MXPA97003057A - Procedimiento para la produccion de lipestatina y tetrahidrolipestatina - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la producción por fermentación de la lipestatina, el cual procedimiento comprende:a) cultivo aeróbico de un microorganismo del orden de los actinomicetos, el cual produce lipestatina, en un medio de cultivo acuoso substancialmente exento de grasas y aceites, y que contiene fuentes adecuadas de carbón y nitrógeno y sales inorgánicas, hasta que la fase de crecimiento inicial termina substancialmente y con ello se ha producido la suficiente masa de células. b) adición al caldo, deácido linoleico, de preferencia junto conácido caprílico [en donde parte o la totalidad delácido linoleico y/o delácido caprílico pueden substituirse por el(los) correspondiente(s)éster(es) y/o sal (es)], y N-formil-L-leucina o de preferencia L-leucina, estabilizándose elácido linoleico o su(s)éster(es) o sal(es) mediante un antioxidante. La lipestatina puede separarse del caldo o hidrogenarse o tetrahidrolipestatina.

Description

Procedimiento para la producción de lipestatina y tetrahidrolipestatina La invención se refiere a un nuevo procedimiento de partida alimentada ("fed-batch") para la obtención por fermentación de la lipestatina, el cual procedimiento comprende : a) cultivo aeróbico de un microorganismo del orden de los actinomicetos el cual produce la lipestatina, en un medio de cultivo acuoso que está substancialmente libre de grasas y aceites y que contiene fuentes adecuadas de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, hasta que termina substancialmente la fase de crecimiento inicial y con ello se ha producido la suficiente masa de células, y b) adición de ácido linoleico al caldo, opcionalmente junto con ácido caprílico [en donde parte o la totalidad del ácido linoleico y/o del ácido caprílico puede ser substituida por el(los) correspondiente (s) éster(es) y/o sal(es), y N-formil-L-leucina o de preferencia L-leucina, estabilizándose el ácido linoleico o su(s) éster (es) o sal (es) mediante un antioxidante. La lipestatina, un procedimiento de fermentación para su producción, un procedimiento para su separación del caldo y un procedimiento para su hidrogenación a tetrahidrolipestat?na (THL, orlistato, un agente contra la obesidad) , están descritos en la patente USA n° 4.598.089. El organismo productor de la lipestatina según se describe en la patente USA n° 4.598.089 es el Streptomyces toxytricini, Preobrazhens aya & Sveshnikova (ver Bergey's Manual of Determinative Bacteriology ("Manual de determinaciones biológicas de Bergey" ), 8a edición, página 811) . Se depositó el 14 de Junio de 1983, en la Agricultural Research Culture Collection ("Colección de Cultivos de Investigación Agrícola"), Peoría, 111. con el nombre de NRRL 15443. El procedimiento de la presente invención puede efectuarse con este organismo o con cualquier otra cepa derivada del mismo, siendo seleccionada esta cepa mutada por su mejor productividad. Puede efectuarse también con otros organismos productores de lipestatina del orden de los actinomicetos, bien pertenecientes a la familia de los estreptomicetos o pertenecientes a otra familia dentro del orden de los actinomicetos. Cuando se aplica un sistema de fermentación como se describe en la patente USA n° 4.598.089, el caldo de fermentación después del cultivo contiene lipestatina en muy pequeñas cantidades de unos pocos miligramos por litro y es difícil separarla del mismo por métodos económica y técnicamente factibles. La presente invención proporciona un procedimiento perfeccionado para la producción por fermentación de lipestatina obteniéndose en la fermentación un caldo con una alta concentración empleando el procedimiento de partida alimentada ("fed-batch") descrito más arriba. En el primer paso a) de este procedimiento las células del microorganismo que produce la lipestatina se hacen crecer en un medio base. En el segundo paso b) de este procedimiento, se añaden ciertos componentes a este medio base, los cuales sirven o bien directamente como precursores bioquímicos o experimentan una breve conversión bioquímica y a continuación sirven como precursores de un proceso biosintético. Mediante este sistema el microorganismo puede sintetizar el producto deseado, la lipestatina, en una concentración mucho más alta. La ruta biosintética que conduce a la lipestatina se somete a una serie de mecanismos generales de control tales como la represión con nitrógeno. La adición de fuentes de nitrógeno fácilmente disponibles, especialmente aminoácidos, y sus derivados, incluyendo la L-leucina ó la N-formil-L-leucina, al medio, reprime la formación de lipestatina. En la presente invención esto se solventa empezando la adición de estos aminoácidos sólo después de que los enzimas biosintéticos hayan sido formados y así ya no se reprimen más a nivel genético. Además la L-leucina o la N-formil-L-leucina se añaden de tal forma que su concentración en el caldo permanece baja. Es conveniente que, el actinomiceto que produce la lipestatina se haga crecer en un medio base acuoso adecuado conteniendo una o más fuentes de carbono, tales como el almidón, hidrolizados de almidón y azúcares, p. ej . , glucosa y/o sacarosa, glicerina, fosfolípidos así como también una o más fuentes de nitrógeno tales como la harina de soja, harina de semilla de algodón, polvo de germen de maíz o extracto de germen de maíz, y extracto de levadura. Tanto la fuente de carbono como la fuente de nitrógeno se suministran en cantidades tales que tiene lugar un abundante crecimiento, típicamente en un margen de 5 a 50 gramos de cada fuente de carbono y de cada fuente de nitrógeno por litro de medio. Además, se añaden macro y microelementos al medio. Estos pueden estar contenidos en componentes de medios complejos o ser añadidos como sales inorgánicas . El medio de cultivo acuoso está substancialmente exento de grasas y aceites y contiene menos de 10 gramos de triglicéridos por litro de medio. Es conveniente que el ácido linoleico y/o ácido caprílico y/o sus esteres o sales se suministren a una velocidad tal, de forma que estén libremente disponibles en el caldo pero de forma que se evite su acumulación, en particular a una velocidad de 10 a 1000, de preferencia de 100 a 300 mg por litro y hora. La alimentación de ácido linoleico y ácido caprílico y/o sus sales o sus esteres se efectúa preferentemente de forma que su concentración en el caldo permanezca inferior a 1000, de preferencia inferior a 300 mg por litro, y de forma discontinua de manera que el caldo esté prácticamente exento de dicho (s) ácido (s) y/o de sus esteres o sales antes de aislar y separar la lipestatina. Es conveniente que el ácido linoleico y el ácido caprílico se añadan al caldo en una proporción de 1 a 10, de preferencia 1,5 a 3 partes por peso de ácido linoleico añadido por l parte de ácido caprílico. Es conveniente que la N-formil-L-leucina o de preferencia la L-leucina se añada al caldo a una velocidad de l a 100, de preferencia 5 a 50 mg por litro de caldo por hora, de forma que su concentración permanezca inferior a 25 milimolar.

Ejemplos de sales y esteres que pueden substituirse por una parte (o por la totalidad) del ácido linoleico o por su mezcla con ácido caprílico son las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, p. ej . sodio, potasio, calcio o magnesio, y esteres de alquilo inferior, p. ej . esteres de metilo o glicéridos. Con el fin de prevenir la oxidación del ácido linoleico [o de su(s) éster (es) o sal (es), se mezcla con un antioxidante, tal como el palmitato de ascorbilo, tocoferol, lecitina, o mezclas de los mismos, y/o un agente captador de radicales, tal como el BHA (terc-butil-4-hidroxi-anisol) o BHT (2, 6-diterc-butil-p-cresol) . La invención se refiere además a un procedimiento para la producción de tetrahidrolipesta ina, el cual procedimiento comprende: a) cultivo aeróbico de un microorganismo del orden de los actinomicetos, el cual produce lipestatina, en un medio de cultivo acuoso substancialmente exento de grasas y aceites, y que contiene fuentes adecuadas de carbón y nitrógeno y sales inorgánicas, hasta que la fase de crecimiento inicial termina substancialmente y con ello se ha producido la suficiente masa de células, b) adición al caldo, de ácido linoleico, de preferencia junto con ácido caprílico [en donde parte o la totalidad del ácido linoleico y/o del ácido caprílico pueden substituirse por el (los) correspondiente (s) éster (es) y/o sal (es)], y N-formil-L-leucina o de preferencia L-leucina, estabilizándose el ácido linoleico o su(s) éster (es) o sal (es) mediante un antioxidante. c) separación de la lipestatina del caldo e hidrogenación de la lipestatina a tetrahidrolipestatina. La separación de la lipestatina del caldo de fermentación puede efectuarse mediante métodos de por sí ya conocidos y que son familiares a cualquier persona experta en la especialidad. Por ejemplo, puede efectuarse como sigue: Una vez finalizada la fermentación, se centrifuga el caldo de fermentación. A continuación, la masa celular resultante puede tratarse con un alcanol inferior tal como el metanol o etanol y extraerse con el mismo disolvente. El centrifugado puede ser extraído con un disolvente orgánico adecuado (p. ej . con cloruro de metileno o acetato de etilo) . El material producido de los extractos contiene la lipestatina deseada y puede enriquecerse y purificarse mediante métodos cromatográficos, p. ej . como se describe en la patente USA n° 4.598.089. La hidrogenación de la lipestatina a tetrahidrolipestatina puede efectuarse de acuerdo con métodos de por sí ya conocidos, p. ej . como se describe en la patente USA n* 4.598.089 en presencia de un catalizador adecuado. Ejemplos de catalizadores que pueden emplearse son el paladio/carbon, óxido de platino, paladio y similares. Disolventes adecuados son, por ejemplo, alcoholes inferiores tales como el metano! y etanol. La hidrogenación se efectúa de preferencia con bajas presiones de hidrógeno y a temperatura ambiente.

Ejemplo .1 a) Se prepara un cultivo de siembra que consta del medio de precultivo siguiente: 10 g de harina de soja desengrasada, 10 g de glicerina, 5 g de extracto de levadura y agua para completar 1 litro. Se ajusta el pH a 7,0 con NaOH 28%, para obtener un PH de 6,8 después de la esterilización. Se introducen 100 ml de este medio en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, se cierra con un tapón de algodón y se esteriliza. A continuación, se inocula con un asa de esporas de Streptomyces toxytricini , de la cepa NRRL 15443 y seguidamente se incuba con agitación a 27°C durante 24 horas. b) Se emplean 100 ml de este cultivo de siembra para inocular un fermentador con un recipiente de 14 litros que contiene 8 litros de un medio de producción que contiene por litro: 32 g de harina de soja desengrasada, 20 g de glicerina, 14 g de lecitina, 0,25 ml de polipropilenglicol como agente antiespumante, mientras que el pH se ajusta a 7,4 con NaOH 28%. El medio contiene menos de 5 gramos por litro de triglicéridos. c) Después de una fase de crecimiento de 47 horas, se da comienzo a la alimentación. La misma consiste en los ácidos grasos, ácido linoleico y ácido caprílico, de los cuales el ácido linoleico se estabiliza mediante la adición de 0,2% (p/p) de un antioxidante (RONOXAN A) que consta de 70% (p/p) de lecitina, 25% de palmitato de ascorbilo y 5% de tocoferol . Estos ácidos grasos se añaden a una velocidad de 136 a 190 mg por litro y hora, y la velocidad de adición se ajusta de forma que la concentración de cada uno de los ácidos linoleico y caprílico permanezca por debajo de 70 mg por litro. El total de la adición en el curso de la fermentación es de 108 gramos de ácido linoleico y 54 gramos de ácido caprílico. La L-leucina se añade a una velocidad de 14,4 mg por litro y hora, en forma de una solución acuosa que contiene 80 g de L-leucina por litro de alimento, ajustando el pH a 11 con NaOH 28%. Se añade un total de 10,2 gramos de L-leucina. El medio de cultivo después de la siembra con el antes mencionado cultivo de siembra, y mientras se alimenta con los ácidos grasos antes mencionados y la L-leucina, se incuba con agitación, y se airea a una velocidad de 4 litros de aire por minuto para mantener el cultivo aeróbico. El pH se mantiene en un margen de 6,1 a 7,3 mediante la adición automática de una solución de ácido sulfúrico o hidróxido de sodio. La concentración de oxígeno disuelto no se deja bajar más del 10% de la concentración de saturación mediante el ajuste de la velocidad del agitador. En el momento de la recogida, el cultivo está prácticamente exento de ácido linoleico y ácido caprílico. El título de la lipestatina, esto es, su concentración en el medio de cultivo es de 150 mg/litro después de un período de incubación de 138 horas. Ejemplo 2 El mismo cultivo de siembra del ejemplo la) anterior, se emplea para inocular un fermentador de 14 litros con un medio de producción como se describe en la patente USA n° 4.598.089, concretamente el medio de producción N 7 del ejemplo l de la misma. Este medio contiene por 8 litros: 80 g de almidón de patata, 40 g de glucosa, 80 g de ribosa, 40 g de glicerina, 16 de peptona, 160 g de harina de soja, 16 de sulfato de amonio. Se añade un agente antiespumante (0,25 ml de propilenglicol por litro de medio) como en el ejemplo Ib) anterior. El pH se ajusta a 7,0 con NaOH 28% antes de la esterilización. La incubación se efectúa aerobicamente, mientras se agita a 400 rpm y con una velocidad de aireación de 4 litros de aire por minuto . Después de la incubación, se ha encontrado una concentración de lipestatina inferior a 10 mg/litro en el medio de cultivo. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siauientes:

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para la producción por fermentación de lipestatina, caracterizado porque comprende: a) cultivo aeróbico de un microorganismo del orden de los actinomicetos, el cual produce lipestatina, en un medio de cultivo acuoso substancialmente exento de grasas y aceites, y que contiene fuentes adecuadas de carbón y nitrógeno y sales inorgánicas, hasta que la fase de crecimiento inicial termina substancialmente y con ello se ha producido la suficiente masa de células, b) adición al caldo, de ácido linoleico, de preferencia junto con ácido caprílico [en donde parte o la totalidad del ácido linoleico y/o del ácido caprílico pueden substituirse por el(los) correspondiente (s) éster(es) y/o sal(es)], y N-formil-L-leucina o de preferencia L-leucina, estabilizándose el ácido linoleico o su(s) éster (es) o sal (es) mediante un antioxidante.
2. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo del orden de los actinomicetos es de la familia de los estreptomicetos, y el medio de cultivo acuoso, substancialmente exento de grasas y aceites, contiene menos de 10 gramos de triglicéridoß por litro de medio.
3. 3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el ácido linoleico o su mezcla con ácido caprílico o sus esteres o sales, se añaden a una velocidad tal que estén libremente disponibles en el caldo pero de forma que se evite su acumulación, de preferencia a una velocidad de 10 a 1000, especialmente de 100 a 300 mg por litro y hora.
4. 4. Un procedimiento según la reivindicación 3, caracterizadoporque la adición de ácido linoleico y ácido caprílico y/o sus sales o sus esteres se efectúa de forma que su concentración en el caldo permanece inferior a 1000, de preferencia inferior a 300 mg por litro, y de forma discontinua de manera que el caldo está prácticamente exento de dicho (s) ácido (s) graso (s) y/o sus esteres o sales antes de separar la lipestatina.
5. 5. Un procedimiento según la reivindicación 364, caracterizado porque el ácido linoleico y el ácido caprílico se añaden al caldo en una proporción de l a 10, de preferencia de 1,5 a 3 partes por peso de ácido linoleico añadido por 1 parte de ácido caprílico.
6. 6. Un procedimiento según la reivindicación 3, 465, caracterizado porque se añade N-formil-L-leucina o de preferencia L-leucina al caldo a una velocidad de 1 a 100, de preferencia de 5 a 50 mg por litro de caldo por hora, de forma que su concentración permanezca por debajo de 25 milimolar.
7. 7. Un procedimiento para la producción de tetrahidrolipestatina, caracterizado porque comprende: a) cultivo aeróbico de un microorganismo del orden de los actinomicetos, el cual produce lipestatina, en un medio de cultivo acuoso substancialmente exento de grasas y aceites, y que contiene fuentes adecuadas de carbón y nitrógeno y sales inorgánicas, hasta que la fase de crecimiento inicial se termina substancialmente y se ha producido la suficiente masa de células, b) adición al caldo, de ácido linoleico, de preferencia junto con ácido caprílico [en donde parte o la totalidad del ácido linoleico y/o del ácido caprílico pueden substituirse por el(los) correspondiente (s) éster(es) y/o sal(es)], y N-formil-L-leucina o de preferencia L-leucina, estabilizándose el ácido linoleico o su(s) éster (es) o sal (es) mediante un antioxidante , c) separación de la lipestatina del caldo e hidrogenación de la lipestatina a tetrahidrolipestatina. *****