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Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure Die vorliegende Brfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Fermentation, bei
dem man einen geeigneten, Zitronensature ansammelnden Hefestamm auswählt, den Stamm
in einem waßrigen kohlehydrathaltn Nåhrmedium kultiviert und die angesammelte Zitronensäure
daraus gewinnt.
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Wegen ihrer leichten Assimilation, Schmackhattigkeit und geringen
Giftigkeit ist Zitronensäure eine der um weitesten verbreiteten Sauren in der Nahrungsmittelindustrie
und der pharmazeutischen Industrie. Die Säure wird vielfach als saurer Bestandteil
fur Getränke und ferner als Antioxydationsmittel zur Verhinderung des Ranzigwerdens
von Fetten und Ölen verwendet. Sowohl die Saure als auch ihre Salze werden als Puffersubstanzen
bei der Herstellung von Marmeladen, Gelees und Gelatine-prparaten sowie als emulgierende
Mittel und Stabilisatoren in verschiedenen Nahrungsmittelprodukten verwendet.
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Der größte Teil der in der Welt benötigten Zitronensäure wird durch
Kohlehydratfermentationsverfahren hergestellt.
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Die am häufigsten bei diesen Verfahren verwendeten Mikroorganismen
sind ausgewählte Stämme von Aspergillus niger.
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Diese Fermentationsverfahren mit Aspergillus niger sind zwar interessant,
jedoch treten viele Schwierigkeiten auf Nach einer gewissen Zeit nimmt beispielsweise
die Fahigkeit der Aspergillus niger-Kultur zur Bildung von Zitronensaure leicht
ab. Von größerer Bedeutung ist die Tatsache, daß eine verhaltnismaßig lange Zeit,
im allgemeinen mehr als 7 Tage, zur Herstellung von großen Mengen Zitronensaure
durch Fermentation mit Aspergillus niger erforderlich sind.
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Diese lange Fermentationszeit ist einer der Hauptfaktoren, die für
die hohen Produktionskosten der Zitronensaure verantwortlich sind Die Entwicklung
eines schnellen Fermentationsverfahrens zur Herstellung von Zitronensäure war daher
von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung.
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Uberraschenderweise wurde nun gefunden, daß bestimmte Hefestämme,
insbesondere osmophile Hefestamm¢, z.B. der Gattungen Candida, BndoEycopsis, Torulopsis,
Hansenula und Pichia, die Fähigkeit haben, wahrend der aeroben Fermentation von
wäßrigen kohlehydrathaltigen Medien wesentliche Zitronensäuremengen, d.h. mehr als
1 g pro 1 des Mediums, anzusammein. Diese Hefestämme sammeln noch grßere Zitronensäuremengen
an, wenn das Fermentationsmedium mit verschiedenen halogenhaltigen Mitteln versetzt
wird. Von M. Ogur u.a, wurde in Biochemical and Biophysical R sarch, Bd. 14, S.
193 (1964) berichtet, daß bestimmte Stämme von Saccharomycels in der Lage sind,
Zitrat anzusammeln, jedoch sind die angegebenen Konzentrationen (lediglich mg pro
Liter) unzureichend und nicht von wirtschaftlichem Interesse.
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Demgegendber bilden die Hefestimme der vorstehend angefthrten Gattungen
bei der aeroben Fermentation von waBrigen kohlehydrathalttgen Medien wesentliche
Mengen an Zitronensäure in bemerkenswert kurzen Zeiträumen. Die vorliegende Erz
in dung stellt ein schnelles Fermentationsverfahren zur Herstellung
von
Zitronensäure bereit.
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Bei der Klassifizierung der erfindungsgemaß eingesetzten Hefen wurden
die in «The Chemistry and Biology of Yeasts", herausgegeben von A.H. Cook, Academic
Press, Inc., New York, 1958 und "The Yeasts. A Taxonomic Study", von J. Lodder und
N.J.W. Kreger-van Rij, North Holland Publ., Amsterdam, 1952, beschriebenen Systeme
eingehalten.
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Als halogenhaltige Mittel, die nach einer bevorzugten Ausfuhrungsform
dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, können verschiedene halogenierte organische
Verbindungen eingesetzt werden. Zu den Verbindungen, die als besonders wirkungsvoll
ermittelt wurden, gehören die in °G-Stellung durch Chlor oder Fluor substituierten
niederen Alkanmono- und -dicarbonspuren sowie deren wasserlösliche Salze und Amide.
Von diesen Mitteln werden Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure, Chloressigsäure,
Fluoressigsåure, Chlorbernsteinsaure und deren Salze und Amide bevorzugt ot-Halogenierte
Mono- und Dicarbonsauren mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen und deren Salze und Amide
bewirken eine Steigerung der Ansammlung von Zitronensaure bei der aeroben Fermentation
von wäßrigen kohlehydrathaltigen Medien durch Zitronensäure ansammelnde Hefen, wenn
sie dem Fermentationsmedium zugesetzt werden.
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Natürlich können auch Ester oder andere Derivate, die entweder durch
die Mikroorganismen selbst oder durch Umsetzung mit dem Medium leicht in die entsprechende
Saure oder das entsprechende Salz umgewandelt werden, verwendet werden.
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Wenn daher o4 -halogenierte Ester verwendet werden, führt selbst eine
Teilhydrolyse im Medium zur Bildung von genügend «-halogenierter Saure, um den erwunschten
Effekt der Erhöhlung der während der Fermentation angesammelten Zitronensäuremenge
zu erzielen.
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Die verwendbaren Salze sollen zwar wasserlöslich sein; bei den angewendeten
Konzentrationen und dem angewendeten pH-Wert erfüllen jedoch die meisten Salze diese
Definition.
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Typische Salze, die verwendet werden können, sind die Natrium-,
kalium-,
Ammonium-, Lithium-, Calcium-, Barium und Aminadditionssalze.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmaßigerweise zunächst damit
begonnen, daß man ein Inokulum der geeigneten Hefe herstellt. Dann wird ein Teil
des Inokulums zu dem waßrigen Fermentationsmedium gegeben, das herkömmliche Nahrstoffe,
z B eine assimilierbare Stickstoffquelle, Kohlehydrat und vorzugsweise Calciumcarbonat,
enthalt.
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Die Fermentation wird dann aerob bei 20 bis 37°C geschüttelt, wobei
eine Temperatur von 25 0C bevorzugt wird, bis sich Zitronensaure in dem Medium ansammelt.
Ausgezeichnete Ergebnisse werden oft schon in kurzer Zeit, z.B. inl40 bis 72 Stunden,
erzielt.
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Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mediums während der Fermentation
bei 1,5 bis 8,0 gehalten, wobei ein pH-Bereich von etwa 2 bis 7 bevorzugt wird.
Sobald sich wahred der Fermentation Zitronensaure bildet, setzt sie sich mit dem
Kalziumcarbonat unter Bildung von sich aus dem Fermentationsmedium abtrennendem
unlöslichem Ralziumzitrat und Kohlendioxyd um, von dem ein Teil durch die sich fortpflanzenden
Hefezellen assimiliert wird.
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In den Fällen, wo wesentliche Mengen an Zitronensaure hergestellt
werden, wird die Saure im allgemeinen nach bekannten Verfahren als unlösliches Kalziumzitrat
isoliert. Der herausragende Vorteil des erfindungsgemaßen Fermentationsverfahrens
gegenüber den bisherigen Verfahren zur Herstellung von Zitronensaure ist seine Eintachheit
und Schnelligkein.
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Die Ausbeute an Zitronensaure wird wesentlich verbessert, wenn das
Fermentationsmedium mit wirksamen Mengen der angegebenen halogenhaltigen Mittel
versetzt wird.
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Das Hefe-Inokulum kann hergestellt werden, indem man Hefezellen von
einem Schragnahrboden etwa 24 Stunden unter aeroben Bedingungen in einem waßrigen
PermentationsmedUm, das ein assimilierbares Kohlehydrat, im allgemeinen Glukose,
eine
assimilierbare Stickstoffquelle, vorzugsweise Pepton, einen Hefeextrakt und Natriumchlorid
enthalt, züchtet. Die Brühe wird gewöhnlich während der Fermentation bei Raumtemperatur
gerührt, und der endgültige pH-X{ert des Mediums nach einem Zeitraum von 24 Stunden
liegt gewöhnlich bei etwa 4>5. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Hefezellen wird
periodisch durch Zentrifugieren der Brühe während 15 Minuten bei etwa 2.000 g bestimmt.
Im allgemeinen wird eine Dichte der Hefezellen von 0,5 ccm Hefezellen pro 15 ccm
Brühe bevorzugt, bevor die Brühe zur Inokulation verwendet wird.
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Nach etwa 24-standigem Rühren der vorstehenden Inokulationskultur
bei Raumtemperatur wird ein Teil der Kultur zu dem waßrigen Fermentationsmedium
gegeben, das ein Kohlehydrat und einenassimilierbaren Stickstoff enthalt. Kohlehydrate,
z.S. Kartoffel- oder Maisstarke, Melasse, Saccharose, Glukose, Maltose, Dextrin,
Fruktose und Galaktose, werden bebevorzugt Wegen ihrer Erhaltlichkeit und geringen
Kosten wird im allgemeinen eine Melasse als Kohlehydratquelle bevorzugt, und es
werden Mengen verwendet, die etwa bis zu 50 Gew.-Zucker entsprechen. Wo höhere Zuckerkonzentrationen
verwendet werden, wird die Fermentation vorzugsweise mit einem osmophilen Hefestamm
durchgeführt.
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Ein weiterer, außerordentlich bedeutender Vorteil des erfindungsgemäßen
Verfahren liegt in der Tatsache, daß eine Vorbehandlung der Melasse zwecks Einstellung
der Metallionen nicht notwendig ist. Wie weitgehend bekannt ist, sind die bisherigen
Zitratfermentationen, die mit Melasse arbeiten, außerordentlich empfindlich gegenüber
Metallionenverunreinigungen und machen es erforderlich, daß die Melasse vor der
Verwendung vorbehandelt und entsprechend gereinigt wird. Siehe z.B. D.S. Clark,
Industrial and Engineering Chemistry Product Research and Development, Band 1, J.
59 (1962).
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Als erhältliche Stickstoffquelle können stickstoffhaltige organische
Materialien, wie z.B. Wetzenschrot, Sojabohnenmehl, Harnstoff, Aminosauren, Peptone
und enzymatisch abgebaute
Proteine verwendet werden. So stellt
z.B. das im Handel erhaltliche YTT, ei-n Kasein-Pepton-Produkt, das vo-n der Firma
Sheffield Chemical Co., Norwich, New York, geliefert wird, eine brauchbare Quelle
für assimilierbaren Stickstoff dar. Im allgemeinen werden 1 bis 20 g dieses Peptonpräparates
pro Liter Medium verwendet. Anorganische Verbindungen können ebenfalls als assimilierbare
Stickstoffquellen dienen. Von diesen wird Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid
bevorzugt.
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Die folgenden Mineralkationen und -anionen sind ebenfalls für das
Wachstum der Hefen günstig Natrium, Kalium, Kobalt, Phosphat und Sulfat. Es ist
weitgehend bekannt, das Spurenmengen von verschiedenen Vitaminen, wie z.B. Biotin,
auch eine Rolle beim Zellenwachstum spielen. Viele dieser Spurenvitamine und wesentliche
Mineralien sind als Verunreinigungen in rohen Stickstoff- und Kohlenstoffquellen
zugegen, und daher ist es gewöhnlich nicht notwendig, sie einzeln in das Fermentationsmedium
einzuarbeiten. Kalziumcarbonat fördert ebenfalls das Wachstum der Hefezellen und
wird im allgemeinen zu dem Medium gegeben.
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Man laßt die Fermentation gewöhnlich etwa 40 bis 72 Stunden unter
Rühren bei etwa 20 bis 370C aerob ablaufen, wobei eine Temperatur von etwa 25 0C
bevorzugt wird. Bs kann zwar jede beliebige aerobe Inkubation angewendet werden,
jedoch wird im allgemeinen eine regulierte Belüftung, beispielsweise Rühren unter
Luft oder Durchführen von Luft durch das Fermentationsmedium, bevorzugt. Zwar wird
die aerobe Fermentation im allgemeinen vorgezogen, es ist jedoch auch möglich, sie
unter aneroben Bedingungen unter Verwendung eines an eren oxydierenden Mittels als
Sauerstoff als Wasserstoffakzeptor durchzuführen.
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Wahrend der Fermentation wird der pH-Wert des Mediums bei etwa 1,5
bis 8,0, vorzugsweise etwa 2,0 bis 7,0, gehalten.
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Wahrend der ersten Stadien der Fermentation sollte der pLl-Wert vorzugsweise
nicht zu niedrig sein, z.B. nicht unter etwa 3,0 liegen, da sonst ein nur unzureichendes
Hefewachstum
stattfindet. Nachdem jedoch ein ausreichendes Hefewachstum
sichergestellt wurde, wird der pH-Wert innerhalb der oben angegebenen Grenzen gehalten.
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Werden wesentliche Mengen an Zitronensäure hergestellt, so kann die
Saure nach verschiedenen bekannten Verfahren aus dem Fermentationsmedium gewonnen
werden. Im allgemeinen versetzt man das Fermentationsmedium vorzugsweise mit Kalziumcarbonat,
gewöhnlich in einer Menge von 5 bis 25 g/l des Permentationsmediums. Bei der Bildung
der Zitronensäure setzt sie sich metathetisch mit dem Kalziumcarbonat zu Kohlendioxyd
und unlöslichem Kalziumzitrat um, das dann leicht aus dem Fermentationsmedium entfernt
werden kann. Ein Teil des freigesetzten Kohlendioxyds wird durch die Hefezellen
metabolisiert und fördert auf diese Weise deren Wachstum im Medium. Anstelle von
CaC03 kann auch BaCO3, BaO, CaO, NaOH und KOH verwendet werden.
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Es wird darauf hingewiesen, daß der im vorliegenden und in den Ansprüchen
verwendete Begriff "Gewinnung von Zitronensäure aus dem Medium" sich sowohl auf
die Gewinnung in Form eines Salzes, wie z.B. des Kalziumsalzes, als auch auf die
Gewinnung von Zitronensaure als solche bezieht. Die Salze kö4Sn zweckmaBigerweise
nach bekannten Verfahren in die freie Säure umgewandet werden.
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Wie bereits erwähnt, führt die Zugabe von bestimmten halogenhaltigen
Mitteln, z.B. Fluoracetat und Fluoracetamid, zu dem Fermentationsmedium zu verbesserten
Ausbeuten an Zitronensäure In den meisten Fällen bewirken schon geringe Mengen von
5 bis 10 x 10 4 Mol des halogenhitigen Mittels pro Liter des Mediums eine Verbesserung
der Ausbeute an Zitronensäure.
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Bei der vorliegenden Erfindung wird unter einer Zitronensäure ansammelnden
Hefe eine Hefe verstanden, die wenigstens 1 g Zitronensäure pro Liter Medium unter
den beschriebenen Fermentationsbedingungen ansammelt. Die Verwendung eines Hefestamms,
der weniger als 1 g Zitronensaure pro Liter des Mediums ansammelt, ist von geringer
oder gar keiner praktischen
Bedeutung.
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Nachfolgend werden die analytischen Verfahren angegeben, die zur Bestimmung
dienen, ob ein Hefestamm in der Lage ist, wenigstens 1 g Zitronensgure pro Liter
des Mediums anzusammeln oder nicht. Die nachfolgend angegebenen anaJytischen Verfahren
sind mehr als genau genug, um diese Menge an Zitronensaure festzustellen.
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Bei der Bestimmung, ob ein Hefestamm in der Lage ist, eine solche
Menge Zitronensäure anzusammeln, wird ein Inokulum des Hefestamms aus einem -entsprechenden
Schragnährboden hergestellt. Ein Teil des Inokulums wird dann zu dem Permentationsmedium
gegeben, und die Hefe wird darin unter aeroben Bedingungen bei etwa 25 bis 28°C
kultiviert. Der pH-Wert des Medlinis wird bei etw-a 2 bis 7 gehalten. Sowohl das
Inokulations- als auch das Permentationsmedium werden vor-der- Zugabe der Hefezellen
dadurch sterilisiert, daß man sie in einem Dampfautoklaven 20 Minuten bei 1,4 atü
erhitzt. Obgleich das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren gewöhnlich ziemlich
schnell abläuft, läßt man die Fermentation bei der Auswahl der Stämme etwa 3 bis
7 Tage ablaufen, um sicherzustelzen, daß alle Hefestämme mit einem hohen Produktionspotential
gefunden werden.
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Das zur Untersuchung verwendete Fermentationsmedium ist im wesentlichen
mit dem bereits beschriebenen Medium identisch.
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Bs können die gleichen Kohlehydrate verwendet werden. Im allgemeinen
wird vorzugsweise ein Kohlehydrat verwendet, das keine Verunreinigungen enthalt,
die dazu neigen können, den Versuch zu stören, obgleich dies im Hinblick auf die
zu bestimmende Zitronensäuremenge nicht kritisch -ist, und auch rohe Kohlehydratquellen,
wie Melasse verwendet werden können.
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Cerelose, eine im Handel erhältliche Dextrose, die von der Firma Corn
Products Sales Co., N.Y., N.Y.,geliefert wird, erwies sich als zweckmäßige Kohlehydratquelle.
Bin typisches Fermentationsmedium, das für die Untersuchung von Hefen auf ihre Fähigkeit
zur Ansammlung von Zitronensäure während der Kohlehydratfermentation brauchbar ist,
hat die folgende Zusammensetzung:
g/l Medium Cerelose 150 Pepton
(Bacto)* 15 Hefeextrakt* 5 NaCl 4 CaC03 10 Leitungswasser ad 1 Liter * Erhältlich
von den Difco Laboratories, 920 Henry St.-Detroit, Mich. 48201 Das erhaltene Medium
wird sterilisiert, indem man es 20 Minuten in einem Dampfautoklaven bei 1,4 atü
erhitzt. Nach der Sterilisation beträgt der endgültige pH-Wert etwa 7,4. Bine Reihe
von 300 ccm Erlenmeyer-Kolben werden mit 25 ccm des Mediums gefüllt und mit Hefezellen
inokuliert. Nachdem man die Fermentation 5 bis 7 Tage hat fortschreiten lassen,
werden die Kolben aus dem Rotationsschüttler entfernt, der pH-Wert wird mit Salzsäure
auf etwa 1,7 bis 2 eingestellt, und der Inhalt wird filtriert oder zentrifugiert,
um die Suspension der Hefezellen zu entfernen.
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Das Filtrat oder die Uberstehende Flüssigkeit werden dann nach den
nachfolgend beschriebenen analytischen Verfahren auf ihren Zitronensäuregehalt analysiert.
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Analysenverfahren 1. Papierchromatographie Die nachfolgenden Systeme
stellen ein zweckmäßiges semiquantitatives Verfahren zur Bestimmung von Zitronensäure
im Fermentationsmedium dar. Nach diesen chromatographischen Verfahren können noch
Konzentrationen an Zitronensäure, die unter 1 g pro Liter des Mediums, d.h. 1 mg
pro ccm des Mediums, liegen, leicht festgestellt werden.
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1) Lösungsmittel system A Dieses Lösungsmittel System ist ein Gemisch
von 80 Volumenteilen
Methyläthylketon, 6 Volumenteilen Aceton,
1.2 Volumenteilen destilliertem Wasser und 2 Volumenteilen Ameisensäure.
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Bei diesem System hat die Zitronensäure einen Rf-Wert von etwa 0,59
bis 0,64.
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2) Lösungsmittelsystem B Dieses Lösungsmäitelsystem besteht aus 1
Volumenteil Ameisensaure, 2 Volumenteilen Cineol und 3 Volumenteilen n-Propanol.
Der Rf-Wert der Zitronensäure bei diesem System liegt bei etwa 0,40 bis 0,45.
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3) Lösungsmittelsystem C Dieses Lösungsmittelsystem besteht aus einem
wassergesättigen Gemisch aus Ameisensäure und Äther, das durch Schütteln eines Gemisches
von 2100 ccm Äthyläther, 300 ccm Ameisensäure und 275 ccm Wasser in einem Abscheidetrichter
hergestellt wird. Nach dem Schütteln wird die obere Ldsungsmittelsctic-ht als chromatographisches
Lösungsmittel verwendet Der Rf-Wert der Zitronensäure bei diesem System liegt bei
etwa 0,30 bis 0,35.
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Eine Probe von 5 bis 10 Mikrolitern des Fermentationsmediums, das
wie vorstehend beschrieben behandelt wurde, wird auf das Papier gegeben, und das
Chromatogramm wird auf übliche Weise entwickelt. Im allgemeinen wird bei diesen
Analysen Whatman-Nr.-1-Papier als Adsorptionsmittel und Bromkresolgrün als Indikator
(hergestellt durch Lösen von 0,25 g Bromkresolgrün in 400 ccm Aceton und Einstellen
der Lösung auf eine grüne Färbung) verwendet. In allen Fällen wird bei jedem Chromatogramm
eine authentische Probe Zitronensäure als Vergleich verwendet.
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II. Analyse mit Essigsäureanhydrid und Pyridin Diese Methode ist von
J. R Marier und M. Boulet i in J.
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Dairy Sci., Band 41, Seite 1683 (1958) beschrieben. Wegen ihrer Binfachheit
wird im allgemeinen diese Methode vorzugsweise zur quantitativen Bestimmung der
Zitronensäuremenge
im Medium verwendet.
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Nachdem die zur Auswahl verwendeten 25 ccm Fermentationsmedium w-ie
vorstehend beschrieben behandelt wurden, wird das Filtrat oder die Uberstehende
Flüssigkeit mit 0,1 n HCl auf 100 ccm verdünnt. Aliquote Teile dieser Lösung werden
dann nach dem in dem vorstehenden Artikel beschriebenen Verfahren auf ihren Zitronensäuregehalt
analysiert.
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III. Gaschromatographie Ein anderes quantitatives Verfahren zur Bestimmung
von Zitronensäure, das verwendet wurde, ist eine Modifikation eines Verfahrens,
das von N.W. Alcock in Anal.
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Biochem., Band 33, S. 2 (t965) beschrieben würde. Diese Analyse wird
mit einem Gaschromatographen vom Typ F und M, Model .500, der mit einem Flammenionisationsdetektor
F und M, Modell 1609, versehen ist, unter den folgenden Bedingungen durchgeftihrt
Kolonne - Aluminium, 183 x 0,63 cm, gefüllt mit 5 % DEGA auf ABS Kolonne T - 170°C
Einspritzöffnung T - 2600c Nachweisblock T - 2600C Heiiumfließgeschwindigkeit -
10,5, abgelesen auf einem Brooks-R-2-1 5AAA-Fließmesser Wasserstoffließgeschwindigkeit
- 8,0, abgelesen auf einem 3rooks-R-2-15AAA-Fließmesser Luftfließgeschwindigkeit
- 12,0, abgelesen auf einem Probe - 5 Mikroliter; Brooks-R-2-15AAA-Fließmesser Eine
Standardkurve wird zunächst dadurch erhalten, daß man exakt die folgenden Zitronensäuremengen
wiegt: 50, 100, 150, 200 und 300 mg. Jede dieser Proben wird mit 10 ccm Bortrifluorid,
die in einer kleinen Menge Äthanol gelöst sind, versetzt. Dieses Gemisch wird 10
Minuten bei 900C erhitzt und gekühlt. Jede Probe wird in einen Abscheidetrichter
gegeben, der ein Gemisch von 10 ccm destilliertem Wasser und 4 ccm
Chloroform
enthält, und 30 bis 40 Sekunden heftig geschüttelt Die untere Chloroformschicht
wird abgetrennt und in ein mit Teflon ausgekiidetes, mit einer Schraubkappe versehes,
10com fassendes Testrohr gegeben. Die wäßrige Phase im Abscheidetrichter wird zweimal
mit Je 3 ccm Chloroform extrahiert, die ebenfalls in das Testrohr gegeben werden.
Ein Teil von 5 Mikfrolltern einer jeden Probe wird in den Chromatographen eingespritzt,
und eine Standardprobe wird dadurch erhalten, daß man die Zitronensäuremenge als
Abszisse und die entsprechenden Gipfelbereiche des Chromatogramms als Ordinate aufträgt,
Die Bestimmung der Gipfelbereiche wird zweckmäßigerweise mittels eines Integrators
vorgenommen, der an dem Gaschromatographen angebracht ist.
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Dann wird eine Probe des Fermentationsmediums entnommen, der pH-Wert
mit konzentrierter Salzsäure auf etwa 2,0 eingestellt, und das Gemisch entweder
zentrifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen. Anschließend
werden 5 ccm der klaren Lösung mit 20 ccm 2,2-Dimethoxyprepan versetzt. Die erhaltene
Lösung wird auf einem offenen Wasserbad, das bei 60 bis 80 0C gehalten wird, zur
Trockne eingedampft. Zu dem trocknen Rückstand werden 10 ccm Bortrifluorid in Methanol
gegeben. Diese Lösung wird auf de genau die gleiche Weise wie die vorstehend-e Standardlösung
behandelt.
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Die Zitronensäuremenge in der Probe wird leicht durch Vergleich mit
der Standardkurve ermittelt.
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Bs wurde hier zwar die Verwendung einer besonderen Gruppe von halogenierten
organischen Verbindungen beschrieben, mit denen die Ansammlung der Zitronensäure
während der Fermentation verbessert wurde, jedoch können auch anderehalogenierte
organische Verbindungen mit dieser Fähigkeit verwendet werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich auch auf die Verwendung
von Hefemutanten oder -varianten, die durch verschieflene chemische und physikalische
Verfahren erhalten werden, sofern sie die angegebene Fähigkeit der Zitronensäureansammlung
haben. Solche Mutanten werden durch Verfahren,
wie Röntgenstrahlen-
und UV-Strahlenbehandlung, Behandlung mit Stickstofflost und organischen Peroxyden
und andere ähnliche bekannte Verfahren, erhalten.
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In den Rahmen der vorliegenden Erfindung fällt auch die Verwendung
von Subkulturen, natürlichen Mutanten, Varianten und dergleichen.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung eingehender erläutern.
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Inokulum-Herstellung Ein Hefezellen enthaltender Schrägnährboden wird
in ein flüssiges Medium gegeben, das aus 150 g Cerelose (Corn Products Sales Com),
15 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 4 g Natriumchlorid und 1 Liter Wasser hergestellt
wurde. Die Hefe zellen werden 24 Stunden aerob unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Ablauf dieser Zeit liegt der pH-Wert bei etwa 4,5. Der Gehalt des Mediums (Spindown)
an Hefezellen wird durch 15-minütiges Zentrifugieren einer 15 ccm-Probe des Mediums
bei 2000 g ermittelt. Wenn eine Hefezellendichte von 0,5 ccm Hefezellen pro 15 ccm
des Fermentationsmediums erreicht ist, wird die Sporensuspension dazu verwendet,
ein entsprechendes Fermentationsmedium zu inokulieren.
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Beispiel 1 Mehrere ccm eines 24 Stunden alten Inokulums der Zitronensäure
ansammelnden Hefe Candida guilliermondii ATCC Nr.
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9058, das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt wurde,
werden zu einem wäßrigen sterilisierten Nährmedium gegeben, das pro Liter Medium
die folgenden Bestandteile aufweist 150 g Cerelose, 10 g Kalziumcarbonat, 4 g Natriumchlorid,
5 g Hefeextrakt (hergestellt von den Difco Laboratories, 920 Henry St., Detroit,
Milch 48201) und 15 g Pepton (Bacto, hergestellt von den Difco Laboratories).
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Das Fermentationsmedium wird funf Tage aerob bei 2 80C geschüttelt.
Die
Ausbeute an Zitronensäure, die in FQrm von unlöslichem Kalziumzitrat und anschließende
Ansäuerung gewonnen wurde, liegt bei 16 bis 17 g pro Liter.
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Beispiel 2 Wird die Fermentation nach Beispiel 1 bei 37 0C statt bei
280C wiederholt, so werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.
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Beispiel 3 Wird die in Beispiel 1 beschriebene Fermentation bei etwa
200C und während eines längeren Zeitraums, z,B. etwa 7-9 Tagen, wiederholt, dann
werden im wesentl-ichen die gleichen Ergebnisse erhalten.
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Beispiel 4 Die Beispiele 1 bis 3 werden unter Verwendung eines wäßrigen
Nährmediums wiederholt, das die folgenden Bestandteile pro Liter Medium enthält
Melasse (Cane Black Strap) mit einem Gehalt entprechend einem Glukosegehalt von
etwa 150 g Kalziumcarbonat 5g YTT * 1 g * YTT ist eine handelsübliche Stickstoffquelle,
die von der Sheffield Chemical Co., Norwich, New York, zu erhalten ist und aus Peptonen
besteht, die beim Abbau von Kasein entstehen.
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Nach etwa 5-tägigem Schütteln des Fermentationsmediums unter aeroben
Bedingungen bei Raumtemperatur werden etwa 15 - 16 g Zitronensäure erhalten.
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Beispiel 5 Das Verfahren der Beispiele 1 bis 3 kann unter Erzielung
im wesentlichen der gleichen Ergebnisse unter Verwendung einer äquivalenten Menge
der folgenden Kohlehydrate anstelle der Cerelose wiederholt werden: Maisstärke Dextrin
Kartoffel stärke Glukose Maltose Fruktose Saccharose Galaktose Beispiel 6 Die Verfahren
der Beispiele 1 bis 3 kann unter Erzielung von im wesentlichen den gleichen Ergebnissen
unter Verwendung einer äquivalenten Menge der folgenden assimilierbaren Stickstoffquellen
anstelle des Difco-Peptons wiederholt werden: Sojabohnenmehl Harnstoff Baumwollsamenmehl
Ammoniumchlorid enzymatisch abgebautes Protein Ammoniumsulfat Aminosauren Ammoniumnitrat
Beispiel 7 Die Fermentation in Beispiel 1 wird unter Zusatz von 0,10 g Natriumfluoracetat
(1 x 10 3 Mol) zu der Fermentation wiederholt.
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Die nach 5 Tagen gewonnene Ausbeute an Zitronensäure beträgt etwa
20 bis 21 g.
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Beispiel 8 Wird die in Beispiel 7 beschriebene Fermentation wiederholt,
und wird anstelle des Natriumfluoracetats eine äquivalente Menge (1 x 10 3 Mol)
der folgenden Verbindungen verwendet, so werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse
erhalten: Pluoressigsäure Fluoracetamid
Kal iumfluoracetat Bariumfluoracetat
Beispiel 9 In Tabelle I sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten werden, wenn
Inokula der aufgeführten Hefestämme, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren
hergestellt wurden zur Fermentation des folgenden Fermentationsmediums verwendet
werden: Cerelose 150 g Pepton (Bacto-Difco) 15 g Hefeextrakt (Difco) 5 g NaCl 4g
CaC03 10 g Leitungswasser ad 1000 ml Das Medium wird vor der Inokulation 20 Minuten
bei 1,4 atü sterilisiert, wobei der pH-Wert des Mediums nach der Sterilisatipn bei
etwa 7,4 liegt.
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Tabelle I zeigt auch die Zunahme der Ausbeute an Zitronensäure, die
erzielt wird , wenn 0,10 g Natriumfluoracetat in das Fermentationsmedium eingearbeitet
werden.
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Tabelle 1 Fer- Zitronensäure, g/l men- Mediums Station, mit oh-ne
Hefestamm Nl Zeit> Natriumfluor-Natriumfluoi acetat acetat Endomycopsis capsularis
ATCC 20033 5 10.00 9.25 Hansenula anomala ATCC 20029 7 8,35 6.30 Endomycopsis chodati
ATCC 20030 5 8.35 7.90 Torulopsis sp.5 ATCC 20031 7 12.00 10.25 Candida parapsilosis
ATCC 7333 5 10.10 8.60 Candida albicans ATCC 752 7 14.00 9.00 Pichia fermentans
NRRL Y-1619 7 1.00 0,94 Candida pulcherrima ATCC 9889 7 4.14 3.86
1ATCC:
American Type Culture Collection, Washington, D.C.
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NARLs Northern Regional Research Laboratories, Culture Collection
Section, Fermentation Div., Peoria, 111.
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2Die Fermentationen werden unter aeroben Bedingungen bei 28 C durchgeführt
3Als Analysenmethode wurde die vorstehend beschriebene, mit Essigsäureanhydrid und
Pyridin arbeitende Methode angewendet Beispiel 10 Zur Durchführung der in der folgenden
Tabelle II angegebenen Fermentationen wird das gleiche Medium wie in Beispiel 9
ver wendet, jedoch mit der Abweichung, daß nur 5 g CaC03 darin enthalten sind.
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Die Fermentationsdauer beträgt 3 Tage.
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Tabelle II Zitronensäure, g/l des Mediums Hefestamm Kultur mit ohne
2 Nr. 1 Natriumfluor-Natriumfluoracetat acetat Candida guilliermondii var. membranaefaciens
NRRL 2080 YM53 7.8 3.5 Candida reukaufii CBS 1903 5.0 3.0 Candida lipolytica NRRL
1094 30.3 19.5 Torulopsis magnoliae ATCC 12573 18.5 3.5 ATCC American Type Culture
Collection, Washington, D.C.
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NRRL: Northern Regional Research-Laboratories CBS: Centraalbureau
voor Schimmelculture, Baarn, Holland 2Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin arbeitende
Methode Beispiel 11 Wird das Natriumfluoracetat der Beispiele 9 und 10 durch eine
äquivalente Menge der folgenden Verbindungen ersetzt, so wer den im wesentlichen
die gleichen Ergebnisse wie in Tabelle und II erhalten Fluoressigsäure Kal j~ br«ectat
Eluoracetamid Bariumfluoracetat
Beispiel 12 Werden die in den Beispielen
9 und 10 beschriebenen Fermentationen mit äquivalenten Mengen der folgenden Kohlehydrate
anstelle von Cerelose wiederholt, so werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse
erzielt: Maisstärke DExtrin Kartoffelstärke Glukose Maltose Fruktose Saccharose
Galaktose Beispiel 13 Die Daten in Tabelle III erläutern die Ergebnisse, die erzielt
werden, wenn andere halogenierte organische Verbindungen in das Fermentationsmedium
eingearbeitet werden Der verwendete Hefestamm war ein typischer Zitronensäure ansammelnder
Candida guilliermondii.
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Fermentationsmedium Blackstrap-Melasse 300 g (NH4)2S°4 4 CaC03 l
O g Leitungswasser ad 1000 ccm Der pH-Wert wurde auf 6,2 eingestellt, und die Fermentation
wurde 5 Tage aerob bei 28 0C durchgeführt.
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Tabelle III Halogenierte Itonzentration Ausbeute an organische Verbindung
der halogenier- Zitronensäure, ten Verbindung, g/l g/l Keine -- 12 Natriumchloracetat
0,05 15 Natriumchloracetat 0,10 14 Natriumchloracetat 0,2 14 Trifluoressigsäure
0,05 15 Trifluoressigsäure 0,10 14 Trifluoressigsäure 0,20 14 Beispiel 14 Wenn die
in Beispiel 13 beschriebenen Fermentationen mit den folgenden halogenialtigen Mitteln
vorgenommen werden, so erzielt man im wesentlichen die gleichen Ergebnisse: Chloressigsäure
Natriumchlorsuccinat Chloracetamid Natriumtrifluoracetat Kaliumchloracetat Trifluoracetamid
Chlorbernsteinsäure Bariumtrifluoracetat Beispiel 15 In Tabell e IV sind die Ergebnisse
eingetragen, die erzielt werden, wenn InokuGa der angegebenen Hefestämme, die nach
dem vors@enen@en Ucrf ah ren erhalten wurden, zur Fermentierung der folgenden Meiien
verwendet werden:
Invertmelasse 1 200 g YTT-Pepton 5g Maisquellwasser
1 g CaCO 10 g Leitungswasser ad 1000 g Eine typische Analyse dieses Materials lautet
wie folgt: Sacharose 24w23 % Reduzierende Zucker 53,87 % Gesamtzückergehalt ;r8,10
% Brix 85,00 nach 3 Stunden Baume-Modulus 145 44,86 nach 3 Stunden 02 Zu erhalten
bei der Firma Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.
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Nach der Sterilisation des Mediums liegt der pH-Wert bei etwa 6,0
bis 6,5.
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Eine Reihe von 300 ccm Erlenmeyer-Kolben wurde mit 25 ccm des vorstehenden
Mediums gefüllt und mit dem Hefestamm inokuliert.
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Man ließ die Fermentation 7 Tage aerob unter Schütteln bei 280C fortschreiten.
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Die Analysen wurden mittels der vorstehend beschriebenen papierchromatographischen
Systeme A und C semi-quantitativ durchgeführt. Zur Bestimmung der Zitronensäuremenge
in den Fermentations medien wurde als Vergleichsstandart Lösungen verwendet, die
bekannte Mengen an Zitronensäure enthielten.
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Tabelle IV Geschätzte Menge Zitronensäure im Medium, g/100 ccm Hefestamm
ATCC Kultur, Papierchromatograph. System Nr. A C Endomycopsis capsularis 20033 2,0
2,0 Endomycopsis chodasi 20030 1,0 1,0 Pichia fermantans (NRRL-Y-1o»19) 2,0 1,5
Torulopsis sp. 20031 2,0 2,0 Candida albicans 20032 2,0 2,5 albicans 752 1,5 1,5
albicans 753 1,5 1,5 albicans 201 0,8 0,8 albicans 10259 1,0 1,0 albicans 10261
1,5 1,5 albicans 11651 0,8 0,8 albicans 14053 1,5 1,5 brumptii 10554 0,5 0,5 catenulata
10565 1,0 1,0 curvata 10567 0,5 f-lareri 9375 1,0 1,0 guilliermondii 9390 0,8 0,8
guilliermondii 14242 1,0 1,0 guillier;non-lii 9058 3,0 guilliermondii (NRRL 324)
2,0 guilliermondii var.
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menbranaefaciens (NRRL 2080) 3,0 guilliermondii var.
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fla¼:flbranaefaciens 9766 1,5 1,5 japonica 14437 0,5 krusei var..
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saccharicola 16047 0,5 0,5
Fortsetzung der Tabelle
IV krusoides 7345 1,0 Q,8 krusoides 10/55 10755-6 0,8 0,5 lipolytica 8662 4,0 lipolytica
(Mischkultur) 8661 4,0 lipolytica isolate 8661 4,0 19687-1 lipolytica isolate 19687-2
8661 4,0 meiinii 10568 0,5 monosa (NRRL Y-1079) 0,5 1,0 monosa 2146 0,7 0,7 monosa
9330 0,5 0,7 mycoderma 9888 1,0 1,5 parapsilosis 7330 1,0 1,5 parapsilosis 7333
1,0 1,5 Candida parapsilosis 7336 1,0 1,5 parapsilosis 10265 0,7 0,5 pelliculosa
2149 1,0 0,8 pulcherrima 7696 1,0- 1,0 pulcherrima 7697 1,5 2,0 pulcherrima 9889
1,5 2,0 steilatoidea 11006 0, 9 1,0 tropicalis 1369 1,5 1,5 tropicalis 9968 1,5
1,5 tropicalis 14246 1,5 1,5 zeylaniodes 4933 0,7 0,8 zeylaniodes 7351 0,7 0,7 zeylaniodes
10674 i,0 1,0
Beispiel 26 Die in Tabelle V angegebenen Ergebnisse
erläutern die Verbesserung der Zitronensäureansammlung, die erhalten wird, wenn
verschiedene Hefestamme in dem Fermentationsmedium des Beispieles 15 kultiviert
werden, vorausgesetzt, daß das Medium eine Konzentration von 0,05 g Natriumfluoracetat
pro Liter des Mediums enthält.
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Die Bedingungen, unter denen die Fermentationen und die Analysemethoden
durchgeführt werden, sind mit denen des Beispiels 15 identisch.
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Werden äquivalente engen der nachfolgenden Verbindungen anstelle des
Natriumfluoracetats verwendet, so werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse
erzielt: Bariumfluoracetat Italiumfluorac etat Fluoressigsäure Fluoracetamid
Tabelle
V Geschätzte Zitronensäuremenge im Medium, g/100 ccm mit Natriumfluor- ohne, Natriumfluoracetat
0 05 1 acetat Papierchromato- Papierchromatograp.
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graph. System System Hefestamm ATCC- A B A B Kultur, Nur Candida
albicans 752 2,0 2,0 1,5 1,5 albicans 753 2,0 2,0 1,5 1,5 albicans 2091 1,0 1,0
0,8 0,8 albicans 10261 2,0 2,0 1,5 1,5 albicans 11651 1,0 1,0 0,8 0,8 albicans 14053
2,0 2,0 1,5 1,5 curvata 10567 0,8 0,5 guilliermondii 9390 1,0 1,0 0,8 0,8 guilliermondii
var. membranefaciens 9766 2,0 2,0 1,5. 1,5 kruseides 10755 10755-6 1,5 1,5 0,8 0,5
parasilosis 7333 1,5 1,0 parasilosis 7336 1,5 1,0