DE2659459A1 - Verfahren zur herstellung von zitronensaeure - Google Patents

Verfahren zur herstellung von zitronensaeure

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DE2659459A1 DE19762659459 DE2659459A DE2659459A1 DE 2659459 A1 DE2659459 A1 DE 2659459A1 DE 19762659459 DE19762659459 DE 19762659459 DE 2659459 A DE2659459 A DE 2659459A DE 2659459 A1 DE2659459 A1 DE 2659459A1
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Description

NACHQEREIOH
Unsere Nr. 20 727 Pr/br
Pfizer Inc.
New York,.N.Y.,V.St.A.
Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure
Wegen ihrer leichten Assimilierung, ihrer Schmackhaftigkeit und geringen Toxizität ist Zitronensäure eine der meistverwendeten Säuren in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrieν Die Zitronensäure findet weitverbreitete Verwendung als ein Sauermacher in Getränken und auch als ein Antioxidans zum Hemmen des Ranzigwerdens von Fetten und ölen. Sowohl die Säure als auch ihre Salze werden als Puffer bei der Herstellung von Marmeladen, Gelees und Gelatinepräparaten und außerdem als Stabilisatoren in verschiedenen Nahrungsmittelprodukten verwendet, Bisher verwendete man bei der Zitronensäuregärung gewisse Stämme von Aspergillus niger in wäßrigen Nährmedien, die Melasse, Saccharose, Dextrose usw. als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthielten.
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Jüngere, in der BE-PS 72- 553, JA-PS 20 707 und US-PS 3 717 beschriebene Entwicklungen betreffen Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Züchtung von Zitronensäure anhäufender Hefe in wäßrigen Nährmedien, die Kohlenhydrate als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthalten.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, bei dem man einen Zitronensäure anhäufenden Hefestarair, der Gattung Candida aerob in einem wäßrigen Nährmedium, das genug einer leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle enthält, um das Wachstuni zu fördern, jedoch nicht genug, um die Anhäufung von Zitronensäure zu gestatten, züchtet, Paraffingatsch als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff zusanunen mit einem Soiuöilisierangsndttel in das wäßrige Nährmediurr. einführt, nachdem mindestens 50 % der leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle verbraucht worden ist, die aerobe Züchtung fortsetzt, bis sich mindestens etwa 1 g Zitronensäure je Liter wäßriga/n Nährmedium angehäuft hat und die Zitronensäure gewinnt, wobei als Solubilisierungsmittel Alkanole mit k bis 6 C-Atomen in jedem Alkylrest,. Niederalkylester von Alkansäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, Alkene und Alkane mit 8 bis 9 C-Atoiser., Terpentin, Mineralöl und Gemische davon verwendet werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist Erdölwachs die Hauptquelle für assimilierbaren-Kohlenstoff.
Erdölwachs, in der Erdölindustrie allgemein bekannt als Paraffingatsch, ist ein relativ homogenes Material, das aus langkettigen Kohlenwasserstoffen mit 20 bis 30 C-Atomen besteht. Es ist eine feste Substanz bei Raumtemperatur und besitzt einen Gefrierpunkt von etwa 45 C. Paraffingatsch wird aus bestimmten
709836/Ö
paraffinbasischen Schniierölfraktionen aus den Destillationseinheiten hergestellt. Genauer gesagt werden die öle rat geeigneten Lösungsmitteln vermischt, unter Bildung von Wachskristallen abgekühlt und dann filtriert, um das Wachs vom Gemisch zu entfernen. Weitere Lösungsmittelbehandlung, Enbfernung des Lösungsmittels und Behandlung mit Dampf ergibt das halbraffinierte Wachs, das die Forderungen der PDA Food Additive Regulations subρart D & F Section 121.1156 und 121.2586 erfüllt.
Es scheint nur ein geringer laufender Bedarf für die großen Mengen ar. Paraffingatsch zu bes-ehen, die als Nebenprodukt des Schmiercl-Refiningverfahrens anfallen. Der Preis liegt etwa in derselben Größenordnung wie Rohöl. Es gibt keine Literatur oder Berichte zum otand der Technik über die Verwendung dieses Materials als Gärsu'ostrac für die Herstellung von mikrobiellen Produkten.
Die Neuheit dar vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung dieses festen Kohlenwasserstoffabfallproduktes als leicht verfügbares billiges Substrat für die Herstellung von Zitronensäure durch einen Zitronensäure anhäufenden kohlenwasserstoffassimilierenden Hefestamm, der zur Gattung Candida gehört. Dies erfolgt, indem man zuerst den Candida-Stamm in einem wäßrigen Nährmedium wachsen läßt, das eine leicht zu handhabende Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff enthält, so daß eine große Menge Candida-Zellen erhalten werden können. Diese leicht zu handhabende Kohlenstoffquelläkann Glucose sein, ein Pflanzenöl, ein Fettsäureester oder Gemische davon, ein Normalparaffin mit 9 bis 19 C-Ato^.en oder Gemische davon oder andere dem Fachmann bekannte Kohlenstoffquellen. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose in einer Konzentration von 5 bis 10 Gew.-%/Vol., vorzugsweise 7,5 Gew.-?/Vol.. Außerdem enthält
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das Medium eine Quelle für assimilierbarer. Stickstoff wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Weizenklaie, Sojabohnanmehl, Harnstoff, Aminosäuren und Peptone. Es ist auch wohl bekannt, daß Vitamine wie Biotin und Thiamin und Mineralkationen und Anionen wie Natrium, Kalium, Cobalt, Phosphat und Sulfat ebenfalls günstig für das Wachstum von Hefen sind. ·
Die Menge an leicht assimilierbarer Kohlenstoff quelle im Produktionsmedium ist begrenzt auf die Menge, die ausreicht für das Wachstum der zugesetzten Candida-Zellen, reicht jedoch nicht aus, um die Anhäufung von Zitronensäure zu gestatten v;*-2niger als 0,5 g/l). Dia ooere Konzentrat ions grenze ist festgesetzt als diejenige Mange, ζ·χ dar jade weisere Zugabe die Anhäufung von Zitronensäure gestattet (größer als 0,5 g/l). Wenn Glucose im Produktionsmedium verwendet wird, ist die Konzentration I bis 3 Gew.-i/Vol., vorzugsweise 2 Gew.-%/Vol.
Die Gärung kann solange fortschreiten, bis mindestens 50 % und vorzugsweise 80 % der Glucose assimiliert sind (etwa 2H Stunden). Danach wird eine Menge an Paraffingatsch zugesetzt, die eine Konzentration von mindestens 3 Gew.-* des Mediums ergibt, vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-?, zusammen mit einem SoIubilisierungsmittel. Die Zugabe von Paraffingatsch und SoIubilisierungsmittel kann dadurch erfolgen, daß man diese gesamte Kombination auf einmal zugibt oder durch Zugabe zu unterschiedlichen Zeiten während der Gärung. Beispielsweise können nach der ersten Zugabe gleiche Zugaben in Abständen von 24 Stunden während des Gärzyklus erfolgen.
Kritisch für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Verwendung und Auswahl eines geeigneten Solubilisierungsmitteis für den
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Paraffingatsch. Das Solubilisierungsmittel dient dem Lösen oder teilweisen Lösen des Paraffingatsch, so daß es vollständig dispergierbar in der wäßrigen Phase des Gärmediums und somit der metabolischen Verwendung durch die wachsenden Candida-Zellen verfügbar gemacht wird. Die Wahl des Solubilisierungsmittels hängt von Faktoren /w~ie nichthemmende Wirkung auf das Wachstum von Candida-Zellen, gute Löslichkeit für Paraffingatsch, geringe Flüchtigkeit, niedrige Kosten und leichte Erhältlichkeit. Diese Kriterien werden weitestgehend erfüllt durch Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen in jedem Alkylrest, Niederalkylester von Alkansäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, Alkenen und Alkanen mit 8 bis 19 C-Atomen, Terpentin, Mineralöl und Gemische davon. Ein geeignetes Solubilisierungsmittel ist Kerosin, das ein Gemisch aus Erdölkohlenwasserstoffen, hauptsächlich aus der Methanreihe mit 10 bis 16 C-Atomen je Molekül ist. Die Menge oder das Verhältnis an Solubilisierungsmittel zu Paraffingatsch hängt bis bis zum gewissen Grade von der Art des Solubilisierungsmittels ab, beträgt jedoch im allgemeinen 0,25:1 bis 2:1. Die bevorzugten Solubilisierungsmittel sind Octan, Nonan und Decan im Verhältnis zum Paraffingatsch von 1:1. Dieses Verhältnis kann während der Zugabe zur Gärung verändert werden, wird jedoch im allgemeinen auf einer festgesetzten Menge gehalten.
Da der Paraffingatsch und das Solubilisierungsmittel in der wäßrigen Phase des Nährmediums nicht mischbar sind, ist es erwünscht, sie während der Gärung in einer fein dispergierten Form zu halten, um^somit sicherzustellen, daß eine große Oberfläche des Materials mit der wäßrigen Phase in Kontakt kommt. Auf diese Weise wird ein optimaler Kontakt zwischen den Hefezellen, der wäßrigen Phase und dem Paraffingatsch erzielt.
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Bevorzugte Maßnahmen zur Erzielung dieser Faktoren sind submerse Gärung und schnelles·Rühren des Gemischs, während gleichzeitig Luft hindurchgeführt wird, z.B. durch Anschwänzen.
Es können die üblichen Temperaturen, wie sie in der Technik der Hefegärung bekannt sind, z.3. etwa 20 bis 37°Ca angewandt werden, wobei ein bevorzugter Bereich bei 25 bis 29 C mit einer 4- bis 7-tägigen Gärung liegt. Die Produktgärung wird fortgesetzt,bis mindestens 1 g Zitronensäure pro Liter des Mediums angehäuft worden ist. Die anfängliche Wach3turnsperiode der Kefezellen zur Herstellung -iss Inokulums beträgt vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Diese allgemeinen Wachstums- und Gärbedingungen sind in der Technik bekannt sowie auch die Methoden zur Gewinnung der hergestellten Zitronensäure als freie Säure, Natriumsalz oder Calciumsalz durch Zentrifugieren, Filtrieren, Einengen unter Vakuum etc. bekannt sind.
Jeder der bekannten Zitronensäure anhäufenden Candida-Stamme eignet sich für die vorliegende Erfindung und liefert unterschiedliche Mengen an angehäufter Zitronensäure wie es aus der Technik bekannt ist. Geeignete Stämme sind von verschiedenen Hinterlegungsstellen der ganzen Welt verfügbar und werden in früheren Patenten beschrieben. Beispiele für Zitronensäure anhäufende Stämme sind Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Candida parapsilosis und Candida brumptii. Die bevorzugten Zitronensäure anhäufenden Stämme sind diejenigen, die zur Species Candida lipolytica gehören. Nach neuerer Nomenklaturpraxis ist die Gattung Candida synonym und auswechselbar mit der Gattung Saccharomycopsis.
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Nachstehend werden Methoden zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Zitronensäure beschrieben mit reinen Bezugsproben von Zitronensäure und Isozitronensäure als Voraussetzung. GasChromatographie stellt eine empfindliche Methode zur Differenzierung und Bestimmung der Menge an Isozitronensäifre in' ' Gegenwart von Zitronensäure''dar.
Analysenmethoden
I. Papierchromatographie
Die nachstehenden Systeme stellen eine bequeme halbquantitative Maßnahme zur Bestimmung von Zitronensäure im Gärmedium dar. Konzentrationen von Zitronensäure, selbst geringer als 1 g je Liter des Mediums, d.h. 1 mg je L des Mediums, können leicht durch diese chromatographischen Methoden bestimmt werden.
1. Lösungsmittelsystem A
Dieses Lösungsmittelsystem ist ein Volumengemisch von 80 Teilen Methyläthylketon, 6 Teilen Aceton, 12 Teilen destilliertem Wasser und 2 Teilen Ameisensäure. Zitronensäure zeigt einen IL. von etwa 0,59 bis 0,61I mit diesem System.
2. Lösungsmittelsystem B
Dieses Lösungsmittelsystem besteht aus 1 Volumenteil Ameisensäure, 2 Teilen Cineol und 3 Teilen n-Propanol. Der Rf von Zitronensäure mit diesem System beträgt etwa 0,^0 bis 0,^5.
3. Lösungsmittelsystem C
Dieses Lösungsmittelsystem bestehtjaus einem Gemisch aus Wasser/gesättigter Ameisensäure/Äther, d£s durch gemeinsames
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Schütteln in einem Scheidetrichter eines Gemische aus 2 100 ml Äthyläther, 300 ml Ameisensäure und 275 ral Wasser hergestellt worden ist. Nach dem Schütteln wird die obere Lösungsmittelschicht als das Chromatographier-Lösungsmittel verwendet. Der R„ von Zitronensäure mit diesem System beträgt 0,30 bis 0,35.
Eine 5 bis 10 Mikroliter-Probe der wäßrigen Phase des abfließenden Materials, das wie vorstehend beschrieben aus dem Gärmedium abgetrennt worden war, wurde bei 80 C im Vakuum getrocknet,um jegliche Isozitronensäure in Lacton umzuwandeln, in Wasser wieder gelöst und auf das Papier getan, wonach das Chromatogramm auf übli-.h=? Veise durchgeführt wurde. In cis3an Analysen wurde allgemein Whatman No.l-Papier als dae Absorbens und Bromcresol Grün als Indikator verwendet; (hergestellt durch Lösen von 0,25 g Bromcresol Grün in 1JOO ml Aceton und Einstellen der Lösung auf grüne Farbe). In allen Fälion wurde 2ine authentische Probe Zitronensäure mit jedem Chromatogram.?. als Standard mitverwendet.
II. Pentabromaceton-Analyse
Verschiedene Methoden, zu denen die Bildung von Pentabromaceton gehört, können zur Bestimmung von Zitronensäure in Gegenwart von Isozitronensäure angewandt werden. Eine bevorzugte Methode wird beschrieben durch H.A. Krebs in Biochem. J. 51», 78 (1953) und in Methods in Enzymology, Bd. XIII, verlegt durch J.M. Löwenstein, Seite 515.
III. GasChromatographie
Dies ist eine andere quantiative Methode zur Bestimmung von Zitronensäure und Isozitronensäure, die im vorliegenden angewendet wurde. Die Analyse wird mit einem GasChromatograph Modell Pye
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durchgeführt mit einem Flammenionisationsdetektor unter folgenden Bedingungen:
Säule = Glas, 2,10 m χ 0,63 cm, gefüllt mit 3 % OVl 7 auf
Chrom W(HP)
Säulentemperatur = l40 bis 150°C
Nachweisblocktemperatur (detection block) = 2300C Heliumfließgeschwindigkeit = 50 ml/Min. WasserstoffrFließgeschwindigkeit = 50 ml/Min. Luftfließgeschwindigkeit = 500 ml/Min. Probengröße = 10 Mikroliter
Eine Standardprobe wurde hergestellt, indem man zuerst 60 mg wasserfreie Zitronensäure und 1,8 mg Isozitronensäure genau auswog. Diese wurden in 3,0 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst worauf 20 ul Schwefelsäure und anschließend 1,0 ml N,0-Bis-(trimethyIsilyl)acetamid (BSA) zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde dann 1 Stunde lang auf 600C erhitzt,und eine 10 ul-Portion wurde in den GasChromatographen eingespritzt. Das dabei erhaltene Chromatogramm zeigt Peaks, die der Zitronensäure und der Isozitronensäure entsprechen, wobei die Bereiche unter den Peaks zweckmäßigerweise mit Hilfe eines Integrators berechnet wurden, der an den GasChromatographen angeschlossen war.
Eine Probe der wäßrigen Phase des abfließenden Stoffes, abgetrennt vom Gärmedium,wurde dann genommen und 1,0 ml davon wurden mindestens k Stunden lang gefriergetrocknet. Dem getrockneten Rückstand wurden 10 ml THF, 100 ^uI Schwefelsäure und 10 Glaskugeln zugesetzt. Das Gemisch wurde dann kräftig geschüttelt, um das Auflösen des trocknen Rückstands sicherzustellen, 3 ml der Lösung wurden in eine Glasampulle getan, 1,0 ml BSA wurden zugesetzt und das Gemisch dem GasChromatographen zugeführt und genauso behandelt wie vorstehend für die Standardprobe beschrieben. Die Mengen an Zitronensäure und Isozitronensäure
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2 6 b 9 4 5
in der Probe konnten Leicht berechnet werden durch Vergleich des erhaltenen Chromatograirjns mit demjenigen, das für die Standardprobe erhalten wurde.
Beispiel 1
Zellen von Candida lipolytica NRRL Y-1094, die auf einer Kartoffeldextroseagarschrägkultur gezüchtet worden waren, wurden in einen Fernbach-Kolben, der· 800 ml eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, inokuliert:
Bestandteil Gramm/Liter
75,0
j11H2O 0,25
KH2PO11 0,50
Calciumphytat 0,50
O4 4,0
CaCO, 5,0
Hefeextrakt · 1,0
Der inokulierte Kolben wurde bei 260C auf einem Rotatxonsschüttler 48 Stunden lang inkubiert, wonach eine 100 ml-Portion der gezüchteten Kultur (Inokulum der ersten Stufe) aseptisch in einen H 1-Fermenter übertragen wurde, der 2 1 steriles
Medium enthielt, das die gleiche Zusammensetzung hatte, wie dasjenige, das im Fernbach-Kolben verwendet wurde. Der Fermenter wurde mit 1 750 UpM gerührt,und Luft wurde durch einen Sprinkler mit einer Geschwindigkeit von 29,88 1 je Stunde je Liter des Mediums eingeführt. Die Temperatur wurde auf 26°C gehalten.
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-MT-
Die Gärung wurde im Fermenter 72 Stunden lang fortgesetzt, wonach 100 ml-Portionen (Inokulum der zweiten Stufe) in eine Reihe identischer Fermenter übergeführt wurden, wobei jeder 2 1 des sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthielt:
Bestandteil
Gramm/Liter
Glukose Thiandnhydrοchlorid MgSO2+
TH2O
CaCO
Harnstoff KH2PO4
20,0 0,001 0,20
17,0 4,05 0,75
Man ließ die Gärung 24 Stunden lang fortschreiten, wonach 100 nil verflüssigter Paraffingatsch (Moore & Munger, Inc., Stamnford, Conn.) einem der Fermenter zugesetzt wurden. Auf gleiche Weise wurden 100 ml n-Octan einem zweiten Fermenter zugesetzt,und einem dritten Fermentar wurden 100 ml n-Octan und 100 ml Paraffingatsch zugesetzt. Gleiche Zusätze erfolgten zu jedem Fermenter nach 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden. Die Gärung in jedem Fermenter ließ man insgesamt 137 Stunden fortschreiten.
Zusätze
n-Octan Paraffingatsch n-Octan + Paraffingatsch
Beispiel 2 Gramm Zitronensäure je Fermenter
keine
keine
5,44
Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man Glukose durch SojabohnenÖl, Erdnußöl, Butylester von Oleinsäure und Glycerylester von Linolsäure ersetzt?, wobei man vergleichbare Ergebnisse erhielt.
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Beispiel 3
Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man n-Octan durch Terpentin, Kerosin, Mineralöl, Butanol, Amylalkohol, Octanol, Decanol, Äthylacetat und Butylhexanoat ersetzte, wobei man vergleichbare Ergebnisse erzielte.
Beispiel 4
Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man anstelle von n-Octan n-Nonan verwendete, wobei man folgende Ergebnisse erzielte:
Zusätze
n-Nonan Paraffingats ch n-Nonan + Paraffingatsch
Beispiel 5
Gramm Zitronensäure je Fermenter
keine keine 73,61
Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man anstelle von n-Octan n-Decan verwendete, wobei man folgende Ergebnisse erzielte:
Zusätze
n-Decan Paräffingats ch n-Decan + Paraffingatsch
Gramm Zitronensäure je Fermenter
5,37 ·
keine
181,15
709836/0603
Beispiel 6
Man vefuhr nach Beispiel 5 mit n-Decan zu Paraffingatsch Verhältnissen von 0,25'· 1 und 2:1 und erhielt vergleichbare Ergebnisse.
Beispiel 7
.Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man anstelle von n-Octan n-Dodecan verwendete und erhielt folgende Ergebnisse:
Zusätze Gramm Zitronensäure je Fermenter
n-Dciacan 153,51
Paraffingatsch keine
n-Dodecan + Paraffingatsch 208,40
Beispiel 8
Man verfuhr nach Beispiel 7 mit dem Unterschied, daß man n-Dodecan durch ein Gemisch aus n-Alkenen und n-Alkanen mit 9 bis C-Atomen ersetzte, wobei man vergleichbare Ergebnisse, erzielte.
Beispiel 9
Man verfuhr nach Beispiel 6, wobei man jeweils einen der folgenden Zitronensäure anhäufenden Candida-Stamme verwendete, wobei man vergleichbare Ergebnisse erzielte:
Candida lipolytica ATCC 8662
Candida lipolytica ATCC 9773
Candida lipolytica ATCC 20114
Candida lipolytica ATCC 20182
70 9 8 36/0603
Candida tropicalis ATCC 20115
Candida intermedia ATCC 20178
Candida parapsilosis ATCC 20181
Candida guilliermondii ATCC 20118
Candida brumptii ATCC 20117
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Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Zitronensäure anhäufenden Hefestamm der Gattung Candida aerob in einem wäßrigen Nährmedium, das genug einer leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle enthält, um das Wachstum zu fördern, jedoch nicht genug, um die Anhäufung von Zitronensäure zujgestatten, züchtet, Paraffingatsch als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff zusammen mit einem Solubilisierungsmxttel in das wäßrige Nährmedium einführt, nachdem mindestens 50 % der leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle verbraucht worden
    sind, die aerobe Züchtung fortsetzt, bis sich mindestens etwa 1 g Zitronensäure je Liter wäßrigem Nährmedium angehäuft hat, und die Zitronensäure gewinnt, wobei man als Solubilisierungsmittel Alkanole mit *» bis 10 C-Atomen in jedem Alkylrest, Niederalkylester von Alkansäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, Alkene und Alkane mit 8 bis 9 C-Atomen, Terpentin, Mineralöl oder Gemische davon verwendet.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als leicht assimilierbare Kohlenstoffquelle Glukose verwendet .
    3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Solubilisierungsmittel n-Alkan mit 8 bis 12 C-Atomen verwendet.
    709836/06Ö3 ORDINAL ,NSPECTED
    - 46 -
    2659A59
    ^. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Solubilisierungsmittel n-Decan verwendet.
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verhältnis von Solubilisierungsmittel zu Paraffingatsch von 0,25:1 bis 2:1 anwendet.
    Für: Pfizer Inc.
    New York, tf*Y., V.St.A,
    Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt
    709838/0 6 03
DE2659459A 1976-03-03 1976-12-30 Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure Expired DE2659459C3 (de)

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DE102004028179A1 (de) * 2004-06-04 2006-01-19 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren

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