu2+对发酵产利普司他汀的抑制作用最高，其中最大抑制可达到95％以上，说明Cu2+极其不利于利普司他汀的形成和积累。结果如图2所示。
5.3利普司他汀发酵工艺的正交优化
对上述各项试验中取得的结果进行不同影响因子的正交试验，对不同前体添加物以及金属离子的组合处理进行优化，提高利普司他汀的产量。选择5因素4水平的正交设计L16(45)对影响利普司他汀产量的金属离子Mg2+、Co2+、Zn2+和前体物亮氨酸、正辛酸等因素进行考察，共16个处理，实验设计表见表2。
表2：试验因素与水平
根据单因素实验得到的结果，在培养基中分别添加表4中四个浓度的MgSO4、CoSO4、ZnSO4溶液，并在第四天和第六天分别添加亮氨酸和正辛酸的各浓度溶液，总共16个处理，发酵7天后得到实验结果如表3所示，方差分析结果见表4。
表3：L16(45)正交试验及结果
表4：正交设计方差分析结果
| 因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F值 | P值 | 显著性 |
| Mg2+/mmol/L | 571814.418 | 3 | 0.487 | ＜0.1 | |
| Co2+/mmol/L | 679262.779 | 3 | 0.579 | ＜0.1 | |
| Zn2+/mmol/L | 818762.313 | 3 | 0.697 | ＜0.1 | |
| 亮氨酸/mmol/L | 3454141.781 | 3 | 2.942 | ＞0.1 | * |
| 正辛酸/mmol/L | 346474.167 | 3 | 0.295 | ＜0.1 | |
| 误差 | 15 |
由分析结果可以看出，各因素对利普司他汀发酵的影响大小顺序为亮氨酸>Mg2+>Co2+>Zn2+>正辛酸，则实验范围内的主要影响因素为亮氨酸，其次为Mg2+，因素正辛酸的影响最小。根据正交(全面)设计数据可比的特点，表中指标最好的点为D3，A4，B4，C2，E4，所对应的条件D3A4B4C2E4即为实验范围内最佳工艺条件：发酵第四天添加亮氨酸终浓度为45.72mmol/L，第六天添加正辛酸为31.1985mmol/L，Mg2+、Co2+和Zn2+的终浓度分别为12mmol/L、1mmol/L和0.25mmol/L。优化后的最高效价达到4164.23μg/mL，比优化前显著提高。
实施例2：
斜面培养基配制：可溶性淀粉10g，麦粉5g，酵母提取物1g，干酪素1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，加水定容到1L，pH值调到7.1，121～125℃，灭菌20min。该培养基用于菌种活化。
种子培养基配制：黄豆饼粉20g，甘油20g，酵母提取物5g，加水定容到1L，pH值调到7.1，121～125℃，灭菌20min。该培养基用于种子液制备。
发酵培养基配制：黄豆饼粉32.5g，玉米蛋白粉8g，葵花油100g，大豆软磷脂25g，甘油22.5g，吐温-800.05g，碳酸钙0.8g，维生素E0.025g，维生素C0.125g，MgSO412mmol，CoSO4·7H2O1mmol，ZnSO4·7H2O0.25mmol，加水定容到1L，pH调到7.1，121～125℃，灭菌20min。该培养基用于发酵生产利普司他汀。
斜面培养：斜面培养基接种毒三素链霉菌(Stretomycestoxytricini)突变株XC-lp-69，培养温度28℃，培养周期166h～192h，得活化菌种；
种子培养：种子培养基接种活化菌种，培养温度28℃，1000mL三角瓶装量100mL种子培养基，接种活化后的菌种，摇床转速220r/min，培养时间30h，得种子液；
发酵培养：培养温度28℃，500mL三角瓶装量50mL发酵培养基，以10％体积比接种种子液，摇床转速220r/min，发酵第四天添加亮氨酸终浓度为45.72mmol/L，第六天添加正辛酸为31.1985mmol/L，总培养时间168h，发酵结束后，得发酵液，菌体得率为362.3g/L(发酵液)。
取上述发酵液0.5mL，加丙酮4.5mL，摇匀，超声20min，浸泡过夜，取上清液1mL离心(12000r/min)3min，上清液经聚偏氟乙烯微孔滤膜(0.22μm)过滤后进样测定。流动相为乙腈：水＝85：15，流速1.0mL/min，PLC波长210nm分析上清液，测得其效价为4897.6μg/ml，比未优化的菌株(发酵产量为3000μg/ml)效价显著提高。
Claims (3)
1.一种微生物发酵生产利普司他汀的方法，所述方法包括：将毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)接种至发酵培养基，在28℃、220r/min下进行发酵培养，并在发酵培养第4天添加亮氨酸至其终浓度为40～50mmol/L、第6天添加正辛酸至其终浓度为30～40mmol/L，总发酵培养时间为150～180h，发酵结束后，于发酵液中获得所述利普司他汀；所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉30～40g/L，玉米蛋白粉5～10g/L，葵花油80～120g/L，大豆卵磷脂20～30g/L，甘油20～30g/L，吐温-800.01～0.1g/L，碳酸钙0.1～1.0g/L，维生素E0.01～0.5g/L，维生素C0.05～0.5g/L，MgSO410～15mmol/L，CoSO4·7H2O0.5～2.0mmol/L，ZnSO4·7H2O0.1～0.5mmol/L，溶剂为水，pH7.0～7.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉32.5g/L，玉米蛋白粉8g/L，葵花油100g/L，大豆卵磷脂25g/L，甘油22.5g/L，吐温-800.05g/L，碳酸钙0.8g/L，维生素E0.025g/L，维生素C0.125g/L，MgSO412mmol/L，CoSO4·7H2O1mmol/L，ZnSO4·7H2O0.25mmol/L，溶剂为水，pH7.1。
3.一种用于微生物发酵生产利普司他汀的培养基，其组成如下：黄豆饼粉30～40g/L，玉米蛋白粉5～10g/L，葵花油80～120g/L，大豆卵磷脂20～30g/L，甘油20～30g/L，吐温-800.01～0.1g/L，碳酸钙0.1～1.0g/L，维生素E0.01～0.5g/L，维生素C0.05～0.5g/L，MgSO410～15mmol/L，CoSO4·7H2O0.5～2.0mmol/L，ZnSO4·7H2O0.1～0.5mmol/L，溶剂为水，pH7.0～7.5。
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Granted publication date: 20160120 Termination date: 20200117 |