DE2419605A1 - Verfahren zur herstellung von citronensaeure - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

Dr.-Ins. ΗΛ.\·:; ^JSCHKE
Dip!.-ing. C.-/F HÜSuiiKE
Dipj.-lng.-ί ?.iJS LL.nU^CH
1 BiIRLlN 33

Pfizer Inc., New ¥ork 17, iiew York, V.St.A.

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Fermentation. Im spezielleren bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure* bei dem man einen Citronensäure akkumulierenden Stamm, von Candida lipolytica in einem wäßrigen Währmedium, das l'alg oder unbehandeltes tierisches Fett als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, züchtet und die akkumulierte Citronensäure daraus isoliert. ■

Citronensäure ist wegen ihrer leichten Assimilierbarkeit, ihrer Schmackhaftigkeit und ihrer geringen SJoxizität eine der am meisten verwendeten Säuren in lebensmitteln und in der pharmazeutischen Industrie. Die Säure wird in großem Umfang als säuerliches Mittel in Getränken benutzt und kann außerdem als Antioxidans zur Verhinderung des ßanzigwerdens von Fetten und ölen verwendet werden. Sowohl die Säure als auch die Salze davon werden als Puffer bei der Herstellung von Marmeladen, iielees und Gelatinezubereitungen verwendet und werden außerdem als stabilisatoren in zahlreichen Nahrungsmitteln eingesetzt.

Jiei den bisherigen öitronensäure-Fermentationsverfahren sind

409846/0815

ausgewählte otämme von Aspergillus niger in wäßrigen Nährmedien angewendet worden, die Melassen, Rohrzucker, Dextrose tisw· als Hauptquelle für assimilierbaren kohlenstoff enthielten. In der belgischen Patentschrift 716 247» der französischen Patentschrift 2 003 199 und der deutschen Patentschrift 2 005 348 sind Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch aerobes Züchten von Zitronensäure akkumulierender Hefe der Gattung Candida in einem Nährmedium beschrieben, das einen geeigneten Paraffinkohlenwasaerstoff oder Gemische von Paraffinkohlenwasserstoffen als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff im innigen Gemisch mit einer wäßrigen Phase enthält, die eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff und übliche wesentliche Mineralien und Wachstumsfaktoren enthält.

Fettsäuren und pflanzliche Öle sind seit langem in Fermentati-onsnährmedien als Antischaummittel und als zusätzliche Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet worden. 2abuechi,

l'anaka und Abe berichten in J.Agr.Chem.Soc.Japan ££_f Nr. 3, 154-158 (1969) über die .bildung von Citronensäure durch üitro_r nenaäure akkumulierende Stämme von Candida in wäßrigen Hährmedien, die Fettsäuren, pflanzliche Öle oder Fischöle als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthalten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch aerobes Fermentieren eines Citronensäure akkumulierenden Stamms von Candida lipolytica in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff, Vitamine und Mineralien enthält, bei dem man ausgelassenes Fett (Talg) oder unbehandeltes tierisches Fett als Hauptquelle für den assimilierbaren Kohlenstoff verwendet.

Me unbehandelten herausgeschnittenen Abfallteile (waste trimings) von iiind, Schwein und Hamiiiel und ausgelassenes Fett (Ü'alg) stellt ein neues und neuartiges, billiges und leicht erhältliches .Rohmaterial für assimilierbaren Kohlenstoff für

409846/0815

die Herstellung von Citronensäure durch im Großmaßstab durchr· ' geführte Fermentation dar. Die Geschwindigkeit der öitronensäurebildung ist erheblich schneller als diejenige, die mit Kohlenwasserstoffsubstraten erzielt wird und ist der Geschwindigkeit in Kohlenhydrat enthaltenden Nährmedien überlegen.

.jis ist nun gefunden worden, daß Citronensäure in guter Ausbeute und mit hoher Geschwindigkeit durch aerobe Fermentation eines Citronensäure akkumulierenden Stamms von Candida lipolytica in einem Hährmedium erhalten werden kann, das unbehandeltes tierisches Fett oder ausgelassenes Fett (Talg) enthält, das mit einer wäßrigen Phase innig vermischt ist, die eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, Mineralien und andere übliche Nährstoffe enthält.

Im allgemeinen wird das tierische Fett mit einer Konzentration von etwa 5 - 20 Gew.-^, bezogen auf das Nährmedium, verwendet, obwohl dieser Prozentgehalt nicht kritisch ist und geringere oder höhere Konzentrationen angewendet werden können. Das feste tierische Fett kann in Form kleiner Stücke oder Brocken zugegeben werden, doch ist es vorteilhaft, wenn das Fett mittels üblicher Fleischzerkleinerungsvorrichtungen zerhackt oder in kleine Stücke zerschnitten worden ist.

Fette werden als üster von Fettsäuren mit Glycerin definiert.

Im Gegensatz zu pflanzlicnen Fetten, die öle und größtenteils Glyeerinester von ungesättigten Fettsäuren sind, sind tierische Fette im allgemeinen fest und bestehen aus einem Gemisch von Glycerinestern von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren. .Die gesättigten Fettsäuren reichen von C.- bis C₂g-Säuren mit jjaurinsäure (C₁₂)ι Myristinsäure (G-ta) und Stearinsäure (_1Q) als hauptsäenliche Fettsäurekomponenten. Die hauptsächlichen Bestandteile aus ungesättigten Fettsäurekomponenten der Glycerinester sind Linolsäure <&q) und Oleinsäure (G-io)·

Das bei dem Verfahren der Erfindung benutzte tierische Fett

409846/0815

ist überschüssiges Material vom Hind, Schwein und Hammel, welches in Fleischereien und Schlächtereien abgeschnitten worden ist. Dieses Fett, manchmal als "ladenfett" "bezeichnet, entspricht dem, das in der Abteilung von großen Fleischkonservenherstellern, in der das Fleisch zerschnitten und von jinochen befreit wird, anfällt.

"x'alg ist ausgelassenes tierisches Fett. Das Auslassen ist ein Ausdruck, der auf das '!'rennen von Fett von dem G-ewebe und der äellstruktur durch Erwärmen angewendet wird.

Mach der üJrfindung wird bevorzugt, ir de j. wäßrigen Fermentations- oder Gränrungsnährmedium Salze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumnitrat, als anorganische Quellen für assimilierbaren Stickstoff zu verwenden. Von den zahlreichen organischen Stickstoff quellen werden v/eizenklee, Sojabohnenmehl, ilarnstoff, Ma is aufschwemmung, Aminosäuren und Peptone bevorzugt. £a ist festgestellt worden, daß im Handel erhältliches ΙΪΖ Amine ΪΤΤ (The Sheffield Chemical Co., Norwich, iI.Y.) eine bequeme Peptonquelle ist. Bs ist natürlich bekannt, daß Vitamine, wie Biotin und Thiamin, und mineralische Kationen und Anionen, wie Natrium-, üalium-, Kobalt-, Phosphat- und Sulfationen, ebenfalls das wachstum von Hefen fördern. Die meisten dieser Spurenvitamine und -mineralien sind in Haisaufschwemmung und Sojabohnenmehl enthalten, und daher ist es nicht unbedingt erforderlich, diese dem Fermentationsnährmedium gesondert zuzusetzen, wenn diese Substrate benutzt werden.

G-emäß der Erfindung ist es auch vorteilhaft, dem Nährmedium üalciumcarbonat zuzugeben. Das Galciumcarbonat setzt sich mit Citronensäure um, die sich während der Kultivierung ansammelt, wodurch verhindert wird, daß der pH-Wert des Mährmediums zu sauer wird. Dieses letztere ist während der Anfangsstadien der tfefekultivierung von Bedeutung, weil, wie festgestellt worden ist, die Produktion von Citronensäure aufhört oder erüeblich verringert v/ird, wenn das iiährmedium zu schnell sauer wird. Es

409846/0815

wird auoh angenommen, daß etwas von dem bei der Reaktion von der citronensäure mit dem Galciumcarbonat gebildeten Kohlendioxid von den xiefezellen über deren Stoffwechsel umgewandelt werden kann, wodurch deren ,/achstum in dem Nänrmedium gefördert wird. Äutier üalciuiacarbonat kann Bariunicarbonat, Oalciumoxid oder bariumoxid verwendet werden.

Bei Durchführung der Fermentation im großen Maßstab ist es, wie festgestellt worden ist, vorteilhaft, zunächst eine geeignete Hefezellenmasse zu erzielen, bevor man diese in das Permentationsnäxirmedium einimpft. Es ist gefunden worden, daß eine Einstellung des pH-Wertes während der Anfangskultivierung der Hefezellen wesentlich ist. ü'enn der pH-Wert des Mediums zu schnell fällt, wird das Zellenwachstum nachteilig beeinträchtigt. Gemäß der Erfindung wird dieses Problem durch Zugabe von. üalciumcarbonat zu dem Nährmedium ausgeschaltet. Das Calciumcarbonat neutralisiert durch Umsetzung mit der Citronensäure die Saure so schnell, wie sie gebildet wird, und hält.den . pH-V/ert des iiediunis bei einem geeigneten Grad, 4-7. Andererseits kann kontinuierlich eine alkalische Ztösung von Natriumhydroxid, jL\.aliumhydroxid oder Ammoniak dem Nährmedium während der Anfangszeitspanne zugegeben werden, um die sioh ansammelnde Citronensäure zu neutralisieren und den pH-Wert bei etwa 4 oder darüber zu halten, und zwar vorzugsweise in dem Bereich von etwa 4 bis 7. Nach dieser Anfangszeitspanne ist eine Regulierung des pH-Wertes nicht weiter kritisch, denn erst einmal eine optimale Zellenmasse gebildet worden ist, kann die Fermentation vorteilnaft bei irgendeinem pH-V/ert von etwa 2 bis durchgeführt werden.

Bei einem bevorzugten Fermentationsverfahren wird die Anfang's-

zellveriaehrungsphase in zwei gesonderten Verfahrensstufen durchgeführt. In der ersten "Verfahrensstufe wird ermöglicht, dari sich die Hefezellen aerob für etwa 24 bis 72 Stunden bei einer i'emyeratur'von etwa 26 bis 30 C vermehren, ils wird dabei nicht versucnt, den pH-//erb 'einzustellen. In der zweiten Verfahrens stufe jedoch wird vei'hindert, datf der pn-,vert des

409846/0815

Mhrmediunis zu sauer wird, und zwar nach der zuvor beschriebenen Art und weise.

i»ie Hefezellen, die von den Zellen geerntet worden sind, die auf einem Kartoffel-, Dextrose-, Hefeextrakt-Schrägagar gewachsen sind, werden in ein Nährmedium eingeimpft, das ein Ammoniumsalz als Quelle für assimilierbaren Stickstoff und Glukose als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält. iiach einem Züchten bei etwa 28 O für etwa 48 Stunden wird ein aliqpter 'jjeil zum Einimpfen in ein zweites wäßriges Medium benutzt, das Ammoniumsalz, Maisaufschwemmung, Calciumcarbonat und etwa 5-20 Gew.-^ eines tierischen Fetts oder i'alg enthält, iiach einem Züchten für etwa 48 Stunden wird ein i'eil der gebildeten Hefe dem endgültigen Fermentationsnährmedium zugegeben.

Das endgültige Fermentationsnährmedium enthält die, üblichen Quellen für assimilierbaren Stickstoff, Mineralien und fettiges Material. Es ist festgestellt worden, daß ein geeignetes fiährmedium ein solches ist, das ein Ammoniumsalz, Haisaufschwemmung und tierisches Fett,oder i'alg enthält. Die Maisaufschwemmung kann gegebenenfalls durch Kaliumdihydrqrpfeosphat und Thiamin ersetzt werden. Erhebliche Gitronensäureausbeuten werden nicht bei Fettgehalten unter etwa 5 Gew.-^ erhalten. Gehalte bis herauf zu 50 Gew.-ji können gewünschtenfalls angewendet werden, doch werden Gehalte von etwa 5 bis 20 Gew.-$ zur Erzielung optimaler Ergebnisse besonders bevorzugt.

Bei Fermentationen im großen Maßstab ist von Bedeutung, daß das Mährmedium in geeigneter Weise belüftet wird und die Zellen in einem guten Kontakt mit sowohl der wäßrigen Phase, die den assimilierbaren Stickstoff und die Mineralien enthält, als auch andererseits mit dem das Fett enthaltenden Material gehalten werden, »/eil das fettige Material mit der wäßrigen .Phase unmischbar ist, ist es vorteilhaft, es in einer dispergierten Form in dem wäßrigen Medium während der Fermentation zu halten.

_-Jiii Devorzugtes iiittel zur Erreichung der vorstehend angegebe-

409846/0816

ilen- Ziele ist die submerse Fermentation, und zwar unter schnellem Rühren des Gemischs, während gleichzeitig Sauerstoff dureh das Gemisch, geleitet wird, z.B. durch Berieseln. Um eine gute Dispersion des Fetts sicherzustellen, kann in dem Nährmedium außerdem ein Netzmittel enthalten sein.

Die Fermentation findet im allgemeinen für etwa 2 Ms 8 Tage bei einer '.temperatur von etwa 25 bis 29°C statt. Obwohl die" Fermentation bei Kaumtemperatur durchgeführt werden kann, und zwar bei irgendeiner Temperatur zwischen 20 und 37 G, wird der vorstehend angegebene Temperaturbereich bevorzugt, weil eine zu niedrige 'i'emperatur eine zu lange Fermentationszeitspanne erfordert und eine zu hohe Temperatur zu einem fortwährenden Verlust von «Vasser aus dem Nährmedium führt und dadurch eine ständige Überwachung erforderlich macht, um einen geeigneten Wassergehalt zu erhalten.

Bei der Erfindung werden so hohe Ausbeuten wie 49 $ (bezogen auf das Gewicht des Fetts) von Citronensäuremonohydrat erzielt. Die Citronensäure wird im allgemeinen als unlösliches Oalciumsalz isoliert, das zum Teil durch Umsetzung mit dem in dem Nährmedium während der Fermentation vorhandenen Oalciumcarbonat und durch Zugabe von Calciumcarbonat oder Kalk am Ende der Fermentation gebildet wird.

hier auf die Gewinnung von Citronensäure aus dem Nährmedium hingewiesen wird, bo soll diese Ausdruckswei.se die Gewinnung in der Form eines löslichen oder unlöslichen Salzes sowie auch die Gewinnung von Citronensäure per se erfassen.

i)ie wäßrige Phase wird von den Hefe zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, und die Citronensäure wird von der wäßrigen Phase durch Verdampfen und Ausfällen in Form der freien Säure oder durch Ausfällen mit CaCO, oder Kalk als xricaleiumsalz oder mit BaCO., oder BaO als unlösliches Barium- · salz abgetrennt.

Methoden zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Citronensäure werden im folgenden angegpbpr., 7.^ro"b°i reine Proben

409846/0815 ' .

von- Citronensäure und Isocitronensäure Voraussetzungen sind. Die G-aschromatographie ist eine empfindliche Methode zur Differenzierung und Bestimmung der Isocitronensäuremenge in Gegenwart von Citronensäure.

Analysenmethoden I.· Papier Chromatographie

Die unten angegebenen Systeme stellen ein bequemes halbquantitatives Mittel dar zur Bestimmung von Citronensäure in Fermentationsmedien. Konzentrationen von Citronensäure auch unter g je Liter Nährmedium, d.h. von 1 mg/ml Nährmedium, können leicht nach dieser chromatographischen Methode ermittelt werden.

!♦ Lösungsmittelsyatem A

Dieses Lösungsmittelsystem ist ein Gemisch (bezogen auf das Volumen) von 80 Teilen Methyläthylketon, 6 !Teilen Aceton, 12 Teilen destilliertem Wasser und 2 Teilen Ameisensäure. Citronensäure zeigt bei diesem System einen R^-Wert von etwa 0,59 bis 0,64.

2. Lösungsmittelsyatem B

Dieses Lösungsmittelsystem besteht (bezogen auf das Volumen) aus 1 Teil Ameisensäure, 2 Teilen Cineol und 3 Teilen n-Propanol. Der R_f-Wert von Citronensäure bei diesem System ist etwa 0,40 bis 0,45·

3» LösungBmittelsystem C

Dieses Lösungsmittelsystem besteht aus einem Wasser gesättigte Ameisensäure - Äthergemisch, das durch Schütteln eines Gemische von 2100 ml Xthyläther, 300 ml Ameisensäure und 275 ml '«fässer in einem Scheidetrichter gebildet wird. Nach dem Schütteln wird die obere Lösungsmittelschicht als chromatographisches Lösungsmittel benutzt. Der R«-v/ert von Citronensäure bei diesem System ist etwa 0,30 bis 0,35.

Eine Probe von 5 bis 10 Mikroliter der wäßrigen Phase des Ablaufs, der von dem Fermentationsmedium, wie oben beschrieben ist, abgetrennt worden ist, wird bei 80⁰C im Vakuum getrocknet, um irgendwelche Isocitronensäure in das Lacton

409846/0815

umzuwandeln, wieder in tfasser gelöst, auf das Papier gebracht, und das Chromatogramm wird in der üblichen V/eise erhalten. Im allgemeinen kann Whatmann-Nr.-1-Papier als Absorptionsmittel und Bromcresol-Grün als Indikator (hergestellt durch Lösen .von 0,25 g-Broacresol Grün in 400 ml Aceton und Einstellen der Lösung auf die grüne Farbe) bei diesen Analysen verwendet werden. In allen Fällen wird eine Üitronensäurestandardprobe als Vergleich bei jedem Ohromatogramm mitlaufengelassen.

II. Pentabromaoetonanalyae

Verschiedene Methoden, bei denen Pentabromaoeton gebildet wird, können zur Bestimmung von Citronensäure in Gegenwart von Isocitronensäure benutzt werden. Bine bevorzugte Methode ist von H.A.Krebs in Biochem. J. £i, 7B (1953) und in Methode in Enzymology, Volumen XIII, herausgegeben von J.M.Lowenstein, Seite 515, beschrieben.

III. Gasohromatogra-phie

Diese ist eine andere quantitative Methode zur Bestimmung von Citronensäure und Isocitronensäure, die für das Yerfahrensprodukt benutzt worden ist. Die Analyse wird in einem Gaschromatographen (Pye Modell 104)» der mit einem Flammionisationsdetektor ausgestattet ist, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt»

Säules Glas, 2,1 m χ 0,6 cm, gefüllt mit 3 # OV17 auf Chrom W (HP)

Säulentemperaturs 140 - 150⁰C
temperatur des Bestimmungsblocks» 230⁰C Strömungsgescriwindigkeit von Helium» 50 ml/min Strömungsgeschwindigkeit von Wasserstoff» 50 ml/min. Strömungsgeschwindigkeit von Luft» 5üO ml/min Probengröße» 10 Mikroliter

üiine Standardprobe wird hergestellt, indem zunächst 60 mg wasserfreie Citronensäure und 1,8 mg Isoeitronensäure genau abgewogen werden. Dieses Material wird in 3,0 ml l'etrahydro-

409846/0815

furan (THF) gelöst, und es werden 20/ul Schwefelsäure zugegeben, gefolgt von 1,0 ml N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA). Das Gemisch wird dann auf 60⁰G für 1 Stunde erwärmt, und eine lQ-yul-Portion wird in den Gaschromatographen injiziert. Das so erhaltene Ghromatogramm zeigt Maxima, die der Citronensäure und der Isooitronensäure entsprechen, und die Bereiche unter den Maxima werden in einfacher V/eise mittels eines Integrators berechnet» der mit dem Gaechromatographen verbunden ist.

Eine Prob· τοη der wäßrigen Phase des Ablaufs, abgetrennt von dem iermentationenährmedium, wird dann entnommen, und 1,0 ml wird für wenigstens 4 Stunden gefriergetrocknet. Zu dem trocknen Rückstand werden 10 ml 'JHF, 100/ul Schwefelsäure und 10 Glaskugeln gegeben. Das Gemisch wird stark geschüttelt, um ein Lösen des trocknen Rückst^tands sicherzustellen, 3,0 ml der !lösung werden in ein Glasf lasche hen gegeben, 1,0 ml BSA wird zugegeben, und das Gemisch wird behandelt und der Gaschromatographie unterworfen genauso, wie es für die Standardprobe oben beschrieben ist.

Das Verfahren der Erfindung erfaßt auoh die Verwendung von Candida lipolytioa-Mutanten oder -Varianten, die durch verschiedene chemisch« und physikalische Mittel gebildet worden sind« vorausgesetzt natürlich, daß diese Mutanten und Varianten das spezielle Gitronensäure-Aklcumulationsvarmögen zeigen. Solche Mutanten werden durch !Techniken, wie z.B. durch Be- ' strahlen mit Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen, Behandlung mit Stickstofflosten (nitrogen mustards) und organischem Peroxid und andere ähnliche Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, gebildet«

Außerdem wird die Verwendung von Subkulturen^ natürlichen Mutanten und Varianten und dergl. zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung vorgeschlagen.

iiie nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, doch ist die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.

409846/0815

Beispiel 1 A· tiersteilung von Impfmaterial , erste Stufe ·

Die folgenden bestandteile werden in Wasser gelöst, 500 ml werden je iJ'ernbach-Kolben abgefüllt und bei 121⁰O für 45 Hinuten bei einem Druck von etwa 1 at sterilisiert.

g/Liter

SO₄ " 4,0

₄7H₂O 0,25

KH₂PO₄ 0,5

Calciumphytat 0,5

CaCO₅ 5,0

Glukose 75,0

Thiaminhydrochlorid 300 meg

Leitungswasser . 1 Liter

In das vorstehend angegebene Nährmedium in den Pernbach-Jiolben wird eine Suspension von Candida lipolytioa ilÄRL Y-1094 eingeimpft, geerntet von einer Kartoffel-, Dextrose-, Hefeextrakt-Schrägagarkultur. Die KoIwen uerden auf einem Drehschüttler bei 28⁰G für etwa 48 Stunden geschüttelt.

B. Herstellung des Impfmaterials, zweite Stufe

Die nachfolgend angegebenen Bestandteile werden in einen zylindrischen Permentationskessel mit einer Größe von 17,8 cm χ 22,9 cm mit einem Volumen von etwa 4 Litern eingetragen. Ein zentral angeordneter Rührschaft trägt 3 Flügel mit einer Breite von 2,1 cm, die sich 3,6 cm von dem Schaft aus erstrecken und * um 40° von der Horizontalen geneigt sind.

Maisaufschwemmung 10 g'

Ammoniumsulfat 8 g

Wasser 2 Liter

Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 5,0 werden die folgenden Bestandteile zugegeben:

Calciumcarbonat 30 g

l . . 155 g

4 0'9 846/0815

Mach, dem Sterilisieren für 45 Minuten bei 121 G bei einem Druck von etwa 1 at werden in das Nährmediuni etwa 100 ml der nach der Beschreibung- unter A erhaltenen Hef ezellenkultur eingeimpft·

Sterile Luft wird direkt unter dem Hührschaft eingetragen, der mit einer Geschwindigkeit Ton 1725 rpm gedreht wird. Der Belüftungsgrad wird auf 115 Liter je Stunde je 5,78 Liter Nährmedium eingestellt, und die Kultivierung wird für etwa 48 Stunden bei 25 - 26⁰G durchgeführt.

C. Fermentation

Me nachfolgend angegebenen Materialien werden in einen Fermentationskessel eingetragen, der dem unter B. beschriebenen Kessel gleich ist.

Shiaminhydrochlorid 2 mg

MgSO₄-7H₂O 400 mg CaCO₃ 34,4 g

i'alg 310 g Wasser 2 Liter

Harnstoff (8,1 g) und KH₂PO₄ (1,5 g) werden kombiniert und in 50 ml Wasser gelöst, sterilisiert und dem liest des getrennt sterilisierten ilährmediuma vor dem Einimpfen zugegeben. In das vorstehend angegebene Nährmedium werden 100 ml der nach B hergestellten Hefezellenkultür eingeimpft. Das Währmedium wird, wie unter B angegeben ist, belüftet und gerührt, und die Fermentation kann für etwa 90 Stunden bei 25 - 26 C vonstatten gehen. Die von den drei Fermentationskesseln erhaltene gemeinsame Menge üitronensäuremonohydrat beträgt 468 g (Gewichtsausbeute, bezo_aen auf i'alg = 49»O6 #), bestimmt durch Gas-flüssig-Ohromatographie.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt mit der Ausnahme "jedoch, daß das ifährmedium bei der Herstellung des Impfmaterials A in der ersten Stufe durch ein iiährmedium ersetzt wird,

409846/0815

das KZ Amine YTiD in einer i»ienge von 5 g je Liter "bei einer Beschickung von 600 ml je Pernbach-Kolben enthält, dem dann 35 g Talg je Kolben zugegeben werden. In dem Mahrmedium für das Impfmaterial B in der zweiten Stufe wird der Talg durch 155 g "Laüenfett" ersetzt. In dem letzten ifährmedium C bei der Fermentation wird der T-alg durch 387,5 g "Ladenfett" ersetzt. üach .fermentation für 64 Stunden beträgt die in den beiden Fermentationskesseln gebildete gemeinsame !»!enge Citronensäuremonohydrat 3ü3,7 g (Gewichtsausbeute, bezogen auf das "Ladenfett" = 38,4 ⁶Io) , bestimmt durch G-as-flüssig-Chromatographie.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wird mit Candida lipolytica ATOG 8661 anstelle von Candida lipolytica NREL Y-1094 wiederholt, wobei eine Citronensäuremonohydrat-Endkonzentration von · 66 g je Liter, bestimmt durch G-as-flüssig-Chromatographie, erhalten wird.

Im wesentlichen die gleichen Ergebnisse werden bei Einsatz jeweils der folgenden Candida lipolytica.Stämme erzielt:

ATCC 8662

ATCC 9773

CBS-2073, Stamm Verona

UBS-2Ü70, Stamm Polacci

CBS-2071, Stamm Zach

CBS-2078, Stamm Bruyn -

IMI 93743

ATCC = American Type Culture Collection, Äockvill, Maryland GBS = Centraal-bureau voor Schiiimielculture, Baarn, Niederlande = northern Regional Research Laboratories, Peoria,Illinois = Imperial iviyc ο logical Institute, Kew, England

Patentansprüche 409846/0815

Claims (3)

1. Pat entanspriiohe

   Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch aerobes Fermentieren eines Citronensäure akkumulierenden Stamms von Candida lipolytica in einem wäßrigen iiährmedium, enthaltend eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilier- » baren Stickstoff, Vitamine und Mineralien, dadurch gekennzeichnet, daß man ausgelassenes Jett (Talg) oder unbehandeltes tierisches tfett als Hauptquelle für den besagten assimilierbaren kohlenstoff verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der angewendete Candida lipolytica-Stamm Candida lipolytica Y-1094 ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der angewendete Candida lipolytiea-Staaim Candida lipolytica ATiDC 8661 ist.

   Dr.Ve/La

   409846/0815