DK143569B - Fremgangsmaade til fremstilling af et enzymatisk aktivt fysisk stabilt vanduoploeseligt glucoseisomeraseprodukt - Google Patents

Description

(19) DANMARK (j?)

|p (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT m) 143569 B

Dl REKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5852/75 (51) IntCI.3 C 12 N 11/00 (22) Indleveringsdag 27· aug· 1975 (24) Løbedag 27. aug. 1975 (41) Aim. tilgængelig 29. fet). 1976 (44) Fremlagt 7· 6ep. 1981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. “

(30) Prioritet 28. aug. 1974, 501292, US

(71) Ansøger NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd, DK.

(72) Opfinder Shmuel Amotz, DK: Tage Kjær Nieleen, DK: Niels Otto

Thiesen, DK.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou 8; Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et enzymatisk aktivt fysisk sta= bilt, vanduopløseligt glucosei= someraseprodukt.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et enzymatisk aktivt, fysisk stabilt, .vanduopløseligt glucoseisomerase- produkt ud fra mikroorganismeceller, der udviser glucoseisomerase- -aktivitet, ved hvilken fremgangsmåde et celleprodukt og glutaraldé- hyd bringes i kontakt i et vandigt medium.

Det har længe været erkendt, at anvendelsen af enzymer kun QQ én gang til gennemførelse af en ønsket enzymatisk reaktion kan med-

føre sådanne uforholdsmæssig høje enzym-omkostninger, at gennemførelsen O

ri af reaktionen bliver behæftet med prohibitivt høje omkostninger.

^ I særdeleshed er det kendt, at glucose kan isomeriseres r- enzymatisk til et meget sødere produkt, normalt indeholdende en ^ blanding af glucose og fructose i et forhold på ca. 50:50, men 3 enzym-omkostningerne er høje^ og isomeriseringsmetoden må nødvendig- 2 163569 vis tilpasses efter enzymets karakteristika. Eftersom et genanvendeligt enzym frembyder mulighed for en proces med lave omkostninger, er muligheden for flere ganges genanvendelse af enzymer ikke undgået fagfolks opmærksomhed, og talrige forslag er blevet stillet til stabilisering og/eller immobilisering af både cellulære og cellefri glucoseisomerase-enzymer.

Da genanvendelse af enzym kræver udvinding af enzymet fra reaktionsblandingen, gør man almindeligvis opløselige enzymer uopløselige og knytter dem til en matrix af én eller anden art. Hvad angår glucoseisomerase, der er et intracellulært enzym, er enzymet allerede bundet til eller indesluttet i mikroorganismecellen, men udsivning af enzymet og/eller desintegrering af cellen må normalt undgås. Mikroorganismeceller, især bakterier, er endvidere forholdsvis små, og større partikler ville være mere ønskelige.

Et beslægtet forhold af nogen relevans i forbindelse med isomerisering af glucose er ønskeligheden af at opnå sikkerhed for, at de reagenser, der anvendes til stabilisering eller indeslutning af de glucoseisomerase-holdige celler, ikke vil frigøre stoffer, som har en uheldig eller ødelæggende virkning på den endelige glucose--fruetose-sirup. Nogle af de immobiliseringsmetoder, der tidligere er blevet foreslået, vil aldrig kunne anvendes i kommerciel praksis, fordi reagenserne og reaktionsprodukterne ikke er blevet anerkendt som ikke-toksiske. Det skal dog nævnes, at der i USA-patentskrift nr. 3.779.869 er beskrevet stabilisering af glucoseisomerase-holdige bakterieceller ved omsætning med glutaraldehyd. Andre forslag går ud på at tværbinde forskellige enzymer ved en reaktion med glutaraldehyd.

Det er kendt, at glutaraldehyd reagerer med (amino)nitrogen-holdige materialer, herunder enzymer. Hele celler af glucoseisomerase--mikroorganismer er imidlertid simpelthen ikke tilstrækkeligt reaktive over for glutaraldehyd til tværbinding til multicelle-partikler. Forslag til tværbinding, uopløseliggørelse og immobilisering af enzymer har omfattet medanvendelse af en udefra kommende reaktant med glutaraldehyd (såsom albumin) til covalent binding af enzymer dertil, jf. f.eks. britisk patentskrift nr. 1.257.263. Uheldigvis bevirker tilsætningen af en udefra kommende reaktant i de nødvendige mængder en signifikant fortynding af glueoseisomerasen, hvorved man nedsætter aktiviteten pr. enhed af produktet proportionalt med fortyndingen. Immobiliserede produkter med højere aktivitet pr. enhed kan naturligvis fremstilles, hvis glueoseisomerasen fjernes fra cellen og renses inden immobilisering. Behandlingsomkostningerne og aktivitetstab som følge af behandlingen forøger imidlertid omkostningerne kraftigt for et- 3 143569 hvert produkt med høj aktivitet. Dette forhold er i særlig grad generende i tilfældet med glucoseisomerase. Isomerisering af glucose i industriel målestok kræver meget store mængder af et forholdsvis billigt enzymprodukt med den størst mulige aktivitet pr. enhed. Stabiliserede celler ville synes bedst egnede til formålet, men anvendelse, udvinding og genanvendelse af enkelte celler i industriel målestok er et ingeniørmæssigt mareridt. En anden ulempe ved anvendelse af hele celler er, at transporten af substraterne (glucose og fructose) gennem den intakte cellevæg i meget høj grad giver anledning til diffusionsproblemer. Det har vist sig, at en intakt celle af arten Bacillus coagulans kun udviser ca. 1/3 af den aktivitet, der findes efter fuldstændig lyserende behandling af cellen. Hvis en signifikant genanvendelsesfaktor, f.eks. på 5 eller mere, kan opnås, er det muligt at acceptere en noget nedsat aktivitet pr. enhed inherent i et partikelformet produkt (for partikler større end mikroorganismeceller) .

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, der er af den i det foregående angivne art, er ejendommelig ved, at man omsætter et koncentrat af et ved homogenisering fuldstændigt sønderdelt cellemateriale fremstillet ud fra mikroorganismer af Bacillus coagulans, hvilket koncentrat har et tørstofindhold på fra 3 til 30% efter vægt pr. rumfangsenhed, med fra 0,01 til 1,0 vægtdele glutaraldehyd pr. vægtdel tørstofindhold i koncentratet, til dannelse af et kohærent, fast produkt, hvorefter man fjerner vand og former glucoseisomerase-produktet, fortrinsvis således, at fjernelsen af vand og formningen omfatter vaskning af det kohærente faste produkt med vand, filtrering og granulering af det vaskede produkt, fortrinsvis ved ekstrude-ring, og derpå tørring til opnåelse af et tørstofindhold på mindst 80 vægtprocent.

Fjernelsen af vand, der kan gennemføres i varierende omfang, udføres normalt i to trin: 1) afvanding ved hjælp af mekaniske midler, f.eks. ved filtrering, og 2) tørring af det færdige formede produkt.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter anvendelsen af et cellekoncentrat med et tørstofindhold på fra 8 til 20% efter vægt pr. rumfangsenhed, fortrinsvis fra 10 til 16% efter vægt pr. rumfangsenhed.

Det har således nu vist sig, at der kan fremstilles et kohærent, fast glucoseisomerase-produkt uden fortynding af enzymindholdet ved inkludering af en udefra kommende immobiliserings-reaktant. Det er blevet fastslået, at cellerne i sig selv indeholder mere end til- 143569 4 strækkeligt nitrogenholdige (og muligvis andre) bestanddele, der kan reagere med glutaraldehyd til dannelse af et gelprodukt. Sådanne bestanddele må først frigøres fra mikroorganismecellerne, men når de er blevet frigjort, vil de tjene deres formål uden nødvendigheden af intermediær rensning.

Frigørelse af nitrogenholdige bestanddele, såsom proteiner og nucleinsyrer, kan udføres ved mekanisk påvirkning eller ved autolyse. Det kohærente reaktionsprodukt afvandes og formes til en passende størrelse findelt form, der væsentligt overstiger ΙΟμ.

Den anvendte mikroorganisme-kilde til glucoseisomerasen er Bacillus coagulans, der er en kendt glucoseisomerase-danner. Som eksempler på typiske anvendelige stammer af Bacillus coagulans kan nævnes stammerne nr. NRRL B-5649 - NRRL B-5666 samt NRRL B-5351, idet stammen NRRL B-5650 er særlig foretrukken. Mikroorganismen Bacillus coagulans sprænges let og frigører både enzymet i opløselig form og reaktive bestanddele såsom proteiner og nucleinsyrer.

Om ønsket kan celleresterne faktisk fjernes fra et homogeniseret koncentrat således at et opløseligt enzym og opløselige reaktive cellebestanddele opløst i filtratet eller centrifugatet kan omsættes til dannelse af det tværbundne produkt.

Mikroorganismecellerne kan tilvejebringes ved dyrkning på enhver egnet måde, fortrinsvis på den måde, der er bedst egnet til dannelse af en celle med højt indhold af glucoseisomerase. Cellerne skilles hensigtsmæssigt fra gæringsvæsken ved filtrering, centrifugering eller lignende, til dannelse af et koncentrat indeholdende fra 3 til 30% vægt pr. rumfang af tørstof deri. Tilstedeværelsen af autolyser-ede og sprængte celler og endog frit enzym i cellekoncentratet er afgørende og tillader koncentrering af mikroorganismecellerne under anvendelse af udstyr i stor kommerciel målestok, f.eks. selvrensende slamcentrifuger. Forholdsvis hårde behandlingsbetingelser, selv autolyse på grund af behandlingsforsinkelser, kan normalt accepteres.

Såfremt en væsentlig grad af cellesprængning, autolyse eller lignende ikke finder sted under udvindingen og koncentreringen, gennemføres sprængning med forsæt til det punkt, hvor der foreligger et koncentrat af et ved homogenisering fuldstændigt sønderdelt cellemateriale. Herved undgås cellevægs-diffusionsproblemer, og der opnås et så fysisk stabilt produkt som muligt.

5 143569

Omsætningen med glutaraldehyd udføres i en vandig suspension af fragmenterede celler, og nogle af de frigjorte cellebestanddele, herunder glucoseisomerase selv, befinder sig i opløsning. Cellesprængning eller cellefraktur bør således kun udføres, efter at cellerne er blevet koncentreret ud over deres sædvanlige indhold i gæringsmediet. Praktisk udtrykt betyder dette, at mikroorganismen almindeligvis adskilles fra dens vækstmedium, f.eks. ved fracentrifugering, som et bakteriecellekoncentrat indeholdende fra 3 til ca. 30% tørstof. Dernæst, enten samtidig med koncentreringen eller derefter, udfører man den ønskede sprængning af cellerne, f.eks. ved autolyse og ved homogenisering.

Til produktion af celler i stor målestok består den mest bekvemme koncentreringsmetode i anvendelsen af en selvrensende separator, f.eks. en SAMS 15037 eller SAMR (begge fra Westfalia Separator A6, Oelde, Vesttyskland). Typen BRPX kan fås fra Alfa-Laval, Sverige, jf. britisk patentskrift nr. 1.261.711, side 2, linie 91-100, vedrørende enkeltheder om egnede driftsparametre.

Trykket på væggen af huset kan beregnes ud fra formlen G 2 2 2 p=— w (r2~r]_) ' hvor G er massefylden af fødematerialet (i dette tilfælde ca. 1030 kg/m3),u er separatorens rotationshastighed, r2 er husets radius, og r^ er radius fra centrum til tilførsels-niveauet, som i denne maskine er nær ved nul. Det viser sig, at trykket på husets periferi for en sådan separator er af størrelsesordenen fra 2 50 til 100 kp/cm . Huset i SAMS 15037 har en radius på 25 cm og roterer normalt med en hastighed på 5000 o/min. svarende til et o tryk på husets væg på ca. 80 kP/cm .

Det er kendt, at nogle mikroorganismer, specielt Bacillusarter, er følsomme overfor autolyse. Det har vist sig for Bacillus coagulans, at hvis et cellekoncentrat fremstilles ved hjælp af den omtalte selvrensende separator, vil der frigøres mere glucoseisomerase, såfremt slammet holdes i nogle få timer ved en temperatur på 10 til 40°C.

Efter 3-6 timers opbevaring er normalt mere end 80% af cellerne sprængte og har undergået autolyse.

Som allerede nævnt har det vist sig, at glucoseisomerase-aktiviteten af en intakt cellesuspension af en glucoseisomerase--producerende Bacillus coagulans kun udgør ca. 1/3 af aktiviteten af den fuldstændigt lyserende suspension som frembragt ved behandling med Lysozym. Dette illustreres i den følgende tabel.

143569 6

Aktivitet i GINU/g

Frisk kulturvæske Kulturvæske med tilsat Lysozym___

uden Lysozym 30 min ved 25°C 60 min ved 25°C

2,14 5,97 6,02

Lysozymet er Sigma Grade I med 25000 Sigma-enheder pr. mg. Kulturvæsken fortyndes 20 gange, og til den fortyndede suspension sættes der 1,5 mg Lysozym pr. ml. Prøverne analyseres derpå, efter 30 og 60 minutter, ifølge ansøgernes standardmetode for ikke-immobiliseret glucoseisomerase.

Glucoseisomerase-NOVO-enheden (GINU) er defineret som den mængde enzym, der. katalyserer dannelsen af 1 mikromol fructose pr. minut under betingelserne for bestemmelsesproceduren.

Bestemmelsesmetode for ikke-immoboliseret glucoseisomerase.

Bestemmelsen af glucoseisomerase udføres på følgende måde: prøven fortyndes i maleinat-puffer (bestående af 0,25 M maleinsyre, 0,10 M MgS04,7 H20, 0,475 M NaOH og 1,0% KC1 efter vægt pr. rumfangf pH er 6,5) til en koncentration i området 0,1-0,8 GINU/ml. Til 1 ml aliquot sættes der glucosesubstrat (1 ml 0,278 M glucose og 0,001 M CoC12,6 H20), og der udføres isomerisering i 20 minutter ved 65°C. Reaktionen standses ved tilsætning af 10 ml 0,1 M perchlorsyre. 0,5 ml af isomerisatet anvendes til farvereaktion med cystein-carbazol--svovlsyre. Først tilsættes der 0,1 ml frisk fremstillet L-cysteinium-chlorid (2,2% efter vægt pr. rumfang), derpå 3 ml af en blanding af 1 ml carbazolopløsning (0,4% efter vægt pr. rumfang i ethanol) og svovlsyre (80% efter vægt pr. rumfang i vand). Den violette farve måles ved 560 nm efter udvikling i 30 minutter ved 30°C. Sideløbende blindprøver af substrat såvel som af prøve er absolut nødvendige.

Der henvises i øvrigt i denne forbindelse til J.Biol.Chemistry, 192 (1951), 583 (Z. Dische og E. Bohrenfreund).

Bestemmelse af procentmængde af opløselig glucoseisomerase.

NOVO-standardmetoden til måling af den totale aktivitet af et cellekoncentrat omfatter 1 times inkubering med Lysozym efter 143569 7 150-200 ganges fortynding med maleinat-pufferen. Når aktiviteten af cellekoncentratet uden Lysozym-behandling er beregnet, kan procentmængden af opløselig aktivitet beregnes, idet det antages, at aktiviteten af intakte celler er 35% af maksimum. Hvis f.eks. aktiviteten efter Lysozym-behandling af et slam findes at være 135 GINU/g og uden Lysozym-behandling 120 GINU/g, kan procentmængden af opløseligt enzym findes som X ud fra ligningen: X · 1,35 + (100-X)1,35 · 0,35 = 120

En anden fordel ved at sikre en fuldstændig sønderdeling eller sprængning af cellerne er, at den fysiske stabilitet af slutproduktet synes at blive forøget mere og mere, desto bedre cellerne (og andet suspenderet materiale) er blevet desintegreret. Til sikring af optimale betingelser har det vist sig at være nyttigt at pumpe slammet gennem en kommerciel homogenisator. Denne type apparat kan fås fra forskellige fabrikanter, f.eks. en Manton Gaulin Type SP 15M-8TA med et éttrins-homogeniserings-ventilarrangement, der kan fås fra Gaulin Corporation, Everott, Massuchusetts, USA. Dette apparat anvendes i vid udstrækning til cellesprængning (se Trans. Inst. Chem. Engns., vol.49, 1971, P.J. Hetherington, og J. Biol.Chem., 1968, 243, side 2579 (Tarmy & Kaplan). Der henvises endvidere til L.H, Rees, Chemical Engineering, 13. maj 1974, hvori der findes en liste over fabrikanter, og de nødvendige trykfald til sprængning af celler er angivet. Der kendes adskillige metoder til cellesprængning, men kun nogle få er egnede til industriel anvendelse. En anden almindelig og forholdsvis billig metode til desintegrering af celler er anvendelsen af en kuglemølle, f.eks. den, der i litteraturen er beskrevet som en Dyno-mølle fra W.A. Bachofen Maschinenfabrik, Basel, Schweiz, se også Biotechn. and Bio-engineering, vol. XV, side 129-142 (1973)).

Cellekoncentratet, der er immobiliseret og tværbundet ved omsætning med glutaraldehyd, har 0% hele celler og et tørstofindhold på 3-30 vægtprocent. Al glucoseisomerase, der måtte være blevet frigjort på opløselig form, forbliver i koncentratet og bliver inkorporeret i enzymproduktet.

I den foreliggende opfindelses forstand er tørstofindholdet den remanens, som efterlades ved tørring ved 105°C i 16 timer.

Tørring i 24 timer ved 60°C under vakuum giver en alternativ måling af tørstofindholdet.

Den mængde glutaraldehyd, der omsættes med cellekoncentratet, 1 £3569 8 er betydningsfuld. En for lille mængde glutaraldehyd ville gøre produktet uegnet til industriel anvendelse, og en for stor mængde ville have tendens til at formindske aktiviteten pr. enhed af det færdige enzymprodukt. Det hensigtsmæssige område for forholdet mellem den tørre vægt af glutaraldehydet og mængden af tørstof i udgangsmaterialet har vist sig at ligge fra 0,01 til 1, fortrinsvis fra 0,04 til 0,4, og især fra 0,05 til 0,3.

Glutaraldehyd kan tilsættes i form af en kommerciel koncentreret (f.eks. 25%'s) glutaraldehydopløsning til cellekoncentratet, og blandingen omrøres grundigt til sikring af en jævn dispergering af glutaraldehydet.

Tværbindingsreaktionen og produktudvindingsproceduren ifølge opfindelsen kan underkastes variationer i vidt omfang.

I en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er udgangsmaterialet et homogeniseret koncentrat, og glutaraldehydet tilsættes i en sådan mængde, og temperaturen ved tilsætningen vælges således, at blandingen bliver i stand til at danne gel i løbet af 1 time.

I en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandles det homogeniserede udgangsmateriale med et flok-kuleringsmiddel inden tilsætningen af glutaraldehyd til dannelse af aggregater og forstærkning af tværbindingsreaktionen.

I en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen fryses tværbindingsblandingen til dannelse af en inhomogen gel, hvilket fører til et mere porøst produkt. Betingelserne for tværbindingstrinet behøver ikke at blive valgt således, at der tillades geldannelse inden frysning. Efter frysning optøs gelen til en temperatur over frysepunktet. Dette tillader tværbindingsreaktionen at fortsætte og dannelsen af det porøse produkt.

Den praktiske udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter således talrige alternativer, og der skal henvises til tegningens figur, der i form af et eksempel viser en grafisk fremstilling af, hvorledes grundprocessen kan varieres således, at resultatet bliver forskellige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Idet der henvises til tegningen vil det bemærkes, at en cellekulturvæske 10 altid koncentreres passende ved centrifugering (trin 12) til 12% tørstof, hensigtsmæssigt under betingelser, der U3569 9 bevirker den nødvendige cellesprængning, som normalt forøges ved 6 timers autolyse. Cellerne underkastes fuldstændig homogenisering (trin 14) til en tilstand, hvor 100% af cellerne er sprængte. Som allerede omtalt resulterer sprængning af cellerne i frigørelse af bestanddele derfra, der kan reagere med glutaraldehyd, og fuldstændig desintegrering giver et mere homogent slam med en mulighed for mere jævn fordeling af tværbindingsbroerne og en besparelse med hensyn til tværbindingsmidlet.

I en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandles homogenisatet (trin 16) med glutaraldehyd, og blandingen får lov at forblive hvilende ved omgivelsernes temperatur, indtil hele massen har dannet gel. Medens gelen endnu er blød (noget i retning af samme konsistens som créme eller flødeost), granuleres den (trin 18) og vaskes eventuelt. Derpå tørres gelen (trin 20), hensigtsmæssigt ved kun lidt forhøjede temperaturer, f.eks. fra 30 til 50°C, til et tørstofindhold på f.eks. 88%. Produktet kan derefter vaskes og tørres på ny (trin 22). De granulerede produkter med høj aktivitet, der fremkommer, udgør et foretrukkent produkt. I en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres granuleringen af glucoseisomeraseproduktet ved ekstru-dering.

Hårdheden af det granulerede produkt kan reguleres ved tilpasning af den oprindelige mængde glutaraldehyd-reaktant og/eller ved graden af den udførte vaskning. Ifølge opfindelsen er det således særlig hensigtsmæssigt, at der anvendes fra 0,05 til 0,3 vægtdele glutaraldehyd pr. vægtdel tørstofindhold i koncentratet. Ved vaskning fjernes uomsat glutaraldehyd, og der fås et svagt blødere produkt. Øjensynligt fortsætter reaktionerne, idet produktet hærdes, medens det tørrer. Det sidste vaskningstrin (22) anvendes i princippet til fjernelse af meget fine partikler.

De tørre partikler af produktet har exceptionel dimensionsstabilitet og strukturstyrke under bibeholdelse af en høj andel af den oprindelige enzymaktivitet, der er til stede i mikroorganismecellerne. Det her omhandlede partikelformede glucoseisomeraseprodukt kan genanvendes flere gange til omdannelse af glucose til fructose, enten batchvis eller i kolonnereaktionsbeholdere.

Behandlingsfordele frembyder sig ved en alternativ behandlingsrækkefølge, hvor cellekoncentratet, fortrinsvis efter et autolysetrin og efter homogenisering behandles med et flokkuleringsmiddel til agglo-merering af cellerne og cellerester,og dernæst omsættes med glutaralde- f43569 ίο hyd (24). Det er lige så godt først at tilsætte glutaraldehydet og derpå tilsætte flokkuleringsmidlet umiddelbart efter glutaraldehydet eller lige inden filtreringen af den opbrudte gel. Efter geldannelsen vaskes gelen og filtreres til fjernelse af noget vand, flokkulerings-middel og/eller uomsat glutaraldehyd. Til filtrering kan der anvendes praktisk taget enhver filtertype. Det har vist sig, at Buchner-tragte er anvendelige til præparationer i laboratoryemålestok, hvor der normalt benyttes vakuumfiltrering. Ved produktion i stor skala har det vist sig, at en filterpresse med plader og rammer er godt anvendelig. Den anvendte presse var en presse med rammedybder på 1,5 cm fra Shule GmbH, Hamburg, Vesttyskland. Arten af den anvendte filterdug er også ganske ukritisk. Den faktisk anvendte filterdug var Propex 23 fra P&S Textiles Ltd., Lancashire, England. Til transporten, af suspensionen til pressen kan den anvendte pumpetype være kritisk, hvilket er et kendt forhold. Mohno-pumper har vist sig egnede, fordi de normalt ikke ødelægger det tilførte materiale. På dette trin er tørstofindholdet i den til gel omdannede masse blevet forøget fra f.eks. 11% til 30%. Derefter granuleres filterkagen (trin 28) og tørres (trin 30), f.eks. til 88% tørstof. Resultatet er en høj enzymaktivitet og seje partikler. En principiel fordel ved flokkule-ring af cellekoncentratet består i, at der fås en lettere afvandelig gel, hvorved belastningen af tørringsudstyret formindskes. Egnede flokkuleringsmidler har vist sig at være EC 25 fra Drev? Chemicals og Superfloc C 521 fra Cyanamid International.

En anden fordel ved at foretage en fysisk afvanding under anvendelse af et filtreringstrin består i, at filterkagen med et lavere vandindhold er mere bekvem at granulere end gelen, som kun kan opbrydes til uregelmæssige klumper inden tørringen. Filterkagen kan granuleres på en oscillerende granulator af en type, der kan leveres fra adskillige firmaer, f.eks. Diaf A/S i København eller Manosty, Liverpool, England.

En anden fremgangsmåde til fremstilling af partikler ud fra filterkagen er at ekstrudere kagen gennem en plade med huller med den ønskede diameter. I denne forbindelse har det vist sig, at en aksial ekstruder, Monoroll, der kan fås fra Simon Heesen, Baxtel, Holland, og en aksial ekstruder, der fremstilles af Fuji Denki Kogyo, Osaka, Japan, er egnede, men i princippet skulle der kunne anvendes enhver ekstruder med den rette hulstørrelse. Diameteren af hullerne i ekstrudersigten bør ligge fra ca. 200>i til 2 mm eller endog mere.

143569 11

En for stor diameter vil være mindre attraktiv grundet diffusionsproblemer. På den anden side vil en for lille diameter give partikler, som ville give anledning til excessive' trykfald i kolonner i stor målestok, såfremt de anvendes i reaktionsbeholdere med fast lag ("fixed bed").

Der kan opnås såvel behandlingsmæssige som produktmæssige fordele ved en alternativ behandlingsrækkefølge, der omfatter frysning (trin 32) af det med glutaraldehyd behandlede cellekoncentrat.

Frysningen kan udføres efter geldannelsen eller inden denne, umiddelbart efter sammenblanding af koncentrat og glutaraldehyd, i hvilket tilfælde reaktionen bliver fuldstændig ved optøning (trin 34). I begge tilfælde forekommer der synerese. Vaskning med vand og fjernelse af vand efterlader et produkt, der er noget koncentreret med hensyn til tørstof, f.eks. 30% tørstof. Derpå tørres produktet, f.eks. til 88% tørstof. Ved frysningen fås der et laminært eller flaget produkt, der er noget elastisk, fibrøst og/eller næsten svampeagtigt af natur. I sammenligning med de granulerede produkter er produktet fra frysningsprocessen praktisk taget frit for excessivt fine partikler. Det menes, at der opnås en større udvinding af total enzym-aktivitet ved anvendelse af frysningsproces-variationen, og anvendelsen af et frysningstrin foretrækkes i den samlede fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

Endnu en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter frysetørring (trin 40) af det frosne reaktionsprodukt, Frysetørring kræver imidlertid kostbart vakuumudstyr og medfører forholdsvis høje driftsomkostninger.

Da enhver form for fordampningstørring involverer behandlingsomkostninger, frembyder afvandingen, lettet ved frysningen og flok-kulering, nogle fordele. Som angivet i diagrammet på tegningen kan det tværbundne, vaskede produkt presses (på et filter) til fjernelse af noget af det oprindelige vandindhold således, at der efterlades i det mindste et produkt med ca. 30% tørstof. Om ønsket kan et sådant produkt anvendes til isomerisering af glucose. Imidlertid foretrækkes nogen tørring, og det foretrukne produkt indeholder mindst 80% tørstof.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

*43569 12

Eksempel 1 Homogenisat (tværbundet)

12 liter slam (fremstillet ved koncentrering af 1550 liter af et kulturmedium fra en fermentering af glucoseisomerase-dannende Bacillus coagulans (NRRL B-5656) ved centrifugering i en Westfalia SAMS 15037 ved 10°C til dannelse af et slam indeholdende ca. 12 gram tør vægt (105°C) pr. 100 ml koncentrat) homogeniseres til frembringelse af frit enzym og andre intracellulære proteiner ved sprængning af cellerne. Ved en pH-værdi på ca. 7,5 pumpes det homogeniserede cellekoncentrat gennem en Manton Gaulin homogenisator af type SP 15M-8TA

med et éttrins-homogeniserings-ventilarrangement. Trykfaldet er 2 400 kg/cm . Homogenisatet, der indeholder mere end 95¾ af aktiviteten på en opløselig form, omsættes med 40 ml/liter af en opløsning af 50% efter vægt pr. vægtenhed af glutaraldehyd, hvorved der fås en koncentration på ca. 2,0% efter vægt pr. vægtenhed af glutaraldehyd i opløsningen. Efter en reaktionstid på 1 time ved omgivelsernes temperatur opbrydes den dannede gel ad mekanisk vej og fortyndes med. 20 liter afioniseret vand. Gelstykkerne overføres dernæst' til..en vakuumtromletørrer, hvor de ca. 1 kg materiale dehydra-tiseres ved 50°C til en vægt på ca. 130 gram. Under dehydratiserin-gen omdannes de bløde gelstykker til et sejt og dimensionsstabilt materiale. De dehydratiserede stykker findeles derpå til partikler med.diameter under 1 mm. Enzymudbyttet varierer fra batch til batch og udgør fra 50 til 60% af den oprindelige aktivitet. Imidlertid udgøres ca. 15 vægtprocent af produktet af yderst fint materiale (en partikelstørrelse i området fra 1 til 70 ^i) .

Eksempel 2

Flokkuleringsmiddel tilsat til et homogenisat efter glutar-aldehydet.

12 liter af et slam fremstillet som beskrevet i eksempel 1 homogeniseres under de i eksempel 1 anvendte betingelser. Mere end 95% af aktiviteten viser sig at være opløselig. Til homogenisatet sættes der ved en pH-værdi på 7,0 og en temperatur på 15°C 50% efter vægt pr. vægtenhed af glutaraldehydopløsning, hvorved der fås en koncentration på 2,0% efter vægt pr. vægtenhed af glutaraldehyd i opløsningen. Efter 1 times reaktionstid opbrydes gelen ad mekanisk vej og fortyndes med 2 rumfang vand, og pH-værdien indstilles på 7,5.

13 163569

Der tilsættes 150 ml 30%'s Drewfloc EC 25 (efter vægt pr. vægtenhed) til opnåelse af en klar vandfase i suspensionen. Blandingen filtreres på en filterpresse med plade og ramme fra Shule GmbH, Hamburg, Vesttyskland. Rammedybden er 15 mm, og den anvendte filterdug er Propex 23 fra P&S Textiles Ltd., Lancashire, England. Filterkagen gennemluftes med trykluft til fjernelse af noget af det frie vand.

Den gennemluftede filterkage ekstruderes i en aksial ekstruder, Monoroll fra Simon Heesen, Baxtel, Holland, der er udstyret med en sigte med 0,8 mm huller. Produktet tørres i en fluid bed-tørrer med en luftindgangstemperatur på 50°C.

300 g fyldes i en med kappe udstyret kolonne på 1 liter, og ved en temperatur på 60°C og ved en pH-værdi på 7,2 pumpes der en 40%'s opløsning af glucose (efter vægt pr. vægtenhed) gennem kolonnen med en hastighed på 1 liter pr. time. Omdannelsen udgør 43%. Glucoseopløsningen indeholder 0,1 g CoS04,7 H20 og 2,0 g

MgS04,7 H20 pr. liter.

Eksempel 3

Fremstilling af et koncentrat af et fermenteringsmedium og dettes immobilisering.

1000 liter medium fra en fermentering af en glucoseisomerase--holdig Bacillus coagulans NRRL B-5656 koncentreres ved centrifugering ved 10°C i en Westfalia SAMS 15037 selvrensende separator til dannelse af et slam med 12 g tør vægt pr. 100 ml koncentrat og 56% opløseligt enzym.

10 liter af det samme cellekoncentrat homogeniseres under anvendelse af en Manton-Gaulin-homogenisator ved 400 atmosfærer til dannelse af et homogenisat med mere end 95% af aktiviteten på en opløselig form.

100 ml af homogenisatet omrøres i 20 minutter med 5 ral af en 20%'s (vægt pr. vægtenhed) glutaraldehydopløsnlng ved pH = 6,8, udspredes på en overflade i form af et lag med en tykkelse på 1 cm, tørres ved en temperatur på 20°C og formales i en morter til dannelse af 11,6 g partikler. Partiklerne omrøres i 20 minutter i 200 ml afioniseret vand og tørres, hvorved der fås 9,7 g seje partikler.

143569 14

De seje partikler fyldes på en med kappe udstyret kolonne, der holdes ved en temperatur på 65°C, og der tilføres et materiale bestående af 40% (vægt pr. vægtenhed) glucose og 0,1% (vægt pr. rumfang) MgSO^j7 1^0 ved en pH-værdi på 7,8 og en hastighed på 45 ml pr. time. Efter 44 timer findes omdannelsen at være 45,2%.

Eksempel 4

Forskellige enzymkoncentrationer.

3 portioner på hver 100 ml af homogenisatet fra eksempel 3 med mere end 95% opløseligt enzym behandles på følgende måde: (a) blandes med 10 ml 20% glutaraldehyd efter vægt pr. vægtenhed ved en pH-værdi på 6,8, (b) behandles som under (a), men fortyndes først med 100 ml afioniseret H^O og (c) behandles som beskrevet under (a), men fortyndes først med 200 ml afioniseret 1^0.

Alle portionerne fryses ved en temperatur på -18°C og optøs derpå ved en temperatur på 20°C, og de dannede svampeagtige materialer dispergeres hver for sig i 300 ml afioniseret H20, filtreres, tørres ved en temperatur på 20°C og granuleres. 5 g af hver prøve afprøves dernæst i en med kappe udstyret kolonne ved 65°C og en pH-værdi på 7,8 ved en strømningshastighed på 30 ml pr. time af 40%'s glucoseopløsning efter vægt pr. vægtenhed indeholdende 0,1% MgS0^,7 ^0 efter vægt pr. rumfang og 0,01% CoSO^, 7 efter vægt pr. rumfang efter 20 timers forløb. Der fås følgende resultater: % omdannelse (a) 46,4 (b) 45,8 (c) 47,4 143569 15

Eksempel 5

Sammenligning mellem forskellige grader af cellesprængninq.

Et koncentrat (60%'s sprængning) og et homogenisat fremstilles som i eksempel 3.

200 ml af hvert produkt blandes derpå i 20 minutter ved 8 ml af en 50%'s glutaraldehydopløsning (vægt pr. vægtenhed), fryses ved en temperatur på -20°C, optøs ved en temperatur på 20°C, og det således dannede svampeagtige produkt opbrydes, omrystes i 20 minutter i 1 liter afioniseret vand, filtreres på en Buchnertragt, presses på filteret, gendispergeres i 1 liter afioniseret vand, genfiltreres, tørres ved en temperatur på 20°C og granuleres. 5 g af hvert granulat afprøves i kolonner som i eksempel 6 ved en strømningshastighed på 30 ml pr. time, og der fås følgende resultater efter 20 timer: % omdannelse

Koncentrat 40,0 Homogenisat 45,1

Ved afprøvning for stivhed efter forsøget viser det sig, at koncentratpartiklerne er bløde, medens homogenisatpartiklerne er seje.

En batch af i det væsentlige ikke-sprængte celler af Arthrobacter B 3726 behandles på samme måde, men det viste sige at det var umuligt at gennemføre en immobilisering på en tilfredsstillende måde, eftersom der ikke kunne dannes stabile formede legemer.

Eksempel 6'

Glutaraldehyd-krav, koncentrat og homogenisat.

Der fremstilles granuler ud fra koncentrat (55%'s sprængning) og ud fra homogenisat som i eksempel 3 , men under anvendelse af forskellige glutaraldehydkoncentrationer, og der omrøres i 20 timer i afioniseret vand ved en temperatur på 60°C og afprøves for stivhed på følgende måde: partiklerne presses så hårdt som muligt mellem to fingre, og resultaterne udtrykkes ved hjælp af følgende skala: 16 143559

Skala Kendetegn 1 Fuldstændig pastakonsistens 2 Væsentlig grad af pastakonsistens 3 Kun ringe grad af pastakonsistens 4 Ingen pastakonsistens, sej 5 Meget sej 6 Yderst sej

Den minimale stivhed, der menes at være egnet til industriel anvendelse, anses at ligge på 3 eller 4.

De ovennævnte granuler gav følgende resultater:

Stivhedsskala (beregnet på % Glutaraldehyd koncentrat) Koncentrat Homogenisat 1.0 x 2-3 1.5 1 4 2.0 2 5 2.5 3-4 6 x for blød til at blive granuleret.

Eksempel 7

Virkning af optøning^

Et ikke-homogeniseret koncentrat fremstillet som i eksempel 3 med 56% opløseligt enzym deles i to dele: den ene halvdel omrøres ved en temperatur på 3°C med 10 ml 20%'s glutaraldehydopløsning efter vægt pr. vægtenhed pr. 100'ml koncentrat ved en pH-værdi på 6,8 i 2 minutter, fryses i et ethanol-tøris-bad, henstilles til optøning ved en temperatur på 20°C, dispergeres i afioniseret vand, filtreres på en Biichnertragt, presses på filteret og tørres ved en temperatur på 20°C. Den anden halvdel behandles på samme måde med den undtagelse, at den ikke optøs, men frysetørres i stedet. 5 g partikler fra hver proces afprøves derpå som i eksempel 6 under anvendelse af en strømningshastighed på 30 ml pr. time. Der fås følgende resultater efter 20 timer:

Proces % omdannelse (a) frysning, optøning 37,8 (b) frysetørring 35,6 17 U3569

Et homogeniseret koncentrat (200 ml) fremstillet som i eksempel 3 med mere end 95% opløseligt enzym behandles på samme måde og fryses derpå og optøs, hvorved der fås 19,1 g seje partikler, der efter afprøvning udviser en 42,4%'s omdannelse af 40%'s glucose-sirup (vægt pr. vægtenhed) efter 20 timer ved en tilførselshastighed på 24 ml pr. time.

Eksempel 8

Frysningsbetingelser.

Et homogeniseret koncentrat med'93% opløseligt enzym omsættes med glutaraldehyd som i eksempel 7, fryses derpå i et ethanol-tøris--bad under omrøring og optøs derefter. Partiklerne, der fremkommer, svarer til de sammenlignelige homogenisat-partikler fremstillet ifølge eksempel 7.

Et lignende præparat fryses ved tilsætning af tøris til tværbindingsblandingen. Blandingen fryser på blot nogle få minutter, og de dannede partikler er mindre fibrøse og mere porøse.