DE2633666C3 - Verminderung des Lipid- und Nucleinsäure-Gehaltes in mikrobiellen Zellmassen - Google Patents

Verminderung des Lipid- und Nucleinsäure-Gehaltes in mikrobiellen Zellmassen

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DE2633666C3
DE2633666C3 DE2633666A DE2633666A DE2633666C3 DE 2633666 C3 DE2633666 C3 DE 2633666C3 DE 2633666 A DE2633666 A DE 2633666A DE 2633666 A DE2633666 A DE 2633666A DE 2633666 C3 DE2633666 C3 DE 2633666C3
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/08—Reducing the nucleic acid content

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Description

worin entweder R. und Ri Wasserstoff bedeuten und η für eins, zwei oder drei steht, oder worin R, die Hydroxygruppe und R2 Wasserstoff. Methyl oder Äthyl bedeuten und α für zwei oder drei steht. einserOkeiichistyPropenol.odNorinaJdnickundin Bereich von -20*C bis +6CC S bis 120 Minuten lang behandelt, wobei der Gesamt-Wassergehalt wihrend des Aufschlusses 0 bis 30 Gewichtsprozent, bezogen auf die eingesetzte Losungsmittebtenge. betragt, worauf die Behandlung des Rückstandes der ZeUmasse mit Wasser bei einem pH-Wer. im Bereich von 5 bis 83 erfolgt
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekernt· zeichnet, dafi der NHrGehaft wahrend des Auf· Schlusses 1 bis 10 Gew.·*, bezogen auf die em«esetzteU$uiieuniuetaenge.betrtgt
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vermmde· rung der Lipid- und Nudeineluramenge, die in Zellen Mikroorganismen enthalten ist Jede Zelle enthalt Pi liid d Nli Di
noch zur Entfernung restlicher Nudeinsluremengen mit Wasser gewaschen werden.
Weitere bekannte Verfahren, mikrobielte Zeihnassen nudeinslure· und lipidarm tu machen, verwenden den
» alkalischen Aufschnitt bei erhöhten Temperaturen,
Nachteilig ist hierbei die Freisetzung der bei der Hydrolyse entstandenen freien Fettsäuren, die sieh
zusammen mit dem Protein abscheiden.
AuÖerdem geht ein Teil der im Protein enthaltenen
μ essentiellen Aminosäuren, z, B. Lysin, in einen vom Organismus nicht verwertbaren Zustand Ober.
Es wurde nun ein Verfahren zur Verminderung des Up^' und Nudeinsluregehaltes in mikrobiellen ZeK* muten durch Extraktion mit organischen LOsungs-
is mitteln sowie Behandeln des Rückstandes der ZdI-masse mit Wasser gefunden, das dadurch gekenn· zeichnet ist. daB man die Zellmassen mit einer Extraktionsmischung aus Ammoniak oder Ammonhimhydro· syd und einem organischen Lösungsmittel der allgemei-
» nenForm«!!
g J
Kohlehydrate, Proteine, lipide und Nucleinsäuren. Die Verwendbarkeit von mikrobiellen Zdtanassen ab Nahrungsmittel und Futtermittel wird durch einen Gehalt an Nucleinsäuren und Lipiden negativ been· nufit
Ein Nucleinsäuregehalt bt bedenklich, da er zu |MUhologbchenZusanden(Gidit.Hamtem)fOhft
Aufgäbe der Erfindung bt es daher, den Uptd- und Nucleinsäuregehalt in mikrobiellen Zellmassen zu senken. Nach bekannten Verfahren werden die lipide entweder aus Zellwind und Membran durch organische Lösungsmittel herausgelöst oder durch Behandlung mit wabngen Alkalien verseift
Ein bekanntes Verfahren zum Herauslösen der Lipide aus Mikroorganismen arbeitet mh Gemischen aus Methanol und Chloroform. Das Verfahren bt aufwendig und kann zu toxischen Produkten führen. Lipidextrak· tionen mit Alkohol-Wasser-Gemischen (nach DEOS 2t 37 OM) eignen sich schlecht für Bakterien und sind in der technischen Ausführung ebenfalls aufwendig.
Aus der DEOS 24 OS $93 bt es bekannt in mikrobiellen Zellmassen die Menge der vorhandenen Nu· deinsaurendadurchzuvefTingentdaemandasMaterial mh einem organischen Losungsmittel wie einem niederen Alkohol behandelt und anschließend das Ktoungsmittelbehandelte Material der Einwirkung einet waB-rigen Alkalb unter Bedingungen, unter denen die Nudeinsauren loslich werden, aussetzt Ab wäßriges Alkali werden hierbei auch Ammoniak und Ammoniumhy· droxyd genannt Das so behandelte Material kann dann R1-(CHi)1-ORi
worin entweder Ri und Ra Wasserstoff bedeuten und β
» für eins, zwei oder drei steht, oder worin Ri die Hydroxygruppe und Ri Wasserstoff, Methyl oder Äthyl bedeuten und η for zwei oder drei steht, «nschheftlich bo-Propanol, bei Normaldruck und im Bereich von -WC bis +WC S bis 120 Minuten lang behandelt,
is wobei der Gesamt-Wassergehalt wihrend des Auf· Schlusses 0 bis 30 Gewichtsprozent, bezogen auf die eingesetzte Losungsmittelmenge, betragt worauf die Behandlung des Rückstandes der Zellmasse mit Wasser bei einem pH·Wert im Bereich von 5 bis 6,5 erfolgt
JS Ab mikrabieUe ZeHmanm werden am besten Mikroorftiusmen.dk dun* Zftcbtung auf Alkohol oder B-Paraffinen in Gegenwart eines wiflrigen Nlhnne* um und eines freien Sauerstoff eothaheiideo Gases erzeugt sind, verwendet
« Beispiele for solche Mikroorganismen and Methanol verwertende Bakterien der Gattung Methytomonas, ζ. & Methylomonas dare ATCC 91 226, und Hefen wie CandidalipolyticaATO:»3*3,<ltedurchZ0chti«geci n-ParafTinen in Gegenwart eines waflrigen NUwmeft·
«s um» erhalten werden können.
PUztrockenmycelien können ebenfalls verwendet werden. Dieses Zellmaterial kaac aus der Antibiotika. Gewinnung, beispielsweise aus Penkiamfermentttio· neu, entnommen werden, nachdem das Antibiotikum
*> extrahiert wurde.
Ab Lösungsmittel der Formel I kommen Afcohofc wkMethaimlAthanoLii-rVopanoltadiso-Propaiiolm Betracht Am besten sind Methanol und Äthanol, insbesondere Methanol
» AuBer den genannten Alkoholen eignen skA Glykole und ihre Monolther der Formel L namentfidi Glykol undMonomethylglykH
Ammoniak kann den genannten Lösungsmitteln gasförmig (NHj) oder ab konzentrierte widrige Losung
es (NHiOH) zugesetzt werden. Die Wahl erfolgt nach Wassergehalt des Zefltreckenmateriab
Menge und Wassergehalt des ia
tets. NH4OH eignet sich bei ZeHmassen mh t
Feuchtigkeitsgehalt (0- IS*} NHi dagegen besser bei
«β Zellmassen mit höherem Wassergehah(10-30%).
Die Entfernung der lipide hingt vom Gesamtwassergehalt der in Gew.-% auf die vwnde Losungsmh· teknenge bezogen wird, und von der NHrKonzentra·
3 4
tion in Gew.·*, bezogen auf das eingesetzte Lösung»- Diese Extraktion der Nucleinsäuren, Sähe, Potvsac·
mittet, ab. charide und Wasserlachen Sefandirrocttbotitc nut
Besonders gute Venuehsergebnisse lassen sich bei Wasser wird nn allgemeinen η einem Tempersturbe-
einem ZeOenmatseAjosuiigsmittel-C^wichtsverhlltnis reich von 30*-WC bei NormaMnick durchgeführt,
von 1:3bts 1:6 bei Methanol und Äthanol, und 1:8 bis ι GtM sind Temperaturen von 40* -WC besonders gut
l:12b«Prapanol.GlykdunddenMonoelykoUthern SC-WCDieExtraktionsdauer kann je nach Extrik-
ernelen. Die Ammoniakkonzentration, bezogen auf die tkmstemperatur und Wassermenge S-130 Minuten
LOsufigsmittelmenre, betrlg! 1-10 Gew.-*, am besten betragen, gute Ergebnisse erzielt man mit 25-45 I-Sfe Oe Summe der Wassennengen. die herrahren minotiger Extraktionszeit Zur Trennung fester und
aus Zellmasse, Lösungsmittel und gegebenenfalls aus ta flossiger Betundteile wird die Suspsion, am besten
widrigem Ammoniak, betragen 0-30 Gew..*, besser bei Temomturen von 10*-30*C zentrifugiert Andere
0-20*. msbeswidere 0-10 Gew.-*, bezogen auf die geeignete Trennverfahren smd Sedimemation und
etzteLosungsmiuehnenge, Filtration.
Arbeiten im technischen Mtßjub kann auf eine Die feste Phase wird nach gingigca Verfahren wie Trocknung der Zellen nach der Fermentation bis auf W Gefrier.. Vakuum· oder Sprühtrocknung von Fluttig·
einen geringen Restwasscrgchalt von 4* oder niedn- ketalresten befreit Das Produkt besitzt angenehme
gerverzichtet werden. Es genagt, die ZcBmasse auf ein Getuchaeitenschaftcn, eine heBere Farbe als das
solches ZeOtrockengewicht zu bringen, daJ nach Zusatt Ausgangtmaterial und ein besonders gutes Waiserbin·
der benötigten Losungsmittelmenge der Gesamtwas· devrmogen. Durch die Entfernung der Lipide und
sergehalt im optimalen Bereich liegt; gegebenenfalls » Nodeimluren eignet ei »kJi besolden zur Hersuflung
wird man dem Losungsmittel gasformiges NHi suset· von Nahrung», und Futtermitteln,
ten. So sind bei dem Produkt gemlB der Erfindung die
Dti Löten der Fette aus den mikrobieUen2eUinassen Lipide bis auf einen Restgehalt von 04 bis V Gew.·*,
wird so durchgeführt, daB das ZeUmaterial im tfe Nucleinsäuren bis auf einen Restgehah von W-4.5
Lösungsmittel suspendiert und NHi eingeleitet oder i» Gew.·*, entfernt NH4OH zugegeben wird. Zweckmäßig Ist das Durchmi· Das Verf ihren gemlB der Erfindung vermeidei die
sehen der Suspenikwöun* Rühren. Die Behandlungs. Nachteile der bekannten Verfalsren wie Lösungsmittel·
temperaturen liegen im Bereich von -20* bis +WC. behandkmg oder alkalischen AufschhiB. tiilorierte
wobei ein Bereich von+5* bb+50*C und msbesonde- Kohlenwasserstoffe werden nicht benötigt Die Entfet-
revon+10* Dis+3(rCKhrgutBtDieBehandlun«t- JS tuiig mh AiniiKNuaJUAlkohd-Cefniscfoea isi, nsbeson-
dauerbetrlgt 5 bis 120 Minuten und üegt am besten bei den bei Bakterien, wesentlich volbtlndiger ab bei
25-35 Minute*^ Behandlung wW bei Nc*meJdrock Behandlung der Zellmasse mh Afcohol/Waeer-Gtim-
durchgefohrt sehen. Temperatur- und pH-Bereiche, die den Funk-
Nach Beendigung der LOsungsmittel/Ammoniak-Be· tioaswert des Produktes herabsetzen, werden vermie-
bandhmg wird das erhaltene Protein nach beliebigen M dea Der Energieaufwand ist geringer als bei den
VerfihrenwieZentnfujieren.Fatr«tion»mdSe<ümenu. alkalischen AufsdüuBverfahren. Die Protemanreiche·
tion vom Lösungsmittel getrennt rung gelingt ohne das Anfallen großer Mengen von
Am besten ist die Filtration. Das erhaltene feste Neutralisationssalzea Zeumaterial kann zur möglichst voOstlndigen Entfer· Die vom festen Zellmaterial abgetete wiBrige
nung der Lipide mh einem der genannten organischen «a Phase enthllt neben anderen wasserlöslichen Bestand·
Lösungsmittel nochmals behandelt werden. Der Rock· teilen die Nucleinsäuren, die nach bekannten Verfahren,
■und kann zur Entfernung von Lösungsmittelresten und & B. durch Ausfallen m sauren Medien, Ultrafiltration,
Ammoniak getrocknet werden. Zweckmäßig wird dies Dialyie
dDdiSOT Di E
g y yi.e
gav.iSOTorr. Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erilu· und erhöhter Temperatur, am besten 40»-50*C 4* tert
dugeführt Das so entfettete und getrocknete _ , ...
Produkt ist genichk«. Beispiel 1
Die nach dem vorstehend genannten Verfahren vom Methylomonas dan ATOC 31226 wurde in einer fetten Zeumaterial abgetrennte fMssige Phase enthllt Nährlösung, enthaltend Methanol ah) emzige Kohlen· Amnoniak und gelöste lipide. Das eingesetzte » stoffqueOe, Ammoniak ab emzige Stickstoffquelfc, Löaungsmittel kam durch Vakuumdestillation von den Phosphat Eisen-, Magnesium-Satze und andere Obliche Fettes abgetrennt und wieder eingesetzt werden. Spureneleinenie Mter aercijen Bedmgioigen gezOchtet.
Ansdilie8end werden die entfetteten und gegebenen· Die dabei erzeugte Bakterienzeumasae wurde «on der falb getrockneten ZeHmassen in Wasser auf genommen. Lösung abgetrennt und der Sprühtrocknung unterwor· Die Wassermenge wird mindestens so bemessen, dall » fett.
cm Rohren der Suspension möglich ixt lOOg dieser ZeOmaate wurden mit 300g Methanol
Der pH-Wert wahrend der Wasserbehandlung muB versetzt Unter Rohren der Suspension wurden 10 g
. . NHrOas eingeleitet und gelost Deren Kehlen wurde
die Temperatur wahrend des Emlenem mlJS*-3FC äwiäHuSil Du Gcifflscn aho Mctnvio«« AfMooivek vtd
^^^^^^nenStuit Zenmasw wurde 30 Minuten bei 20»C geröhrt
verwendet werden, die dann auch noch Re»tmengen an Zur Trennung der festen und fMssigen Phase wurde Ammoniak enthalten, was zu einem zu hohen pH·Wert filtriert und der feste Rückstand einmal mit 300ml nuueukann. Methanol gewaschen. Nach erneuter Filtration wurden
Zur besseren Flockuhening derZePmasse wird dem as beide Filtrate vereinigt Diese braune Losung entMeh
T^rJ" ^?" ^!i* m 20J*?*''*'«? 1^1*" «· "P* *" eingesetzten Ausgangasubstanl Metna- ?-'* °^·'*. «^ n·^^ ADcohob wie Äthanol nol und Ammoniak wurden durch Vakuumdestillation MetteBolambettenMethanoLzagesetzt (ioo Torr. 40»C) entfernt Der Rückstand, der tfi
Gew.-% des eingesetuen ZeUenmateriab betrug, war eine dunkelbraune, übelriechende Paste, die aus freien Fettsäuren. Gryceriden. Phosphonpioen und Sekundär· mewDomn Dao
Der bei der Filtration erhaltene feste Rückstand der extrahierten Zellmasse wurde im Vakuum (100 Torr) bei 40*C S Stunden getrocknet Es konnten so 90g entfettete Zellmasse erhalten werden, die geruchlos war ellere Farbe ab das Ausgangsmaterial besaß, dhl d
und ein
und eine hellere Farbe ab das Ausgags
Zur Verminderung des Nudemsleregehalte· wurde diese ZeUmasse in 900ml Wasser suspendiert Der pH-Wert der durch Ruhren homogesieren Suspension betrug 6$.
Nach Erhöhung der Temperatur auT5S*C wurde noch 20 Minuten weitergeführt, auf 30*C abgekehlt und durch Zentrifugieren in feste und flüssige Phase getrennt Das erhaltene Sediment wurde erneut mit 900ml Wasser vermischt und 10 Minuten bei 30*C geröhrt. Danach wurde erneut zentrifugiert und das Sediinent unter vermindertem Druck getrocknet
Die Ausbeute betrug 65 g. Der Nucleinsäuregehalt war von ursprünglich 11.2% auf 1,5% gesunken. Das Produkt war in trockenem Zustand geruchlos, mit Wasser befeuchtet becaB es einen lympathiscbea
Du» Ergebnis dieses und der weiteren Deiiend in oecbfoigendai '
Beispiel 2
Als Auganfsmaterial dieme die gleiche BakterienzeUniasse wie in Beispiel I verwendet Sie wurde den gleichen Verfahrensschritten und Bedingungen unter· werfen, doch wurden stau gasförmigem NK1 30ml konzentriert« NrW)H (33%ig) als Reagenz verwendet
Beispiel 3
Es wurde wie m Beispiel 2 verfahren! jedoch wurden 60mlkon*.NH«OH(33%ig)
Beispiel 4
Bei einer Verfahrensweise wie in Bespiel 2 wurde statt Methaool Äthanol ab Lösungsmittel verwendet
Beispiel 5
Bei sonst gleicher Verfahren w wie in Beispiel 3 wurde statt Methanol Grykounonoroethylither ab
Beispiel 6
Es wurde verfahren wie in Beispiel 2. Statt Methanol wurde i-Prepenol ab Lösungsmittel eingesetzt
Beispiel 7
Ab Ausgangsmaterial wurde eine Zellmasse aus
verwendet 100 g des sprühgetrockneten Produkts wurden wie in Beispiel 1 beschrieben aufgeschlossen und entfettet (15g NK1). jedoch wurde auf die voUsttndige Trocknung des Rückstandes verzichtet Der gründlich abgesaugte Filterkuchen mit einem PestMofTgehalt von 85% wurde m 900ml Wasser suspendiert Der pH-Wert steine sich auf 85 ein, bedingt durch den in der feuchten Biomasse verbliebenen Ammoniak.
Die Temperatur der Suspension wurde unter Rohren auf 650C erhöht und nach 5 Minuten der s pH-Wert durch Zugabe von HCI auf 7,2 eingestellt Danach wurde noch 15 Minuten bei 6S*C weitergerOhrt dann auf 40»C abgekühlt und zentrifugiert Das erhaltene Sediment wurde getocknet
Beispiel 8
Candida lipolytkt ATCC 20 383 wurde auf n-Paraffinen in Gegenwart eines wtJrigen Nlhrmediuim und eines Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert Die
ts Hefezellmesse wurde von der Nlhriosung abgetrennt und getrocknet
100g der trockenen HefezeHmasse wurden bei Raumtemperatur unter Normaldruck in 300 g Methanol suspendiert und dieser Mischung im Verlauf von 15
» Minuten lOg NHrGw zugeführt Dabei wurde die Temperaair der Suspension durch Kühlung auf IS*C gehalten. Nach Einleiten des Gases wurde noch 20 Minuten bei 22*C weitergerOhrt und anschUeflend Ober eine Saugfritte nitriert Der Filterkuchen wurde einmal
» mit 300ml Methanol auf der Fntte durchmischt und anschUeflend abgesaugt Die beiden Filtrate wurden vereinigt Die Losung war gel» und enthielt «te Lipide des eingesetzten ZeOmatenab. Methanol und NHs wurden bei verminerem Druck (U Torr) entfernt
» Der nach der zweiten Filtration verbliebene Rückstand, der aus den zerstörten und entfetteten Zellen des Mikroorganismus bestand, wurde im Vakuumtrocken· schrank bei WC (IM Torr) 5 Stunden getrocknet Des so erhaltene Produkt hatte eine hellere Farbe ab die
» anfangs verwendete HefezeMmassc und war geruchto»,
Zur Verminderung des Nucleinsäuregehaltes von ursprünglich 7,5 Gew.-%, bezogen auf das Ausgangsma· tcriaL wurden 100g der entfetteten und getrockneten Hefe in einer Losung aus I Liter destilliertem Wasser
«o und 100 ml Methanol suspendiert Unter Rohren wurde die Mischung bei dem sich emstefteaden pH· Wert von W für 15 Minuten auf 50*C gebracht und durch Zentrifugieren in ein Sediment das das Hefeprotein enthielt und meine flüssige Phase, die loslich gemachte
«* Nudeinslure enthielt getrennt Das Sediment wurde nach einer nochmaligen Wasche bei Raumtemperatur der Gefriertrocknung unterworfen.
Der Nucleinsäuregehalt des getrockneten Materiab war von ursprunglich 7,5 Oew.-% auf (M Gew.·«*
* gesunken.
Beispiel 9
*» Bei einem Verfahren wie m Beispiel 8 wurde statt Methanol Äthanol und statt lOg NHrgasfOrmig 60ml NrUOH(33%ig)eingesetzt
Beispiel 10
Pcnkillhim chrysogenum ATCC 10238 wurde m einer Nihriosung. enthaltend Lactose, Mabquellwasser, Phosphat Carbon« und Magnesiumsulfat nach üblichen Methoden aerob gezüchtet Nach Abtrennung des produzierten Penicillins verhieb das Mycel. das getrocknet ab Ausgangsmaterial diente.
Ms vcnuifen wurae wie η Beispiel w
durchgeführt Sutt NH1 wurde NH4OH 33%ig eingesetzt Das entfettete Trockenmycel wurde bei 30°C mit Wasser gewaschen.
Beispiel U
Als Ausgangsmaterial diente die gleiche ZeUmasse
wie bi Beispiel 10 beschrieben. Sutt Methanol wurde Äthanol verwendet Die Temperatur wihrend der Wasserextraktion wurde auf STC erhöht um] IS Minuten dabei gehalten, finden folgenden Tabellen sind die Ergebnisse der pile I—U aufgeführt
Tabelle la
Entfernung der Lipide
Bei 100g eingesetzte ZeUmasse Pen Temp. Nudeimiure Lösungsmittel (Gew.·*) (Oe*.*) NH) (S) bzw.
spiel Art CQ (Oev.*) 300g NH4OH
IU (3MIg, ml)
1 Methylomonas (Oew.-%) IU Methanol NHi 10
2 Methylomonas 7 IU Methanol NH4OH 30
3 Methylomonas 7 IU Methanol NH4OH 60
4 Methylomonas 7 IU Äthanol NH4OH 30
S Methylomonas 7 Glykolmono- NH4OH 60
7 IU methyiather
6 Methylomonas 15,4 i-Propanol NH4OH 30
7 Methylomonas 7 74 Methanol NHj 15
8 Candida lipolytica 9,6 74 Methanol NHj 10
9 Candida lipolytica e\2 2.6 Äthanol NH4OH 60
10 Trockenmycel 8.2 16 Methanol NH4CH 30
U Trockenmycel 34 Äthanol NH4OH 30
Tabelle Ib 34
Entfernung der Nucleinsäuren
Beispiel Waschwasser Erhaltene IHlmiti*
Menge pH Menge ve
(1) (I)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Il
0,9
0,9
0\9
0,9
0.9
0,9
IjO
0.8
0,9
0,9
7/)
7,1 7jO 7.2
64 64 64
55 60 65 SO SS 60 65 SO 45 30 85
65 67 63 67 63 64 62 (A 67 78 79
04 U
24 3,4 U 1.4
1.1 U
14 U M 14 24 4,0 1.4 0,4 0,7 04 04

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    I. Verfahren zur Verminderung des Lipkl· und Nucleinsäuregehaltes in mikrobiellen Zellmassen durch Extraktion mit organischen Losungsmitteln sowie Behandeln des Rückstandes der Zellmasse mit Wasser, dadurch gekennzeichnet. daB man die Zellmassen mit einer Extraktionsmischung aus Ammoniak oder Ammonhimhydroxyd und einem organischen Losungsmittel der allgemei· nen Formel I
DE2633666A 1976-07-27 1976-07-27 Verminderung des Lipid- und Nucleinsäure-Gehaltes in mikrobiellen Zellmassen Expired DE2633666C3 (de)

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