CN1128224C - 生产脂抑制素和四氢脂抑制素的方法 - Google Patents

Abstract

一种发酵生产脂抑制素的方法，该方法包括a)在基本上不含脂肪和油，但含有适当碳源和氮源及无机盐的水质培养基中，在有氧条件下培养能够产生脂抑制素的放线菌目所属的微生物，直至起始生长阶段基本完成，并有大量细胞产生，b)在液体培养基中加入亚油酸，可选择性地混合加入辛酸(其中部分或全部的亚油酸和/或部分或全部辛酸可以由相应的酯类和/或盐类所替代)，以及N-甲酰基-L-亮氨酸，或优选L-亮氨酸，所述的亚油酸或其酯或其盐已经被抗氧化剂稳定。脂抑制素可以从培养液中分离得到，并可将脂抑制素还原为四氢脂抑制素。

Description

生产脂抑制素和四氢脂抑制素的方法

本发明涉及一种新的分批补料发酵生产脂抑制素(lipstatin)的方法，该方法包括：

a)在基本上不含脂肪和油，但含有适当碳源和氮源及无机盐的水性培养基中，并在有氧条件下培养能够产生脂抑制素的放线菌目所属的微生物，直至起始生长阶段基本完成并有大量细胞产生，

b)向液体培养基中加入亚油酸，选择性地加入辛酸(其中部分或全部的亚油酸和/或部分或全部辛酸可以由相应的酯类和/或盐类所替代)，以及N-甲酰基-L-亮氨酸，或优选L-亮氨酸，已被抗氧化剂稳定的亚油酸或其酯或其盐。

脂抑制素其发酵生产过程、从液体培养基中分离脂抑制素的方法，以及将它还原为四氢脂抑制素(tetrahydrolipstatin)(THL，orlistat，一种抗多脂剂an anti-obesity agent)的方法都在美国专利4,598,089中有所描述。

在美国专利第4,598,089号中所描述的产生脂抑制素的微生物是毒三素链霉菌(streptomyces toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova)(见Bergey的细菌学手册，第八版，第811页)。1983年6月14日，毒三素链霉菌被保藏在伊利诺宜州，Peoria市的农业研究机构保藏中心，保藏号NRRL 15443。本发明的方法可用该毒三素链霉菌或其衍生的其它菌株，例如筛选出的高产突变菌株。这种方法也可用放线菌目中的链霉菌科或放线菌目中其它科的产生脂抑制素的菌类来进行。

当应用美国专利4598,089中所描述的发酵方法时，在发酵的液体培养基中含有每升几微克的很少量的脂抑制素，很难用现有经济的和技术的方法将其分离出来。

本发明提供了一种改进了的发酵生产脂抑制素的方法，即应用上述分批补料培养的方法，使该发酵液具具有更高的浓度。在该方法的第一步a)中，产生脂抑制素的微生物细胞生长在基础培养基中。在该方法的第二步b)中，向该基础培养基中加入某些成份，这些成份可直接作为生化反应前体参与生化反应，或者经过一个短暂的生物化学转变后，再作为反应前体参与生物合成过程。这种系统就可以通过该微生物以更高的浓度合成所需产物-脂抑制素。

脂抑制素的生物合成过程受一系列的基本机制的控制，如氮的抑制作用。添加各种随手可得的氮源到培养基中，特别是各种氨基酸和它们的衍生物，包括L-亮氨酸或N-甲酰基-L-亮氨酸，能有效地抑制脂抑制素的合成。本发明中只是在生物合成的各种酶被形成后，才开始加入这类氨基酸，因而不再抑制脂抑制素的生成。除此之外，L-亮氨酸或N-甲酰基-L-亮氨酸的加入方法使得氮在该培养液中保持较低浓度。

通常，能合成脂抑制素的放线菌生长于某种适合的水质基础培养基中，该培养基含一种或多种碳源，如淀粉，淀粉水解物和糖，例如葡萄糖和/或蔗糖，甘油，磷脂类，也含一种或多种氮源，如大豆粉，棉籽粉，玉米粉或玉米浆和干酵母。碳源和氮源的含量要足以使微生物获得充分生长，一般为每升培养基中含5至50克的碳源和氮源。在这种培养基中还可加其它大、小分子物质。这些物质能以复合介质的形式或以无机盐加入培养基。

这种水质培养基几乎不含脂肪和油类，而且每升培养基中含有少于10克的三甘油酯。通常在加入亚油酸和/或辛酸，或它们的酯或盐类到培养液中时，加入的速率要能使它们在培养基中为游离的，同时，不要它们在培养基中累积。一般速率为每升每小时10至1000毫克，最好是100至300毫克/升/小时。加入亚油酸和辛酸，或它们的盐和酯到培养基中时，要使其浓度低于1000毫克/升培养基，优选其浓度低于300毫克/升，并且在适当的时候停止加料，以使在脂抑制素被分离之前，该培养基中几乎没有脂肪酸和/或它的酯或盐类。通常，对于每1份辛酸，所要加入的亚油酸按1∶10重量比被加到培养基中，优选比例为1.5∶3。通常，N-甲酰基-L-亮氨酸，或优选的L-亮氨酸加到培养基中的速率是1至100毫克/升/小时，优选为5-50毫克/升/小时，以使其浓度保持在25毫摩尔以下。

可以替代一部分(或全部)亚油酸或它与辛酸混合物的盐类和酯类有：碱类，或碱土金属盐，例如：钠，钾，钙或镁盐；以及低级烷基酯，例如：甲基酯类，或甘油酯。

为了避免亚油酸[或它的酯类或盐类]氧化，需混合加入一种抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯，生育酚，卵磷脂，或它们的混合物，或一种基团捕集剂，比如BHA(叔丁基-4-羟基-茴香醚，或BHT(2，6-二叔丁基对甲酚)。

本发明还涉及到四氢脂抑制素的生产方法，该方法包括

a)在几乎无脂肪和油类，但含有适当的碳源和氮源以及无机盐类的水质培养基中，在有氧条件下培养放线菌目中的一种产生脂抑制素的微生物，直至这种微生物的起始生长阶段基本完成，有大量的细胞团生成，

b)在培养基中加入亚油酸，优选与辛酸混加(其中部分的或全部的亚油酸，和部分的或全部的辛酸可以由相应的酯类或盐类替代)，以及N-甲酰基-L-亮氨酸，优选L-亮氨酸，所述的亚油酸或它的酯或盐类已被氧化剂所稳定。

c)从该培养液中分离脂抑制素，并还原脂抑制素为四氢脂抑制素。

从这种发酵培养液中分离脂抑制素，可以应用本技术领域人员熟知的分离方法。例如，可采用下述的方法：

在发酵过程完成后，离心发酵液，得到的细胞沉淀物用一种低级链烷醇，如甲醇或乙醇处理，并用同样的溶剂提取。可用一适合的有机溶剂提取离心后的物质例如，二氯甲烷或乙酸乙酯。从上述的提取过程所得到的物质中含有所需的脂抑制素，并且可用色谱方法浓缩和纯化，方法如美国专利4,598,089中所述。

根据已知的方法，如美国专利4,598,089中所描述，在某种适合的催化剂存在下，可以使脂抑制素还原为四氢脂抑制素。可使用的催化剂的例子有：钯/碳，氧化铂，钯和同类物。适用的溶剂有，例如低级醇类，如甲醇和乙醇。该还原反应最好在低氢气压力下和室温条件下进行。

实施例1

a)制备种子培养物，其含有：10克去脂肪豆粉，10克丙三醇，5克干酵母粉并加水到1升。用28％氢氧化钠调节pH值到7.0，灭菌消毒后其pH值为6.8。将100毫升的这种培养基放入500毫升的锥形瓶中，用棉花塞盖好后灭菌消毒。之后用接种环将一接种环毒三素链霉菌(streptomyces toxytricini)，菌株NRRL 15443的孢子接种到培养基中，然后放在27℃的摇床培养箱中培养24小时。

b)将100毫升上述种子培养物接种到一个14升的发酵容器内，其中装有8升发酵培养基，发酵培养基每升含有32克去脂肪大豆粉，20克丙三醇，14克卵磷脂，和0.25毫升作为去泡沫剂的聚丙二醇，用28％的氢氧化钠调节pH值到7.4。该培养基每升含有少于5克的三甘油酯。

c)在发酵培养47小时之后开始添加脂肪酸亚油酸和辛酸，再加入0.2％(w/w)重量比的抗氧化剂(RONOXAN A)以稳定亚油酸，该抗氧化剂由70％重量的卵磷脂，25％重量的棕榈酸抗坏血酸酯和5％重量的生育酚组成。加入这些脂肪酸的速率为每小时每升加入136到190毫克，且对加入的速率进行调节，使亚油酸和辛酸的浓度在每升70毫克以下。在整个发酵过程中共加入108克亚油酸和54克辛酸。以每小时每升14.4毫克的速率加入L-亮氨酸，所加的L-亮氨酸为每升80克的水溶液，用28％氢氧化钠调节pH值到11。共加入10.2克L-亮氨酸。

将上述接种过的并已添加过上述脂肪酸和L-亮氨酸的种子培养物在有氧且搅抖下继续发酵培养，以每分钟4升的气体流量通气，使培养过程在有氧条件下进行。自动化加入硫酸或氢氧化钠溶液，使pH保持在6.1至7.3范围内。通过控制搅拌器的搅拌速度，使培养基中溶解的氧浓度不低于饱和氧浓度的10％。在收获脂抑制素时，培养物中几乎没有亚油酸和辛酸，在经过138小时发酵培养之后，脂抑制素在培养基中的滴定度是每升150毫克。

                        实施例2

用与上述实施例1a中相同的种子培养物接种一个14升的发酵器，发酵培养基如美国专利4,598,089所描述，即实施例1中的发酵培养基N7。该培养基每8升体积中，含80克土豆淀粉，40克葡萄糖，80克核糖，40克丙三醇，16克蛋白胨，160克大豆粉，16克硫酸铵。加入一种如实施例1b中的泡沫抑制剂(每升培养液加入0.25毫升聚丙二醇)。灭菌消毒之前，用28％氢氧化钠调节pH值到7.0。在有氧条件下搅拌培养，搅拌速度为每分钟400转，气体流量为每分钟4升气体。

培养结束，在该种培养基中，脂抑制素的浓度少于每升10毫克。

Claims (10)

1.一种发酵生产脂抑制素的方法，该方法包括：

a)在基本上不含脂肪和油且每升培养基中含少于10克的三甘油酯，但含有适当碳源和氮源及无机盐的水质培养基中，在有氧条件下培养能够产生脂抑制素的毒三素链霉菌微生物，直至起始生长阶段基本完成，并有大量细胞产生，

b)向液体培养基中加入亚油酸，可选择性地加入辛酸，其中部分或全部的亚油酸和/或部分或全部辛酸可以由相应的酯类和/或盐类所替代，以及加入N-甲酰基-L-亮氨酸或L-亮氨酸，所述的亚油酸或其酯或其盐已经被抗氧化剂稳定；

(i)其中亚油酸或它与辛酸的混合物，和/或它们的盐类或酯类被添加时的速率使其在液体培养基中可游离得到，但又不至于使其在培养基中积累；

(ii)其中亚油酸和辛酸，和/或它们的盐和酯的加入要使其在液体培养基中的浓度保持在每升1000毫克以下，并在适当时停止此加入，使在分离脂抑制素之前液体培养基中基本不含所述的脂肪酸和/或其酯或其盐；

(iii)且其中N-甲酰基-L-亮氨酸或L-亮氨酸被加入到培养液中的速率为每小时每升培养基1-100毫克，以使其浓度保持在25毫摩尔以下。

2.权利要求1的方法，其中所使用的微生物为毒三素链毒菌NRRL 15443菌株或其衍生菌株。

3.权利要求1的方法，其中加到培养液中的亚油酸与辛酸的比率为1-10重量份的亚油酸对1份辛酸。

4.权利要求3的方法，其中加到培养液中的亚油酸与辛酸的比率为1.5-3重量份的亚油酸对1份辛酸。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中(i)中亚油酸或其与辛酸的混合物和/或它们的酯或盐的加入速率使其可在培养液中游离得到，但其积累在速率达到每升每小时10-1000毫克时被阻止。

6.权利要求5的方法，其中所述速率为每升每小时100-300毫克。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中在(ii)中亚油酸和辛酸，和/或其盐或酯的加入要使其在液体培养基中的浓度保持在每升300毫克以下，并在适当时停止时加入，使在分离脂抑制素之前，液体培养基中基本不含所述的脂肪酸和/或其酯或其盐。

8.权利要求1-4中任一项的方法，其中在(iii)中N-甲酰基-L-亮氨酸或L-亮氨酸被加入到培养液中的速率为每小时每升培养基5-50毫克，以使其浓度保持在25毫摩尔以下。

9.一种生产四氢脂抑制素的方法，该方法包括：

a)用一种几乎无脂肪和油类且每升培养基中含少于10克的三甘油酯，但含有适当的碳源和氮源以及无机盐类的水质培养基，在有氧条件下培养产生脂抑制素的毒三素链霉菌微生物，直至这种微生物的起始生长阶段基本完成，并有大量的细胞形成，

b)在培养基中加入亚油酸，选择性地混合加入辛酸，部分的或全部的亚油酸，和部分的或全部的辛酸可以由相应的酯类或盐类替代，以及加入N-甲酰基-L-亮氨酸或L-亮氨酸，所述的亚油酸或其酯或其盐类已被抗氧化剂稳定，

c)从培养液中分离脂抑制素，并且将其还原为四氢脂抑制素；

(i)其中亚油酸或它与辛酸的混合物，和/或它们的盐类或酯类被添加时的速率使其在液体培养基中可游离得到，但又不至于使其在培养基中积累；

(ii)其中亚油酸和辛酸，和/或它们的盐和酯的加入要使其在液体培养基中的浓度保持在每升1000毫克以下，并在适当时停止此加入，使在分离脂抑制素之前液体培养基中基本不含所述的脂肪酸和/或其酯或其盐；

(iii)且其中N-甲酰基-L-亮氨酸或L-亮氨酸被加入到培养液中的速率为每小时每升培养基1-100毫克，以使其浓度保持在25毫摩尔以下。

10.权利要求9的方法，其中所使用的微生物为毒三素链霉菌NRRL 15443或其衍生菌株。