SU938746A3 - Способ получени алкалоидов метанзинола, метанацина и пропионата метанзинола - Google Patents

Description

Конидии собраны в цепочки, тогда, как  чеистые суспензии, полученные с поверхностей таких культур, наблюдаемые под микроскопом, содержат много выт нутых элипсоидальных (0,8-1,2 х X ,0-6,8 мм и элипсоидальных 0,81 ,2 X 1,0-2,0 мм7 тел, похожих на ар роспоры. Штамм хорошо растет в различных средах, причем вегетативный мицелий бесцветный, бледно-желтый в начальных стади х и светло-желтоватый до желтоватого цвета дубовой коры в последних стади х. Штамм дает растворимые пигменты от желтых до желтоватых тонов дубовой коры в различных таксономических средах, . Агар нитрата сахарозы. Рост буйный,. Субстратный мицелий ОТ цвета желтой дыни до цвета  нтар  Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует или он бледно-желтый, рыжевато-коричневый . Глюкозо-аспарагиновый агар. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета ноготков до желтого. Во душный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент - желтый. . Крахмальный агар. Рост средний. Субстратный мицелий цвета слоновой кости. Воздушный мице лий изобильней, цвета слоновой кости Растворимый пигмент отсутствует. Питательный агар. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до желтого. Воздушный мицелий скудный, белый.Рас воримый пигмент отсутствует. Агар с малатом кальци . Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до цвета пше ницы. Воздушный мицелий средний, бел го цвета до цвета слоновой кости.Рас воримый пигмент отсутствует. Дрожжевой агар с солодом. Рост средний. Субстратный мицелий от  нтарного до желтого. Воздушный мицелий средний, белый до цвета елоновой кости. Растворимый пигмент отсутствует . Агар с нитратом глицерина. Рост средний. Субстратный мицелий цвета слоновой кости, кореми  подобн образованным телам. Воздушный мицели средний, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Агар аспарагина с глицерином. Рост средний, субстратный мицелий цвета слоновой кости, кореми  подобна образованным телам. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Агар с овс нкой. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до желтого, кореми  подобна образованным телам. Воздушный мицелий скудный, белый до светло-желтого. Растворимый пигмент отсутствует. Экстракт пептонных дрожжей в крепком агаре. Рост средний. Субстратный мицелий желтый. Воздушный мицелий отсутствует . Растворимый пигмент желтый. Тирозиновый агар. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до цвета желтой дыни. Воздушный мицелий средний, от белого цвета до цвета слоновой кости. Растворимый пигмент - цвет верблюда, Физиологические характеристики. Растет при . Оптимальна  температура дл  роста 20-35 С. Желатину разжижает, крахмал гидролизует . Молоко пентонизирует, но не коагулирует . Казеин разлагает. Нитраты сжижает, Меланоидных пигментов не образует. Тирозин разлагает, Ксантин и гипоксантин не разлагает . Толерантность лизима положительна . Толерантность хлорида натри  - 2%, Очень хорошо усваивает ксилозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, хорошо усваивает арабинозу, галактозу, рамнозу , трегалозу, мелибиозу, маннитин, крахмал. Слабо усваивает лактозу, инозитин, сорбитин, глицерин. Окрашивание по Граму вегетативного мицели  штамма - положительное. Среда, употребл ема  дл  культивировани  штамма, способного производить метанзинол, метанацин или пропионат метанзинола может быть жидкой и твердой. В последнем случае она должна содержать питательную среду, которую штамм может утилизировать, хот  жидка  средд предпочтительна дл  высокопродуктивных процессов, и, как было найдено, среда  вл етс  мезоформой , тогда как обнаруженные п тна со .ответствовали галактозе и арабинозе. Среда содержит источники углерода и азота, которые штаммом № С-15003 могут ассимилироватьс  и дигестироват с , неорганический материал, следы питательной среды и т.д. В качестве источников углерода могут быть глюкоза , лактоза, сахароза, мальтоза, декстрин, крахмал, глицерин, маннитин сорбитин и т.д., жиры и масла (например , соевое масло, свиное сало, куриный жир и т.д.) и другие. Источниками азота могут быть, например, экстракт м са, экстракт крахмала, сухой крахмал , соева  мука, злаки, погруженные в жидкость, пептон, казеин, мука из сем н хлопка, меласса, мочевина, соли аммони  (например, сульфат, хлорид, нитрат, ацетат аммони  и т.д.) и другие. Среда может также содержать соли натри , кали , кальци , магни  и т.д соли железа, марганца, цинка, кобальта , никел  и т.д., соли фосфорной борной кислот и т.д., соли органических кислот, такие, как ацетаты и пропионаты . Среда может также содержать как добавки различные аминокислоты (например , глутаминовую, аспарагиновую кислоты, аланин, глицин, лизин, мети Ьнин, пролин, и т,п.) пептиды например , дипептиды, трипептиды и т.д.) витамины например, . никотиновую кислоту, Cj2, С,,Е и т.д.), нуклеиновые кислоты (например, пурин, пирамидин и их производные и т.д.). Дл  создани  определенной величины рН среды добавл ют органические или неорганические кислоты, и елочи, буферы и т.п. Растворимые количества масел, жиров, поверхностно-активных веществ и т.д. могут также добавл тьс  в качестве антивспенивателей. Культивирование провод т при стационарных , колебательных, погружных, аэробных и других услови х. Дл  высокопродуктивных процессов погружное аэробное культивирование  вл етс  предпочтительным. Культивирование зависит от условий и состава среды, штамма, способа культивировайи  и других факторов, причем предпоч тительно провод т инкубирование при 25-30 С с начальной величиной рН в области 7. В промежуточной стадии культивировани  желательна температура 23-30 С с начальным рН 6,. Так как врем  инкубировани  мен етс  в зависимости от упом нутых факторов, желательно продолжать инкубирование до тех пор, пока титр предлагаемого антибиотика не станет максимальным. При культивировании в услови х аэробного погружени  в жидкую среду необходимый интервал времени обычно составл ет 8-1 ч. Метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол получаетс  и аккумулируетс  в равнодействующем культивированном бульоне как внеклеточно, так и внутриклеточно. Ни одно из этих веществ не показывает  сную антибиотическую активность, поэтому они были обнаружены с помощью тонкослойной хроматографии. Ферментный бульон разлагаетс  в клетках.и фильтре с помощью фильтрации или центрифугировани  и фильтрат экстрагируют тем же объемом этилацетата. К клеткам добавл ют такое же количество 70 -ндго раствора ацетона в воде, как к фильтрату, и после перемешивани  в течение часа при суспензию фильтруют . Ацетон удал ют из фильтрата и водный фильтрат экстрагируют этилацетатом . Каждый из экстрактов концентрируют до 1/100 по объему и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикатной гелево-стекл нной пластине (растворитель хлороформ метанол 9:1. Об активности суд т по интенсивности п тенj определ емых иррадиацией с ультрафиолетовым светом при 2537 А. Метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол, которые, таким обра-j зом получают в культивированном , дипофильны и нейтральны, они могут быть легко регенерированы путем сепарации и очистки, которые осуществл ют обычно дл  получени  таких микробиологических метаболитов. Например , может быть осуществлена операци , котора  использует разницу в растворимости между антибиотиком и примес ми, способы, которые используют фракционную абсорбционную эффективность различных абсорбентов, , как активизированный уголь,микропористые неионные смолы, силикагель, алюминий и т.д., процесс удалени  примесей посредством ионообменных смол и т.д. Эти способы могут примен тьс  по отдельности, в комбинации друг с другом, однократно или многократно.

Метанацин, метанзинол или пропионат метанзинола получают в фильтрате, антибиотики отдел ют и очищают посредством абсорбентов. Антибиотик получают или непосредственно, или после эк- 5 рой

стракции растворителем в случае фильтрата , или после экстракции растворителем в случае микробных клеток. Экстракци  растворителем может быть осуществлена из культивированного бульо- О на дл  отделени  клеток и из фильтра та, полученного после фильтрации, центрифугировани  или других процессов . Чтобы экстрагировать фильтрат и клетки независимо друг от друга могут быть использованы растворители дл  экстракции фильтрата - водоэмуль сионные органические растворители такие, как эфиры жирных кислот, например этилацетат и амилацетат, спир ты, например бутанол, галогенированныегидрокарбонаты , например хлороформ , кетоны, например метил-изобутилкетон . Экстракцию производ т при рН, бли ком к нейтральному. Предпочтительно культивированную жидкость, доведенную до рН 7, экстрагировать этилацет том. Экстракт промывают водой и концентрируют под пониженным давлением . Затем непол рный растворитель такой, как петролейный эфир или гексан добавл ют к концентрату, и сырой продукт 1, содержащий активные соеди нени , регенерируетс . Так как на тонкослойной хроматограмме обнаруживаетс  р д других п тен, кроме метанацина , метанзинола, пропионата мета зинола, то продукт 1 подвергают очист-ло Дл  очистки используют р д методов , например абсорбционную хроматографию , с применением одного из общеприн тых абсорбентов таких, как силикагель , алюминий, макропориста  неионна  смола. Дл  очистки сырого про )цукта 1 особенно подходит силикагель Затем петролейный эфир и гексан используют с добавлением пол рных растворителей таких, как этилацетат, ацетон , этанол или метанол, Силикагель используют как носитель, хроматографическую колонку заполн ют последовательно возрастающими отношени ми гексана к этилацетату. Пробу исследуют с помощью тонкослойной хроматографии , и фракции, содержащие активные

ингредиенты, добирают и концентрируют под пониженным давлением. Затем петролейный эфир или гексан добавл ют к концентрату, при этом получают сысодержит еще примеси, его очищают. На пример, продукт 11 может быть очищен с помощью второй колонки с си йкагелем , с.использованием дифференциальпродукт П. Так как этот продукт ной системы растворителей. Система растворителей дл  этой цели может состо ть из галогенированного углеводорода такого, как дих орметан или хлороформ , с добавлением пол рного растворител  такого, как спирт, например этанол или метанол, кетон, например ацетон или метилэтилкетон и т.п. Таким образом выдел ют метанацин, метанзинол или пропионат метанзинола. Чтобы система растворителей дл  первой и второй колонок с силикагелем могла быть регенерирована, обычные органические растворители при необходимости могут использоватьс  совместно с упом нутыми. Когда макропориста  абсорбционна  смола используетс  как средство дл  очистки сырого продукта 11, то очистку метанацина, метанзинола или пропионата метанзинола выполн ют в смеси воды с низшим спиртом, низшим кетоном или эфиром. Низшим спиртом может, например , быть метанол, этанол, пропанол или бутанол и низшими кетонами могут быть, например ацетон или метилэтилкетон . Эфиром может, например, быть этилацетат. В типичной операции сырой продукт 11 раствор ют в 60%-ном растворе метанола в воде и абсорбируют на колонке DIaion-HRIO. Колонку промывают , а затем раствором метанола в ваде. Таким образом метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол выдел ют из колонки, Фракции, содержащие указанные компоненты , объедин ют и концентрируют под пониженным давлением. К сухому продукту добавл ют 5-8 объемов этилсмесь отстаивают. Затем ацетата, кристаллы метанацина, пропионата метанзинола и метанзинола отдел ют с помощью абсорбентов. Так, использу  силикагель или макропористую неионную tuony, а в качестве абсорбента - рас ворители , выдел ют описанные соединени . Когда, например, используют силикагель, топримен ют гексан, этил99387t61 .0

ацетат или смесь хлороформ-метанол, пользовании 60% метанол-вода и 95 при этом выдел ют пропионат метанзино- метанол-вода с добавкой 5 хлорида ла иметанацин. После обнаружени  с по- натри  метанацин и пропионат метанмощью тонкослойной хроматографии фрак- зинола по вл ютс  в упом нутом пор дции концентрируют под пониженным дав- ке. После вз ти  пробы и определени  лением, и этилацетат добавл ют к кон- с помощью тонкослойной хроматографии центрату. Таким образом, соответству- каждую группу активных фракций конющее соединение может быть получено центрируют под пониженным давлением и в виде кристаллов,кристаллизуют из этилацетата. Выделен ,10 ные кристаллы включают этилацетат

Когда примен ют макропористую как растворитель кристаллизации и поснеионную абсорбентную смолу, то может ле сушки над п тиокисью фосфора при быть использован растворитель с раз- в течение 8 ч имеют физические личным соотношением спирта, кетона и химические свойства, представленные или эфира и воды. Например, при ис- is в таблице.

Z2.°92

К) 121 + (d) 127-10 + 10 (,35; сне Ц) (,25;СНСу

92.

W 3l3-l(f ,22; СНСЬ) Кислота,нейтЛигюфил и Липофил и нейтнейтральное ральное вещество ральна  или основна  вещество

Цветные реек- Положительции |р-ци 

на 

Драгендорфа

Реакци  Бель- Положител.ь- Положительна 

на 

штейна Приведенные данные элементного анализа, специфического вращени , УФ-, ИК- и масс-спектров наход тс  в хорошем соответствии с данными дл  метанацина. и м е р 1, Метанзинол, метанацин и пропионат метанзинола - производные Нокардиа С-15003 (IFO 13726; FERM 3992; АТСС 31281), выращенные на дрожжевом экстракте солода в агаре, используют дл  прививки 200 ч ( по объему) ферментов, содержащих 40 об. ч сем н, культивированных в среде (2 глюкозы, 3 раствора крахмалву муки сырых соевых бобов, 1% погруженных в жидкость злаков, 0,5 полипентона, 0,3 Nad, 0,5 CaCOj, рН 7,0). Культивированную среду инкубируют при 28°С в течение kQ ч до введени  в колонку 0,5 об.ч. раствора, получен ного таким образом: из колонки помещают в 200 об.ч. фермента, содержащег kO об.ч. ферментной среды, состо щей из 5 декстрина, 3 зерна, погруженного в жидкость, 0,1 полипептона и 0-,5% СаСО при рН 7,0, и культивируют при 28С в течение 90 ч, чтобы получить культуру сем н. Методом последовательного разбавле ни , использу  в качестве исследуемого организма Тетрахимену пириформис V/и метанзинолпропионат как стандартный продукт, найдено, что названна  культура имеет титр 25 мг/мл. Пример 2. 10 об.ч. культуры сем н, полученных в примере 1, помещают 8 2000 об.ч. фермента, содержащего 50 об.ч. сем н, культивирован ных в среде Атакой же, как упом нута ), и инкубируют при 28С в течени 48 ч. 500 об.ч. культуры перенос т в сосуд из стали емкостью 50000 об.ч..

Положительна 

Положительна 

Положительна  Липофил и нейтральное вещество содержащий 30000 об,ч. сем н, культивированных в среде, и культивируют при 28°С, аэрации (30000 об.ч./мин, перемешивании г.р. т. (1/2ДТ) и внутреннем давлении (1 кг/см) дл  получени  культуры сем н. Эту культуру используют дл  посева 200000 об.ч. в сосуде из стали, содержащем 100000 об.ч. ферментативной среды, подобной среде, использованной в примере 1, при скорости инокул ции 10%. Инокул ционную среду инкубируют при , аэрации (100000 об.ч. /мин), перемешивании 200 г.р. ум ,(1/2ДТ)3 и внутреннем давлении (,1 кг/см) в течение 90 ч. Провод т ту же операцию, что и в примере 1. Полученна  культура имеет титр 25 мг/мл. К 90000 об.ч. полученной культуры добавл ют 2000 ч. Гифло-суперцела Р и, после перемешивани , смесь фильтруют на фильтр-прессе, чтобы получить 85000 об.ч. фильтрата и 32000 ч. влажных клеток. Фильтрат 85000 об.ч. перемешивают и экстрагируют 30000 об.ч. этилацетата. Эту операцию повтор ют снова. Осадки этилацетата объедин ют, промывают дважды 30000 об.ч. воды, сушат путем добавлени  500 ч. обезвоженного сульфата натри  и концентрируют под пониженным давлением до 200 об.ч. Петролейный эфир добавл ют к концентрату и провод т осаждение и фильтрование. Полученный сырой продукт 1 перемешивают со 100 об.ч. этилацетата, и раствор фильтруют. Фильтрат смешивают с 10 ч. силикагел  и этилацетат удал ют под пониженным давлением. Остаток помещают на верх колонки с си лика гелем kOO об. ч.) Раствор удал ют об.ч. гексана, 500 o6.4i смеси гексанэтилацетат (3:U, 139 500 об.ч, смеси гексан-этилацетат (1:1), 500 об.ч. смеси гексан-этилаце тат (1:3, 500 об.ч. этилацетат, 1000 об.ч. смеси этилацетат-метанол (50:1) и 1000 об.ч. смеси этилацетатметанол (25:1) собранными во фракции по 100 об.ч, Одну часть объема каждой фракции концентрируют сушкой, и 0,1 об.ч. этилацетата добавл ют в концентрат. Смесь дает п тно на рассто нии 2,5 см от дна остри  сигмкагелевой стекл нной пластины и растет,примерно, до 17 см с растворимой системой этилрцетат-метанол (19:1). После этого Производ т определение в ультрафиолет товом свете (2537 А). Активные фракции f 25-30 Rf 0,58-0,63 и фракции f Rf 0,25-0,30 собирают и концентрируют под Пониженным давлением, примерно до 20 об.ч. К этим концентратам добавл ют 150 об.ч. петролейного эфира дл  получени  5 ч. сырого продукта 1 и 2 ч. сырого метанзинола. В 10 об.ч. этилацетата раствор ют 0,5 ч. полученного сырого продукта 1 и раствор хорошо перемешивают с ч. силикагел . Этилацетат удал ют под пониженным давлением. Осадок помещают на верх колонки с 300 об.ч. силикагел , и колонку вначале промывают 500 об.ч. хлороформа и затем обрабатывают 500 об.ч. смеси хлороформ-метанол (50:1), 500 об.ч. смеси хлороформ - метанол (20:1) и 500 об.ч. сме си хлороформ - метанол (10:1). Раствор собирают фракц1;1 ми по 25 об.ч. 0,5 об.ч. каждой фракции концентрируют при пониженном давлении. К кон центрату добавл ют 0,05 об.ч. этилацетата , и смесь в виде образца подвергают анализу методом тонкослойной хроматографии (система .хлороформ метанол 9:1). Фракцию № 0, абсорбированную при 2537А в зоне R 0,,50, собирают и концентрируют сушкой под пониженным давлением. К осадку добавл ют 0,5 об этилацетата, и смесь отстаивают, затем получают 0,05 ч. смешанных кристаллов метанацина и пропионата метанзинола . 0,05 ч. смешанных кристаллов метанацина раствор ют в 5 об.ч. метанола следовавшего за добавлением 0,1 ч. хлорида натри  и 5 об.ч. воды. Колонку заполн ют 200 об.ч. Diaion HP-10 промывают 600 об.ч. 502; метанол-вод 61 содержащих 5 /МаС1. Пробу раствора, приготовленного указанным способом, пропускают через колонку и растворение довод т до конца с использованием 1500 об.ч. 60 метанола - воды,, содержащих 5% NaC:1 и 1500 об.ч..95% метанола - воды. Раствор собирают в фракции по 15 об.ч., и каждую фракцию исследуют тонкослойной хроматографией. Фракции 130-135 содержат метаноцин, и фракции 138-1 2 содержат пропионат метанзинола. Каждую группу фракций концентрируют и раствор ют добавлением 30 мл воды и 50 мл этилацетата. Раствор перемешивают в разделительйой воронке, водный слой отдел ют, и после двух- кратной промывки 30 мл воды осадок этилацетата высушивают над безводным сульфатом натри , концентрируют и отстаивают . Описанным способом получают Кристаллы из каждой группы фракций. : Кристаллы собирают с помощью фильтрации и сушки. Содержание метанацина 0,013 ч., пропионата метанзинола 0 ,025 ч. В 3 об.ч. этилацетата раствор ют 0,2 ч. сырого метанзинола, полученного описанным способом, и раствор хорошо перемешивают с 0,5 ч. силикагел . Этилацетат удал ют под пониженным давлением. Осадок помещают на верх колонки с 80 об.ч. силикагел , и колонку сначала промывают 150 об.ч. затем 150 об.ч. смеси хлороформ-метанол (50:1), 150 об.ч. меси хлороформ-метанол (20:1) и . ЗОО об.ч. смеси хлороформ-метанол (10:1). Раствор собирают во фракции по 10 об.ч. 0,5 об.ч. каждой фракции концентрируют под пониженным давлением. К концентрату добавл ют 0,05 об.ч. этилацетата , и смесь подвергают анализу с тонкослойной хроматографии (раствор юща  система хлороформ - метанол 9:1). Фракции № 50-52 абсорбируют при 2537 А в зоне 0,33-0,38, собирают и концентрируют путем сушки под пониженным давлением. К осадку добавл ют 0,5 об.ч. этилацетата, и смесь отстаивают , в результате чего получают 20 ч. кристаллов метанзинола. Пример 3. Путем перемешивани  32000 ч. клеток, полученных в примере 2, экстрагируют 50000 об.ч.

Claims (3)

1. Формула изобретения

   1. Способ получения алкалоидов метанзинола, метанацина и пропионата метанзинола путем экстракции целевого продукта органическим растворителем, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода алкалоидов, штамм Nocardia С-15003 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и стимуляторы роста, затем отделяют культуральную жидкость от биомассы, подвергают их порознь экстракции и целевой продукт очищают и концентрируют.
2. 2. Способ поп. ^отличающийся тем, что экстракцию проводят с помощью несмешивающегося ic водой органического растворителя.

   ч а продукт или »0

   4(!
3. 3. Способ по п. 1, о т л и ю щ и й с я тем, что целевой очищают методом хроматографии осаждения.