Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania mikro¬ biologicznych mas komórkowych od lipidów i kwasu nukleinowego, w nich zawartych. Kazda komórka zawiera weglowodany, proteiny, lipidy i kwasy nukleinowe. Na mozliwosc stosowania mikrobiologicznych mas komórko¬ wych jako srodków spozywczych i pasz wplywa ujemnie zawartosc kwasów nukleinowych i lipidów.Zawartosc kwasu nukleinowego budzi watpliwosci, po¬ niewaz prowadzi ona do stanów patologicznych (dna, kamienie moczowe). Lipidy ograniczaja zdolnosc sklado¬ wania wskutek jelczenia i pogarszaja smak.Zadaniem niniejszego wynalazku jest obnizenie zawar¬ tosci lipidów i kwasu nukleinowego w mikrobiologicznych masach komórkowych. Wedlug znanych sposobów lipidy albo rozpuszcza sie ze sciany komórki i blony za pomoca rozpuszczalników organicznych albo poddaje sie 2mydle- niu przez obróbke wodnymi roztworami alkaliów.Znany sposób wylugowywania lipidów z mikroorganiz¬ mów polega na stosowaniu mieszanin metanolu i chloro¬ formu. Sposób ten jest skomplikowany i moze prowadzic do produktów toksycznych. Zastosowanie mieszanin alko¬ holu i wody, wedlug opisu patentowego RFN DOS nr 2405593 albo DOS nr21 37038,nienadajesie do ekstrakcji lipidów z bakterii.W innych znanych sposobach zubozania mikrobiologicz¬ nych mas komórkowych w kwas nukleinowy i lipidy sto¬ suje sie alkaliczne roztwarzanie w podwyzszonej tempera¬ turze. Wada jest przy tym uwalnianie powstalych przy hydrolizie wolnych kwasów tluszczowych, które oddzielaja sie razem z proteina. Oprócz tego czesc zawartych w pro- 10 1S 25 teinie pierwotnych aminokwasów, np. lizyna, przechodzi w stan, nie dajacy sie zuzytkowac przez organizm.Obecnie opracowano sposób zmniejszania zawartosci lipidów i kwasu nukleinowego w mikrobiologicznych ma¬ sach komórkowych, który polega na tym, ze masy komór¬ kowe poddaje sie obróbce za pomoca mieszaniny ekstrak¬ cyjnej, zlozonej z amoniaku albo wodorotlenku amonu i rozpuszczalnika organicznego o ogólnym wzorze Rt- -(CH2)n-OR3, w którym albo Rx i R3 oznaczaja wodór i n oznacza liczbe jeden, dwa albo trzy, albo w którym Rt oznacza grupe hydroksylowa i R3 oznacza wodór, metyl albo etyl i n oznacza liczbe dwa albo trzy, i po oddzieleniu mieszaniny ekstrakcyjnej pozostalosc masy komórkowej przemywa sie woda, oddziela sie faze wodna, i ewentualnie po ekstrakcji za pomoca rozpuszczalnika organicznego o ogólnym wzorze Rx-(CH2)n-OR2, suszy.Jako mikrobiologiczne masy komórkowe stosuje sie ko¬ rzystnie mikroorganizmy, które sa wytworzone np. przez hodowanie na alkoholu albo n-parafinach w obecnosci wodnej pozywki i gazu, zawierajacego wolny tlen. Ko¬ rzystnie jako mikroorganizmy stosuje sie bakterie, drozdze i grzyby.Przyklady takich mikroorganizmów stanowia bakterie, zuzywajace metanol, rodzaju Methylomonas, np. Methy- lomonas clarus ATCC 31 226, albo drozdze jak Candida lipolytica ATCC 20 383, które mozna otrzymac przez hodowanie na n-parafinach w obecnosci wodnej pozywki.Mozna równiez stosowac suche komórki grzybów. Ten material komórkowy mozna pobrac z procesu wytwarzania 107 949107 949 3 antybiotyków np. z procesów fermentacji penicyliny, po wyekstrahowaniu antybiotyku.Jako rozpuszczalniki o wzorze R±- (CH3)n-OR2 mozna stosowac alkohole, takie jak metanol, etanol, n-propanol i izopropanol. Korzystne sa metanol i etanol, zwlaszcza metanol.Oprócz wymienionych alkoholi nadaja sie glikole i ich monoetery o wzorze Rx-(CH2)n-OR2, mianowicie glikol i glikol monometylowy.Amoniak mozna dodawac do wymienionych rozpusz¬ czalników w postaci gazowej (NH3) albo jako stezony roztwór wodny (NH4OH). Wybór przeprowadza sie za¬ leznie od zawartosci wody w materiale suchych komórek oraz od ilosci i zawartosci wody w uzytym rozpuszczalniku.NH4OH jest bardziej przydatny w przypadku mas komór¬ kowych o niewielkiej zawartosci wilgoci (0—15%), na¬ tomiast NH3 jest lepszy w przypadku mas komórkowych o wyzszej zawartosci wody (10—30%).Zawartosc lipidów, która usuwa sie przez ekstrakcje za pomoca amoniaku i rozpuszczalnika, zalezy od ogólnej zawartosci wody, która odnosi sie w % wagowych do zastosowanej ilosci rozpuszczalnika, i od stezenia NH3 w % wagowych, w odniesieniu do zastosowanego rozpusz¬ czalnika.Szczególnie dobre wyniki doswiadczen uzyskano przy stosunku wagowym masy komórkowej i rozpuszczalnika, wynoszacym 1:3 — 1:6 w przypadku metanolu i etanolu, i 1:8 — 1:12 w przypadku propanolu, glikolu i eterów mo- noglikolowych. Stezenie amoniaku, w odniesieniu do ilosci rozpuszczalnika, wynosilo 1—10% wagowych, ko¬ rzystnie 2—8%, a zwlaszcza 3—5%. Suma ilosci wody, które pochodza z masy komórkowej, rozpuszczalnika i ewentualnie z wodnego roztworu amoniaku, wynosila 0—30% wagowych, korzystnie 0—20%, zwlaszcza 0—10% wagowych, w odniesieniu do uzytej ilosci rozpuszczalnika.Przy prowadzeniu procesu w skali technicznej mozna zrezygnowac z suszenia komórek po fermentacji do nie¬ wielkiej resztkowej zawartosci wody 4% albo mniejszej.Wystarczy doprowadzic mase komórkowa do takiego cie¬ zaru suchych komórek, ze po dodaniu potrzebnej ilosci rozpuszczalnika ogólna zawartosc wody miesci sie w opty¬ malnym zakresie. Mozna ewentualnie dodac do rozpusz¬ czalnika gazowy NH3.Rozpuszczanie tluszczów z mikrobiologicznych mas komórkowych przeprowadza sie w ten sposób, ze material komórkowy przeprowadza sie w zawiesine w rozpuszczal¬ niku organicznym o wzorze Rx- (CH2)n-OR2 i wprowadza NH3 albo dodaje NH4OH. Celowe jest wymieszanie za¬ wiesiny przez mieszanie/Temperatura obróbki wynosi na ogól od —20° do +60°C, przy czym korzystny jest zakres +5° do +50°C a zwlaszcza +10° do +30°C. Czas trwa¬ nia obróbki wynosi 5—120 minut, a korzystnie 25—35 minut. Obróbke przeprowadza sie na ogól pod cisnieniem normalnym. Po zakonczeniu obróbki za pomoca rozpusz¬ czalnika i amoniaku otrzymany material komórkowy (pro¬ teine) oddziela sieod rozpuszczalnika dowolnymi metodami, takimi jak wirowanie, saczenie i sedymentacja.Korzystne jest stosowanie saczenia. Otrzymany staly material komórkowy w celu calkowitego usuniecia lipidów mozna traktowac ponownie jednym z wymienionych roz¬ puszczalników organicznych. Pozostalosc mozna wysuszyc w celu usuniecia resztek rozpuszczalnika i amoniaku.Celowo przeprowadza sie to pod zmniejszonym cisnieniem, korzystnie 80-^150 torów, i w podwyzszonej temperaturze, 4 korzystnie 40°—50°C. Odtluszczony w ten sposób i wy¬ suszony produkt jest bezzapachowy.Oddzielona w wyzej wymieniony sposób od stalego materialu komórkowego faza ciekla zawiera amoniak i roz- 5 puszczone lipidy. Zastosowany rozpuszczalnik mozna oddzielic od tluszczów przez destylacje pod zmniejszonym cisnieniem i zastosowac ponownie. Nastepnie odtluszczone i ewentualnie wysuszone masy komórkowe pobiera sie w wodzie. Korzystne sa ilosci wody, które wystepuja 10 w stosunku wagowym do masy komórkowej 1:1 — 1:3, w szczególnosci 1:5 — 1:15. Ilosc wody odmierza sie co najmniej tak, aby bylo mozliwe mieszanie zawiesiny.Wartosc pH podczas obróbki woda powinno wynosic 5—8,5, korzystnie 6—7,5, i zostaje ewentualnie ustalona 15 w tym zakresie. Jest to potrzebne w szczególnosci wtenczas, jesli stosuje sie niewysuszone albo niecalkowicie wysuszone masy komórkowe z pierwszego stopnia, które potem za¬ wieraja jeszcze równiez resztkowe ilosci amoniaku, co moze prowadzic do zbyt wysokiej wartosci pH. Te ekstrakcje 20 kwasów nukleinowych, soli, wielocukrów i rozpuszczalnych w wodzie wtórnych metabolitów za pomoca wody prze¬ prowadza sie na ogól w temperaturze 40°—70 °C, szcze¬ gólnie korzystnie 50°—60 °C. Czas trwania ekstrakcji moze wynosic zaleznie od temperatury ekstrakcji i ilosci wody 25 5—120 minut, dobre wyniki osiaga sie, stosujac czas eks¬ trakcji 25—45 minut.W celu rozdzielenia skladników stalych i cieklych od¬ wirowujesiezawiesine,korzystniewtemperaturze 10—30°C.Inne odpowiednie sposoby rozdzielania stanowia sedy- 30 mentacja i saczenie.W celu prostszego oddzielenia masy komórkowej dodaje sie korzystnie do wody drugiego stopnia do 20% wagowych, korzystnie 5—15% wagowych, nizszego alkoholu, takiego jak etanol, metanol, korzystnie metanolu. 35 Faze stala uwalnia sie od cieczy znanymi sposobami, jak suszenie przez zamrazanie, pod zmniejszonym cisnieniem albo rozpryskowe. Produkt ma przyjemne wlasciwosci zapachowe, jasniejsza barwe niz material wyjsciowy i szcze¬ gólnie dobra zdolnosc wiazania wody. W wyniku usuniecia 40 lipidów i kwasów nukleinowych nadaje sie szczególnie do wytwarzania srodków spozywczych i paszowych.W produkcie wedlug wynalazku lipidy sa usuniete do zawartosci resztkowej 0,5—3,5% wagowych, kwasy nu¬ kleinowe do zawartosci resztkowej 0,5—4,5% wagowych. 45 Sposób wedlug wynalazku unika wad znanych sposobów, jak obróbka rozpuszczalnikowa albo roztwarzanie alkalicz¬ ne. Nie stosuje sie chlorowanych weglowodorów. Odtlusz¬ czanie za pomoca mieszanin amoniaku i rozpuszczalnika, jest, zwlaszcza w przypadku bakterii, znacznie pelniejsze niz w przypadku obróbki masy komórkowej za pomoca mieszanin rozpuszczalników i wody. Unika sie skrajnych zakresów temperatury i pH, które obnizaja przydatnosc produktu. Naklad energii jest mniejszy, niz w przypadku znanych alkalicznych sposobów roztwarzania. Wzbogaca¬ nie w proteine zachodzi bez wystepowania duzych ilosci soli zobojetniajacych.Faza wodna, oddzielona od stalego materialu komórko¬ wego obok innych skladników rozpuszczalnych w wodzie 60 zawiera kwasy nukleinowe, które mozna odzyskac w znany sposób, np. przez wytracanie w kwasnych srodowiskach,, ultrasaczenie, dialize albo obróbke enzymatyczna.Wynalazek wyjasniaja nastepujace przyklady.Przyklad I. Methylomonas clarus ATCC 31 226- 85 hodowano w roztworze odzywczym, zawierajacym metanol\ 5 jako jedyne zródlo wegla, amoniak jako jedyne zródlo azotu, fosforan, sole zelaza, magnezu i inne zwykle pier¬ wiastki sladowe w warunkach aerobowych. Wytworzona przy tym bakteryjna mase komórkowa oddzielono od roz¬ tworu i poddano suszeniu rozpryskowemu. 100 g tej masy komórkowej zadano 300 g metanolu.Mieszajac zawiesine wprowadzono 10 g gazowego NH3 i rozpuszczono. Przez oziebienie utrzymywano tempera¬ ture 25°—35 °C podczas wprowadzania. Mieszanine, zlozona z metanolu, amoniaku i masy komórkowej, mie¬ szano w ciagu 30 minut w temperaturze 20°C.W celu oddzielenia fazy stalej i cieklej saczono i stala pozostalosc przemyto jeden raz za pomoca 300 mlmetanolu.Po ponownym saczeniu polaczono obydwa przesacze. Ten brunatny roztwór zawieral lipidy zastosowanej substancji wyjsciowej. Metanol i amoniak usunieto przez destylacje pod zmniejszonym cisnieniem (100 torów, 40 °C). Po¬ zostalosc, która wynosila 9,5% wagowych uzytego materialu komórkowego, stanowila ciemnobrunatna, cuchnaca pasta, skladajaca sie z wolnych kwasów tluszczowych, glicerydów, fosfolipidów i Wtórnych metabolitów.Otrzymana przy saczeniu stala pozostalosc ekstrahowanej masy komórkowej wysuszono pod zmniejszonym cisnie¬ niem (100 torCEWw teiupcialurze 4&PG w ciagu 5 godzin.Otrzymano w ten sposób 90 g odtluszczonej masy komór¬ kowej, która byla bezzapachowa i miala jasniejsza barwe niz material wyjsciowy.W celu zmniejszenia zawartosci kwasu nukleinowego przeprowadzono te mase komórkowa w zawiesine w 900 ml wody. Wartosc pH zawiesiny homogenizowanej przez mieszanie wynosila 6,9. Po podwyzszeniu temperatury do 55 °C zawiesine mieszano jeszcze dalej w ciagu 20 minut, Oziebiono do temperatury 30 °C i przez odwirowanie roz¬ dzielono na faze stala i ciekla. Otrzymany osad ponownie wymieszano z 900 ml wody i mieszano w ciagu 10 minut w temperaturze 20°C. Nastepnie ponownie odwirowano i osad wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem. Wydaj¬ nosc wynosila 65 g. Zawartosc kwasu nukleinowego spadla z pierwotnych 11,2% do 1,5%. Produkt w stanie suchym byl bezzapachowy, zwilzony woda mial sympatyczny za¬ pach.Wyniki tego i nastepnych przykladów sa zestawione w tablicach la i Ib.Przyklad II. Jako material wyjsciowy stosowano taka sama bakteryjna mase komórkowa, jak w przykladzie I. Poddano ja takim samym etapom procesu i warunkom, jednakze zamiast gazowego NH3 zastosowano 30 ml stezo¬ nego NH4OH 33%-go jako reagenta.Przyklad III. Postepowano, jak w przykladzie II, jednakze zastosowano 60 ml stezonego NH4OH (33%-go).Przyklad IV. Przy sposobiepostepowania, jakw przy¬ kladzie II, zastosowano zamiast metanolu etanol jako rozpuszczalnik.Przyklad V. Przy tak:m samym sposobie postepo¬ wania,jak w przykladzieIII, zastosowano zamiast metanolu eter glikolomonometylowy jako rozpuszczalnik.Przyklad VI. Postepowano, jak w przykladzie II.Zamiast metanolu zastosowano i-propanol jako rozpusz¬ czalnik.Przyklad VII. Jako material wyjsciowy zastosowano mase komórkowa z Methylomonas clarus, jak opisano w przykladzie I. 100 g wysuszonego rozpryskowo produktu w sposób, opisany w przykladzie I, poddano roztwarzaniu i odtluszczaniu (15 g NH3). Zrezygnowano jednak z calko¬ witego wysuszenia pozostalosci. Dokladnie odsaczony 7 949 6 placek filtracyjny o zawartosci substancji stalej 85% prze¬ prowadzono w zawiesine w 900 ml wody. Wartosc pH ustalila sie na 8,9, uwarunkowana jednak przez pozostaly w wilgotnej biomasie amoniak. Temperature zawiesiny, 5 mieszajac, podwyzszono do 65°C i po uplywie 5 minut ustalono wartosc pH = 7,2 przez dodanie HC1. Nastepnie mieszano jeszcze dalej w ciagu 15 minut w temperaturze 65 °C, potem oziebiono do temperatury 40 °C i odwirowa¬ no. Otrzymany osad wysuszono. 10 Przyklad VIII. Zuzywajacy weglowodory szczep drozdzy Candida lipolytica ATCC20.383 kultywowano na n-parafinach w obecnosci wodnej pozywki i gazu zawieraja¬ cego tlen. Mase komórek drozdzowych oddzielono od roz¬ tworu odzywczego i wysuszono. 15 100 g suchej masy drozdzowej przeprowadzono w za¬ wiesine w temperaturze pokojowej pod normalnym cisnie¬ niem w 300 g metanolu i do tej mieszaniny doprowadzano w ciagu 15 minut 10 g gazowego NH3. Utrzymywano przy tym temperature zawiesiny przez chlodzenie na poziomie 20 ' 15°C. Po wprowadzeniu gazu mieszano dalej jeszczew ciagu 20 minut w temperaturze 22 C i nastepnie saczono przez prózniowy saczek szklisty. Placek filtracyjny wymieszano jeden raz na saczku prózniowym z 300 ml metanolu i na¬ stepnie odsaczono. Obydwa przesacze polaczono. Roztwór 25 bylzólty i zawierallipidy z uzytego materialukomórkowego.Metanol i NH3 usunieto pod zmniejszonym cisnieniem (14 torów). Pozostala po drugim saczeniu pozostalosc, która skladala sie z rozlozonych i odtluszczonych komórek mikroorganizmu, wysuszono w suszarce prózniowej w tem- 30 peraturze 40°C (100 torów) w ciagu 5 godzin. Otrzymany w ten sposób produkt nral jasniejsza barwe niz uzyta po¬ czatkowo drozdzowa masa komórkowa i byl bezzapachowy, W celu zmniejszenia zawartosci kwasu nukleinowego z pierwotnych 7,5% wagowych, w odniesieniu do ma- 35 terialu wyjsciowego, przeprowadzono 100 g odtluszczonych i wysuszonych drozdzy w zawiesine w roztworze, zlozonym z 1 litra wody destylowanej i 1000 ml metanolu. Mieszajac doprowadzono mieszanine przy ustalajacej sie wartosci pH = 6,8 w ciagu 15 minut do temperatury 50 C i przez 40 odwirowanie rozdzielono na osad, który zawieral proteine drozdzowa, i na faze ciekla, która zawierala kwas nukleino¬ wy, przeprowadzony w postac rozpuszczalna. Osad po ponownym przemywaniu w temperaturze pokojowej pod¬ dano suszeniu przez zamrazanie. Zawartosc kwasu nukleino- 45 wego w wysuszonym materiale obnizyla sie z pierwotnych 7,5% wagowych do 0,4% wagowych.Przyklad IX. Postepujac, jak w przykladzie VIII, zastosowano zamiast metanolu etanol i zemiast 10 g gazo¬ wego NH3 60 ml NH4OH (33%-go). ao Przyklad X. Penicllium chrysogenum ATCC 10.238 hodowano w roztworze odzywczym, zawierajacym laktoze, namok kukurydziany, fosforan, weglan i siarczan magnezu w znany sposób aerobowo. Po oddzieleniu wy¬ produkowanej penicyliny pozostala grzybnia, która po 55 wysuszeniu sluzyla jako material wyjsciowy.Proces przeprowadzono w sposób, opisany w przy¬ kladzie VIII. Zamiast NH zastosowano 33%-wy NH3OH.Odtluszczona sucha grzybnie przemyto woda w tempera¬ turze 30°C. 60 Przyklad XI. Jako material wyjsciowy stosowano taka sama mase komórkowa, jak opisano w przykladzie X.Zamiast metanolu zastosowano etancl. Temperature pod¬ czas ekstrakcji woda podwyzszono do 85°C i utrzymywano w ciagu 15 minut. 65 W tablicach la i Ib podano wyniki z przykladów I-XI.107 949 Tablica la Usuwanie lipidów Przyklad I II III IV V VI VII VIII IX X XI 100 g uzytej masy komórkowej Rodzaj Methylomonas ,, , a a jj a Candida lipolytica Candida lipolytica Sucha grzybnia Sucha grzybnia Tluszcz % wagowe 7 7 7 7 7 7 9,6 8,2 8,2 3,5 3,5 Kwas nukleinowy 11,2 11,2 11,2 11,2 11,2 11,2 15,4 7,5 7,5 2,6 2,6 Rozpuszczalnik 300 g metanol metanol metanol etanol eter glikolmonometylowy i-propanol metanol metanol etanol metanol etanol NH3(g)lubNH4OH (33%-wy, ml) NH3 10 NH4OH 30 NH4OH 60 NH4OH 30 NH4OH 60 NH4OH 30 NH, 15 NH, 10 NH4OH 60 NH4OH 30 NH4OH 30 Tablica Ib Usuwanie kwasów nukleinowych Przyklad I II III IV V VI VII VIII IX X XI Woda myjaca Ilosc (Htr) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 0,9 0,9 PH 6,9 6,9 7,0 6,9 7,1 7,0 7,2 6,8 6,5 6,5 6,5 Temperatura (°C) 55 60 65 50 55 60 65 50 45 30 85 Otrzymana masa komórkowa Ilosc (g) 68 67 63 67 63 64 62 68 67 78 79 Tluszcze % wagowe 0,8 1,3 2,0 2,2 2,8 3,4 1,2 1,4 1,8 1,1 1,3 Kwas nuklei¬ nowy % wago¬ we 1,5 1,2 1,1 1,5 2,3 4,0 1,4 0,4 0,7 0,5 0,8 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania mikrobiologicznych mas komórko¬ wych od lipidów i kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze masy komórkowe poddaje sie obróbce za pomoca mie¬ szaniny ekstrakcyjnej, zlozonej z amoniaku albo wodoro¬ tlenku amonu i rozpuszczalnika organicznego o ogólnym wzorze R1-(CH2)n-OR2, w którym albo Rx i R3 oznaczaja wodór i n oznacza liczbe jeden dwa albo trzy, albo R± oznacza grupe hydroksylowa i R2 oznacza wodór, metyl albo etyl i n oznacza liczbe dwa albo trzy, i po oddzieleniu mieszaniny ekstrakcyjnej pozostalosc masy komórkowej przemywa sie woda, oddziela faze wodna i, ewentualnie po ekstrakcji za pomoca rozpuszczalnika organicznego o ogól¬ nym wzorze R4-(CH2)n-OR2, suszy. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze obróbke 48 prowadzi sie przy ogólnej zawartosci wody 0—30% wago¬ wych, korzystnie 0—20% wagowych, w szczególnosci 0—10% wagowych, w odniesieniu do uzytej ilosci roz¬ puszczalnika. 3. Sposób wedlug zastrz. I, znamienny tym, ze obróbke 50 prowadzi sie przy zawartosci NH, 1—10% wagowych, korzystnie 2—8% wagowych, w szczególnosci 3—5% wa¬ gowych, w odniesieniu do uzytej ilosci rozpuszczalnika.LiZG Z^d 3, Z. 906/0400/80, Ti. 96+20 egz.Cena 45 zt PL