DE2633666B2 - Verminderung des Lipid- und Nucleinsäure-Gehaltes in mikrobiellen Zellmassen - Google Patents

Verminderung des Lipid- und Nucleinsäure-Gehaltes in mikrobiellen Zellmassen

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Description

Ri-(CH2),,-OR2
R1- (CH2),,- OR2
worin entweder R, und R2 Wasserstoff bedeuten und η für eins, zwei oder drei steht, oder worin Ri die Hydroxygruppe und R2 Wasserstoff, Methyl oder Äthyl bedeuten und π für zwei oder drei steht, einschließlich iso-Propanol, bei Normaldruck und im Bereich von -200C bis +60° C 5 bis 120 Minuten lang behandelt, wobei der Gesamt-Wassergehalt während des Aufschlusses 0 bis 30 Gewichtsprozent, bezogen auf die eingesetzte Lösungsmittelmenge, beträgt, und nach Abtrennen der Extraktionsmischung den Rückstand der Zellmasse mit Wasser wäscht
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der NH3-Gehalt während des Aufschlusses 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die eingesetzte Lösungsmittelmenge, beträgt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung der Lipid- und Nucleinsäuremenge, die in Zellen von Mikroorganismen enthalten ist Jede Zelle enthält Kohlehydrate, Proteine, Lipide und Nucleinsäuren. Die Verwendbarkeit von mikrobiellen Zellmassen als Nahrungsmittel und Futtermittel wird durch einen Gehalt an Nucleinsäuren und Lipiden negativ beeinflußt.
Ein Nucleinsäuregehalt ist bedenklich, da er zu pathologischen Zuständen (Gicht, Harnstein) führt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, den Lipid- und Nucleinsäuregehalt in mikrobiellen Zellmassen zu senken. Nach bekannten Verfahren werden die Lipide entweder aus Zellwand und Membran durch organische Lösungsmittel herausgelöst oder durch Behandlung mit wäßrigen Alkalien verseift.
Ein bekanntes Verfahren zum Herauslösen der Lipide aus Mikroorganismen arbeitet mit Gemischen aus Methanol und Chloroform. Das Verfahren ist aufwendig und kann zu toxischen Produkten führen. Lipidextraktionen mit Alkohol-Wasser-Gemischen (nach DT-OS 24 05 94 oder DT-OS 21 37 038) eignen sich schlecht für Bakterien und sind in der technischen Ausführung ebenfalls aufwendig.
Weitere bekannte Verfahren, mikrobielle Zellmassen nucleinsäure- und lipidarm zu machen, verwenden den alkalischen Aufschluß bei erhöhten Temperaturen. Nachteilig ist hierbei die Freisetzung der bei der Hydrolyse entstandenen freien Fettsäuren, die sich zusammen mit dem Protein abscheiden.
Außerdem geht ein Teil der im Protein enthaltenen essentiellen Aminosäuren, z. B. Lysin, in einem vom Organismus nicht verwertbaren Zustand über.
Es wurde nun ein Verfahren zur Verminderung des Lipid- und Nucleinsäuregehaltes in mikrobiellen ZeIlworin entweder Ri und R2 Wasserstoff bedeuten und η für eins, zwei oder drei steht, oder worin Rj die
ίο Hydroxygruppe und Rj Wasserstoff, Methyl oder Äthyl bedeuten und π für zwei oder drei steht, einschließlich iso-Propanol, bei Normaldruck und im Bereich von -20° C bis +600C 5 bis 120 Minuten lang behandelt, wobei der Gesamt-Wassergehalt während des Auf-Schlusses 0 bis 30 Gewichtsprozent, bezogen auf die
eingesetzte Lösungsmittelmenge, beträgt, und nach Abtrennen der Extraktionsmischung den Rückstand der Zellmasse mit Wasser wäscht.
Als mikrobielle Zellmassen werden am besten Mikroorganismen, die durch Züchtung auf Alkohol oder η-Paraffinen in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases erzeugt sind, verwendet.
Beispiele für solche Mikroorganismen sind Methanol verwertende Bakterien der Gattung Methylomonas, z. B. Methylomonas clara ATCC 31 226, Hefen wie Candida lipolytica ATCC 20 383, die durch Züchtung auf η-Paraffinen in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums erhalten werden können.
jo Pilztrockenmycelien können ebenfalls verwendet werden. Dieses Zellmaterial kann aus der Antibiotika-Gewinnung, beispielsweise aus Penicillinfermentationen, entnommen werden, nachdem das Antibiotikum extrahiert wurde.
Als Lösungsmittel der Formel I kommen Alkohole
wie Methanol, Äthanol, n-Propanol und iso-Propanol in Betracht. Am besten sind Methanol und Äthanol, insbesondere Methanol.
Außer den genannten Alkoholen eignen sich Glykole
to und ihre Monoäther der Formel I, namentlich Glykol und Monomethylglykol.
Ammoniak kann den genannten Lösungsmitteln gasförmig (NH3) oder als konzentrierte wäßrige Lösung (NH4OH) zugesetzt werden. Die Wahl erfolgt nach Wassergehalt des Zelltrockenmaterials sowie nach Menge und Wassergehalt des eingesetzten Lösungsmittels. NH4OH eignet sich bei Zellmassen mit geringem Feuchtigkeitsgehalt (0-15%), NH3 dagegen besser bei Zellmassen mit höherem Wassergehalt (10 -30%).
w Die Entfernung der Lipide hängt vom Gesamtwassergehalt, der in Gew.-% auf die verwendete Lösungsmittelmenge bezogen wird, und von der NH3-Konzentration in Gew.-%, bezogen auf das eingesetzte Lösungsmittel, ab.
Besonders gute Versuchsergebnisse lassen sich bei einem Zellenmasse/Lösungsmittel-Gewichtsverhältnis von 1 :3 bis 1 :6 bei Methanol und Äthanol, und 1 :8 bis 1 :12 bei Propanol, Glykol und den Monoglykoläthern erzielen. Die Ammoniakkonzentration, bezogen auf die
bo Lösungsmittelmenge, beträgt 1 -10 Gew.-%, am besten 1 —5%. Die Summe der Wassermengen, die herrühren aus Zellmasse, Lösungsmittel und gegebenenfalls aus wäßrigem Ammoniak, betragen 0 — 30 Gew.-%, besser 0 — 20%, insbesondere 0—10 Gew.-%, bezogen auf die
t>5 eingesetzte Lösungsmittelmenge.
Beim Arbeiten im technischen Maßstab kann auf eine Trocknung der Zellen nach der Fermentation bis auf einen geringen Restwassergehalt von 4% oder niedri-
ger verzichtet werden. Es genügt, die Zellmasse auf ein solches Zelltrockengewicht zu bringen, daß nach Zusatz der benötigten Lösungsmiuelmenge der Gesamtwassergehalt im optimalen Bereich liegt; gegebenenfalls wird man dem Lösungsmittel gasförmiges NH3 zusetzen.
Das Lösen der Fette aus den mikrobiellen Zellmassen wird so durchgeführt, daß das Zellmaterial im Lösungsmittel suspendiert und NH3 eingeleitet oder NH4OH zugegeben wird. Zweckmäßig ist das Durchmisehen der Suspension durch Rühren. Die Behandlungstemperaturen liegen im Bereich von —20° bis ^6O0C, wobei ein Bereich von +5° bis +5O0C und insbesondere von +10° bis +30° C sehr gut ist. Die Behandlungsdauer beträgt 5 bis 120 Minuten und liegt am besten bei 25—35 Minuten. Die Behandlung wird bei Normaldruck durchgeführt
Nach Beendigung der Lösungsmittel/Ammoniak-Behandlung wird das erhaltene Protein nach beliebigen Verfahren wie Zentrifugieren, Filtration und Sedimentation vom Lösungsmittel getrennt
Am besten ist die Filtration. Das erhaltene feste Zellmaterial kann zur möglichst vollständigen Entfernung der Lipide mit einem der genannten organischen Lösungsmittel nochmals behandelt werden. Der Rückstand kann zur Entfernung von Lösungsmittelresten und Ammoniak getrocknet werden. Zweckmäßig wird dies unter vermindertem Druck, vorzugsweise 80—150 Torr, und erhöhter Temperatur, am besten 40°-50° C, durchgeführt. Das so entfettete und getrocknete Produkt ist geruchlos.
Die nach dem vorstehend genannten Verfahren vom festen Zellmaterial abgetrennte flüssige Phase enthält Ammoniak und gelöste Lipide. Das eingesetzte Lösungsmittel kann durch Vakuumdestillation von den Fetten abgetrennt und wieder eingesetzt werden.
Anschließend werden die entfetteten und gegebenenfalls getrockneten Zellmassen in Wasser aufgenommen. Günstig sind Wassermengen, die zur Zellmasse im Gew.-Verhältnis 1:1 bis 1 :30, insbesondere 1:5 bis 1:15, stehen. Die Wassermenge wird mindestens so bemessen, daß ein Rühren der Suspension möglich ist.
Der pH-Wert während der Wasserbehandlung soll im Bereich von 5 — 8,5, am besten 6 — 7,5, liegen und wird gegebenenfalls auf diesen Bereich eingestellt. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn nicht oder nicht vollständig getrocknete Zellmassen aus der ersten Stufe verwendet werden, die dann auch noch Restmengen an Ammoniak enthalten, was zu einem zu hohen pH-Wert führen kann.
Zur besseren Flockulierung der Zellmasse wird dem Wasser der zweiten Stufe bis zu 20 Gew.-%, am besten 5 — 15 Gew.-%, eines niederen Alkohols wie Äthanol, Methanol, am besten Methanol, zugesetzt.
Diese Extraktion der Nucleinsäuren, Salze, Polysaccharide und wasserlöslichen Sekundärmetabolite mit Wasser wird im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 30°-95° C bei Normaldruck durchgeführt. Gut sind Temperaturen von 40° —70° C, besonders gut 50° -60° C. Die Extraktionsdauer kann je nach Extraktionstemperatur und Wassermenge 5 — 120 Minuten betragen, gute Ergebnisse erzielt man mit 25-45 minütiger Extraktionszeit. Zur Trennung fester und flüssiger Bestandteile wird die Suspension, am besten bei Temperaturen von 10° - 30° C, zentrifugiert. Andere geeignete Trennverfahren sind Sedimentation und Filtration.
Die feste Phase wird nach gängigen Verfahren wie Gefrier-, Vakuum- oder Sprühtrocknung von Flüssigkeitsresten befreit. Das Produkt besitzt angenehme Geruchseigenschaften, eine hellere Farbe als das Ausgangsmaterial und ein besonders gutes Wasserbin-■> devermögen. Durch die Entfernung der Lipide und Nucleinsäuren eignet es sich besonders zur Herstellung von Nahrungs- und Futtermitteln.
So sind bei dem Produkt gemäß der Erfindung die Lipide bis auf einen Restgehalt von 0,5 bis 3,5 Gew.-%,
κι die Nucleinsäuren bis auf einen Restgehalt von 0,5—4,5 Gew.-%, entfernt.
Das Verfahren gemäß der Erfindung vermeidet die Nachteile der bekannten Verfahren wie Lösungsmittelbehandlung oder alkalischer Aufschluß. Chlorierte Kohlenwasserstoffe werden nicht benötigt. Die Entfettung mit Ammoniak/Alkohol-Gemischen ist, insbesondere bei Bakterien, wesentlich vollständiger als bei Behandlung der Zellmasse mit Alkohol/Wasser-Gemischen. Temperatur- und pH-Bereiche, die den Funktionswert des Produktes herabsetzen, werden vermieden. Der Energieaufwand ist geringer als bei den alkalischen Aufschlußverfahren. Die Proteinanreicherung gelingt ohne das Anfallen großer Mengen von Neutralisationssalzen.
Die vom festen Zellmaterial abgetrennte wäßrige Phase enthält neben anderen wasserlöslichen Bestandteilen die Nucleinsäuren, die nach bekannten Verfahren, z. B. durch Ausfällen in sauren Medien, Ultrafiltration, Dialyse oder Enzymangriff, gewonnen werden können.
μ Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Methylomonas clara ATCC 31 226 wurde in einer
Jr> Nährlösung, enthaltend Methanol als einzige Kohlenstoffquelle, Ammoniak als einzige Stickstoffquelle, Phosphat, Eisen-, Magnesium-Salze und andere übliche Spurenelemente unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Die dabei erzeugte Bakterienzellmasse wurde von der Lösung abgetrennt und der Sprühtrocknung unterworfen.
100 g dieser Zellmasse wurden mit 300 g Methanol versetzt Unter Rühren der Suspension wurden 10 g NH3-GaS eingeleitet und gelöst. Durch Kühlen wurde
4r> die Temperatur während des Einleitens auf 25° -35° C gehalten. Das Gemisch aus Methanol, Ammoniak und Zellmasse wurde 30 Minuten bei 20°C gerührt.
Zur Trennung der festen und flüssigen Phase wurde filtriert und der feste Rückstand einmal mit 300 ml
r'(> Methanol gewaschen. Nach erneuter Filtration wurden beide Filtrate vereinigt. Diese braune Lösung enthielt die Lipide der eingesetzten Ausgangssubstanz. Methanol und Ammoniak wurden durch Vakuumdestillation (100 Torr, 40°C) entfernt. Der Rückstand, der 9,5
Ti Gew.-% des eingesetzten Zellenmaterials betrug, war eine dunkelbraune, übelriechende Paste, die aus freien Fettsäuren, Glyceriden, Phospholipiden und Sekundärmetaboliten bestand.
Der bei der Filtration erhaltene feste Rückstand der
ω) extrahierten Zellmasse wurde im Vakuum (100 Torr) bei 400C 5 Stunden getrocknet. Es konnten so 90 g entfettete Zellmasse erhalten werden, die geruchlos war und eine hellere Farbe als das Ausgangsmaterial besaß.
Zur Verminderung des Nucleinsäuregehaltes wurde
h5 diese Zellmasse in 900 ml Wasser suspendiert Der pH-Wert der durch Rühren homogenisierten Suspension betrug 6,9.
Nach Erhöhung der Temperatur auf 55° C wurde noch
20 Minuten weitergerührt, auf 30°C abgekühlt und durch Zentrifugieren in feste und flüssige Phase getrennt. Das erhaltene Sediment wurde erneut mit 900 ml Wasser vermischt und 10 Minuten bei 20° C gerührt. Danach wurde erneut zentrifugiert und das Sediment unter vermindertem Druck getrocknet.
Die Ausbeute betrug 65 g. Der Nucleinsäuregehalt war von ursprünglich 11,2% auf 1,5% gesunken. Das Produkt war in trockenem Zustand geruchlos, mit Wasser befeuchtet besaß es einen sympathischen ι ο Geruch.
Das Ergebnis dieses und der weiteren Beispiele sind in den nachfolgenden Tabellen Ia und Ib zusammengefaßt.
Beispiel 2 '5
Als Ausgangsmaterial diente die gleiche Bakterienzellmasse wie in Beispiel 1 verwendet. Sie wurde den gleichen Verfahrensschritten und Bedingungen unterworfen, doch wurden statt gasförmigem NH3 30 ml konzentriertes NH4OH (33%ig) als Reagenz verwendet.
Beispiel 3
Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren, jedoch wurden 60 ml konz. NH4OH (33%ig) eingesetzt.
Beispiel 4
Bei einer Verfahrensweise wie in Beispiel 2 wurde statt Methanol Äthanol als Lösungsmittel verwendet.
Beispiel 5
Bei sonst gleicher Verfahrensweise wie in Beispiel 3 wurde statt Methanol Glykolmonomethyläther als Lösungsmittel verwendet.
Hefezellmasse wurde von der Nährlösung abgetrennt und getrocknet.
100 g der trockenen Hefezellmasse wurden bei Raumtemperatur unter Normaldruck in 300 g Methanol suspendiert und dieser Mischung im Verlauf von 15 Minuten 10 g NH3-Gas zugeführt. Dabei wurde die Temperatur der Suspension durch Kühlung auf 15° C gehalten. Nach Einleiten des Gases wurde noch 20 Minuten bei 22° C weitergerüiirt und anschließend über eine Saugfritte filtriert Der Filterkuchen wurde einmal mit 300 ml Methanol auf der Fritte durchmischt und anschließend abgesaugt. Die beiden Filtrate wurden vereinigt. Die Lösung war gelb und enthielt die Lipide des eingesetzten Zellmaterials. Methanol und NH3 wurden bei vermindertem Druck (14 Torr) entfernt.
Der nach der zweiten Filtration verbliebene Rückstand, der aus den zerstörten und entfetteten Zellen des Mikroorganismus bestand, wurde im Vakuumtrockenschrank bei 40° C (100 Torr) 5 Stunden getrocknet. Das so erhaltene Produkt hatte eine hellere Farbe als die anfangs verwendete Hefezelimasse und war geruchlos.
Zur Verminderung des Nucleinsäuregehaltes von ursprünglich 7,5 Gew.-%, bezogen auf das Ausgangsmaterial, wurden 100 g der entfetteten und getrockneten Hefe in einer Lösung aus 1 Liter destilliertem Wasser und 1000 ml Methanol suspendiert. Unter Rühren wurde die Mischung bei dem sich einstellenden pH-Wert von 6,8 für 15 Minuten auf 50° C gebracht und durch Zentrifugieren in ein Sediment, das das Hefeprotein enthielt, und in eine flüssige Phase, die löslich gemachte Nucleinsäure enthielt, getrennt Das Sediment wurde nach einer nochmaligen Wäsche bei Raumtemperatur der Gefriertrocknung unterworfen.
Der Nucleinsäuregehalt des getrockneten Materials war von ursprünglich 7,5 Gew.-% auf 0,4 Gew.-% gesunken.
Beispiel 6
Es wurde verfahren wie in Beispiel 2. Statt Methanol wurde i-Propanol als Lösungsmittel eingesetzt.
Beispiel 7
Als Ausgangsmaterial wurde eine Zellmasse aus Methylomonas clara wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. 100 g des sprühgetrockneten Produkts wurden wie in Beispiel 1 beschrieben aufgeschlossen und entfettet (15 g NH3). Jedoch wurde auf die vollständige Trocknung des Rückstandes verzichtet. Der gründlich abgesaugte Filterkuchen mit einem Feststoffgehalt von 85% wurde in 900 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert stellte sich auf 8,9 ein, bedingt durch den in der feuchten Biomasse verbliebenen Ammoniak.
Die Temperaturen der Suspension wurde unter Rühren auf 650C erhöht und nach 5 Minuten der pH-Wert durch Zugabe von HCl auf 7,2 eingestellt. Danach wurde noch 15 Minuten bei 65° C weitergerührt, dann auf 40° C abgekühlt und zentrifugiert Das erhaltene Sediment wurde getrocknet.
Beispiel 8
Candida lipolytica ATCC 20 383 wurde auf n-Paraffinen in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert. Die
40
Beispiel 9
Bei einem Verfahren wie in Beispiel 8 wurde statt Methanol Äthanol und statt 10 g NH3-gasförmig 60 ml NH4OH (33%ig) eingesetzt.
45 Beispiel 10
Penicillium chrysogenum ATCC 10 238 wurde in einer Nährlösung, enthaltend Lactose, Maisquellwasser, Phosphat, Carbonat und Magnesiumsulfat nach üblichen Methoden aerob gezüchtet. Nach Abtrennung des produzierten Penicillins verblieb das Mycel, das getrocknet als Ausgangsmaterial diente.
Das Verfahren wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt Statt NH3 wurde NH4OH 33%ig eingesetzt. Das entfettete Trockenmycel wurde bei 30° C mit Wasser gewaschen.
Beispiel 11
Als Ausgangsmaterial diente die gleiche Zellmasse
wie in Beispiel 10 beschrieben. Statt Methanol wurde Äthanol verwendet. Die Temperatur während der Wasserextraktion wurde auf 85° C erhöht und 15 Minuten dabei gehalten.
In der folgenden Tabelle III sind die Ergebnisse der Beispiele 1-11 aufgeführt.
Tabelle la lOOg eingesetzte Zcllmassc I eil Nucleinsäurc Lösungsmittel NHi (g) bzw.
linlfernung der Lipide Art (Gew.-%) ((jcw.-Vo) 300 g NH4OlI
Bd- 7 11,2 (33%ig, ml)
spiel Mcthylomonas 7 11,2 Methanol NH., IO
Methylomonas 7 11,2 Methanol NH4OH 30
1 Methylomonas 7 11,2 Methanol NH4OH 60
2 Mcthylomonas 7 11,2 Äthanol NH4OH 30
3 Methylomonas Glykolmono- NH4OH 60
4 7 11,2 methyläthcr
5 Mcthylomonas 9,6 15,4 i-Propanol NH4OH 30
Mcthylomonas 8,2 7,5 Methanol NH3 15
6 Candida lipolytica 8,2 7,5 Methanol NH3 10
7 Candida lipolytica 3,5 2,6 Äthanol NH4OH 60
S Trockcnmyce! 3,5 2,6 Methanol NH4OH 30
9 Trockcnmyccl Äthanol NH4OH 30
10
11
Tabelle Ib
Hntlcrnung der Nucleinsäuren
Beispiel Waschwasscr PlI Temp. Erhaltene Zellmasse Nuclcinsäure
Menge (0C) Menge Fette (üew.-%)
(I) 6,9 55 (P) (Gcw.-%) 1,5
1 0,9 6,9 60 68 0,8 1,2
2 0,9 7,0 65 67 1,3 U
3 0,9 6,9 50 63 2,0 1,5
4 0,9 7,1 55 67 2,2 2,3
5 0,9 7,0 60 63 2,8 4,0
6 0,9 7,2 65 64 3,4 1,4
7 0,9 6,8 50 62 1,2 0,4
8 0,8 6,5 45 68 1,4 0,7
9 0,8 6,5 30 67 1,8 0,5
K) 0,9 6,5 85 78 U 0,8
11 0.9 79 1,3

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Verminderung des Lipid- und Nucleinsäuregehaltes In mikrobiellen Zellmassen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellmassen mit einer Extraktionsmischung aus Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd und einem organischen Lösungsmittel der allgemeinen Formell
massen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Zellmassen mit einer Extraktionsmischung aus Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd und einem organischen Lösungsmittel der allgemeinen Formel 1
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