NO140233B - Fremgangsmaate til gjennomfoering av en enzymkatalysert omdannelse, samt enzymholdig aggregat for bruk ved fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte ved enzymkatalysert omdanning av forskjellige stoffer i nærvær av mikrobeceller som inneholder aktive enzymer, samt et enzymholdig aggregat for bruk ved fremgangsmåten. Mer spesielt dreier oppfinnelsen seg om bruk av mikrobeceller til enzymprosesser hvor cellene anvendes til satsvis eller kontinuerlig fremstilling i forbindelse med flokkuleringsteknikker.

Anvendelse av enzymer avledet fra mikrobeceller for ut-førelse av visse kjemiske reaksjoner eller omdannelser er vel kjent. For utførelse av disse omdannelser benyttes cellefrie prepa-

rater, vanligvis til satsvise prosesser. Enzymene frigjøres vanligvis fra cellen ved mekaniske midler eller ved autolyse,

men dette er en kostbar prosess som ofte fører til ytterligere tekniske problemer og til kostbar utvinning. Bruk av hele celler blir også for det meste unngått fordi cellene ikke egner seg til kontinuerlige prosesser i teknisk målestokk.

Forskjellige vanskeligheter som man støter på ved bruk av hele celler og ved bruk av cellefrie enzymer har i de senere år ført til øket interesse for fremstilling av forskjellige former for ubevegelige eller statiske enzymer. Slike statiske enzymer kan brukes til satsvise prosesser og til kontinuerlige rør-prosesser. Bruk av statiske enzymer krever at enzymer skilles fra mikroorganismen, rensing og forbindelse eller sammenføyning med bærestoffer som dextran eller cellulosederivater, organiske harpikser eller glasskuler. Ekstraksjon, rensing og uoppløselig-gjøring er tidskrevende og fører vanligvis til et relativt stort tap av opprinnelig enzymaktivitet.

Man har lenge visst at uoppløselige stoffer som celler, lettere fjernes fra væsker ved bruk av polyelektrolytter, natur-gummier eller alun. For eksempel benytter man ved forgjæringer som omfatter ekstracellulære enzymer vanligvis polyelektrolytter som hjelp til å fjerne de uønskede celler og forbedre klarheten i det enzymholdige filtratet. Enkelte av de mekaniske aspekter som er knyttet til polyelektrolytt-utfelling eller -flokkulering av bakterier er omtalt av P.L. Busch og W. Stumm i Environmental Science and Technology 2, 49-53 (januar, 1968) og av L.L. Gasner og D.I.C. Wang i Biotechnology and Bioengineering 12^, 873-887

(1970) .

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en hensiktsmessig og effektiv metode til bruk av enzymer, enten ved kontinuerlige eller satsvise prosesser, ved anvendelse av flokkulerte mikrobeceller med ønsket enzymaktivitet. Metoden som foreslås gjør separasjon av enzymet fra mikroorganismen unødvendig. Dette gjør at man dessuten unngår enzymrensing eller -uoppløseliggjøring. Selv om oppfinnelsen kan benyttes i forbindelse med enhver mikroorganisme, er den særlig egnet i forbindelse med organismer som produserer intracellulære enzymer som er anvendelige for gjennomføring av visse spesifikke substratomdannelser.

Som tidligere nevnt har flokkulering av mikrobeceller stått i sentrum for betraktelig interesse i de senere år, særlig i forbindelse med behandling og klaring av biologiske avfalls-væsker fra gjæringsprosesser. Man har nå funnet at hele mikrobeceller som er dannet til aggregatform ved å benytte egnede flokkuleringsmidler, kan brukes direkte til et stort antall enzymatiske prosesser. Helt uventet har man oppdaget at ved å

la flokkulerte mikrobeceller gjennomgå frysetemperaturer eller dehydratisering, oppnås at de flokkulerte celler får en viss stivhet eller struktursammenheng uten nedsettelse av enzymaktiviteten, hvilket gir et materiale som er særlig egnet for bruk til kontinuerlige eller satsvise enzymatiske reaksjoner. For eksempel er et sjikt av flokkulerte mikrobeceller fremstilt i henhold til oppfinnelsen, i stand til å motstå gjentatt gjennomstrømning av substratoppløsninger gjennom sjiktet under tilfredsstillende strømningshastigheter og enzymaktiviteter i lengre tidsrom.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte til gjennomføring av en enzymkatalysert omdannelse av et substrat ved at dette bringes i kontakt med et aggregat omfattende hele mikrobeceller, hvortil er knyttet aktive mengder av enzymet, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at det anvendes et aggregat som er dannet ved bruk av anionisk og/eller kationisk polyelektrolytt som flokkuleringsmiddel.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt et enzymholdig aggregat for bruk ved en slik fremgangsmåte, omfattende hele mikrobeceller hvortil er knyttet nevnte enzym, og dette aggregat er kjennetegnet ved at cellene er flokkulert med minst 1 vekt-%, basert på vekten av nevnte celler, av et anionisk og/ eller kationisk polyelektrolytt-flokkuleringsmiddel, hvilket aggregat er frosset eller tørket, fortrinnsvis etter at det er ekstrudert.

Eksempler på anioniske polyelektrolytter er karboksyl-substituerte polyakrylamider, polystyrensulfonater og poly-karboksylsyrer; mens kationiske polyelektrolytter kan være poly-aminer og polyetylenimin. Kombinasjoner av to eller flere flokkuleringsmidler kan brukes for å gjennomføre den ønskede aggregering. Valg av egnet flokkuleringsmiddel til et gitt tilfelle skjer lettest ved å sette forskjellige midler til små prøver av det celleholdige medium og sammenligne teksturen og ut-seende av de dannede celleaggregater. Bruk av filterhjelpe-stoffer og polymere adsorpsjonsmidler sammen med flokkulerings-midlene kan være en fordel i visse tilfelle. For eksempel er amberlitpolymere adsorpsjonsmidler, som akrylestere og filter-hjelpestoffer som diatomé jord og asbest, virkningsfulle når de tilsettes kulturmediet under flokkuleringen. Mengden av adsorp-sjonsmiddel eller filterhjelpestoff kan gå opp til 100 vekt-% basert på vekten av våte celler i mediet. Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til de ovenstående midler, siden lignende stoffer sannsynligvis vil gi like tilfredsstillende resultater.

Tilsetning av flokkuleringsmiddel til det celleholdige medium eller buljongen skjer mest hensiktsmessig i form av en oppløsning eller suspensjon. Det kan også være nødvendig å regu-lere flokkuleringsoppløsningens og/eller buljongens pH før bland-ingen. Dette vil avhenge av den valgte mikroorganisme, enzymets stabilitet og det pH-området hvor flokkuleringsmidlet er mest effektivt. Flokkuleringen gjennomføres med fordel ved romtemperatur og mengden flokkuleringsmiddel som kreves, ligger på fra 1

og vanligvis opptil 50 vekt-% basert på vekten av våte celler i mediet.

Røringen av flokkuleringsholdig gjærende buljong må

være kraftig nok til å bringe cellene så kraftig som mulig i kontakt med flokkuleringsmidlet. Imidlertid må for kraftig røring unngås siden dette har tendens til å nedbryte størrelsen på de allerede dannede aggregater og således motvirke flokkuler-ingsmidlets hensikt. Omhyggelig kontroll med røringen gir celleaggregater som agglomererer i gjæringsbeholderen og letter den fullstendige opparbeidelse av de tilgjengelige celler ved hjelp av standardmetoder som dekantering, filtrering eller sentrifu-gering.

De høstede flokkulerte celler kan brukes til den tenkte enzymatiske reaksjon uten videre behandling, imidlertid reduseres den nyttige levetiden til slikt cellemateriale ved kontinuerlig rørprosesser betraktelig på grunn av sammenpakking og sedimen-tering av materialet, som har uheldig innvirkning på strømnings-hastigheten. Det er derfor gunstig å la de høstede flokkulerte celler frysetørke eller tørke de flokkulerte celler før bruk. Slike behandlinger tjener ikke bare til å øke strømningshastig-hetene for substratoppløsningen, men forbedrer også behandlings-og lagringsegenskapene for de flokkulerte celler. Frysetempera-turene som kreves for behandling av det høstede cellematerialet er ikke særlig kritisk, idet 0°C og lavere er tilfredsstillende. Frysetidene avhenger naturligvis av den anvendte temperatur og mengden av celleaggregater som fryses.

Konsistensen av de høstede flokkulerte celler er slik at materialet kan ekstruderes til forskjellige former som egner seg til enzymatiske reaksjoner. De ekstruderte celleaggregater kan brukes i forbindelse med inerte bærestoffer ved fremstilling av pakkede kolonner for kontinuerlig drift,eller ekstrudatet fryses eller tørkes før bruk.

Tørking av de flokkulerte celler er særlig gunstig fordi det muliggjør oppmaling av det tørkede materialet og utvelging av partikkelstørrelse ved å sikte de malte celler. Reguleringen av partikkelstørrelsen sikrer igjen et jevnt sjikt når materialet pakkes i kolonner for kontinuerlig substrathastighet gjennom det pakkede rørsjiktet. Tørking av de flokkulerte celler muliggjør også lagring av det tørkede materialet ved romtemperatur over lengre tid. Tørkeprosessen kan utføres på enhver egnet måte,som for eksempe] ved 1 uftsirkulasjonsovn, i vakuum, trommeltørker etc. forutsatt at tørketemperaturen og -tiden ikke fører til noen vesentlig nedbrytning eller ødeleggelse av det ønskede enzymet. Tørketiden varierer, men det er en fordel om tørkeprosessen fortsettes til materialet er tilstrekkelig sprøtt til å mulig-gjøre en oppmaling.

De flokkulerte celler som brukes til et stort antall forskjellige enzymkatalyserte reaksjoner og kjemiske omdannelser som isomerisering, oksydering, dehydrogenering, hydrolyse og reduksjon. Materialet er egnet for både satsvis og kontinuerlig drift selv om omdannelser som medfører frigivelse av gass er noe mindre egnet til kontinuerlige rørprosesser. Den mengde cellemateriale som kreves til en gitt prosess vil avhenge av en rekke faktorer som omfatter den spesifikke enzymaktivitet til materialet og kontakten med substratet, samt den ønskede hastighet og omdanningsgrad. Ved kontinuerlige rørprosesser vil rørdimen-sjonen og strømningshastigheten også innvirke på mengden av cellematerialet som kreves.

Substratet, med fordel i form av en oppløsning eller emulsjon, føres i kontakt med det flokkulerte cellematerialet i tilstrekkelig lang tid til å bevirke den ønskede omdannelse eller reaksjon. Driftsparametre som temperatur, pH og substratkonsen-trasjon,bestemmes av stabilitet og betingelser for optimal virk-ning som enzymet krever for omdannelsen. Reaksjonsproduktet opparbeides på en hvilken som helst passende måte eller gjennomgår ytterligere behandling som ønsket.

Oppfinnelsen kan best illustreres ved å beskrive anvendelse av en spesiell organisme og enzym. En valgt art av Arthrobacter som NRRL B-3724, NRRL B-3725, NRRL B-37 26, NRRL B-3727 eller NRRL B-3728 dyrkes i sterilt medium som inneholder karbohydrater, nitrogen og uorganiske salter. Gjæringen gjennom-føres ved 30°C som beskrevet i norsk patent nr. 126.441.

Gjæringen fortsettes til man oppnår maksimal isomeraseaktivitet målt etter standard-målemetoder. På dette punktet ut-gjør mengden våtceller suspendert i gjæringsbuljongen vanligvis ca. 4 vekt-% av det totale medium. Et polyvinylimidazolin som "Primafloc C-7" (kationisk flokkuleringsmiddel) tilsettes mediet i form av en 2%-ig vandig oppløsning hvis pH er innstilt på

5,0. Mengden flokkuleringsmiddel som tilsettes utgjør ca.

0,25 vekt-% basert på totalt medium og man gjennomfører til-

setningen under forsiktig røring av mediet. Dannelsen av hele celleaggregater er vanligvis avsluttet iløpet av 10-15 minutter. Man stopper derpå røringen og den flokkulerte cellemassen av-settes på bunnen av gjæringskaret. Cellene høstes ved å de-kantere mesteparten av det klare næringsmedium og vakuumfiltrere de resterende våte flokkulerte celler.

De opparbeidede hele celleaggregater fryses og holdes ved -5°C i ca. 8 timer før man fremstiller en pakket kolonne ved å benytte materialet i tinet form. Ved fremstilling av de pakkede rørene blir aggregatene oppslemmet i vann og gjennomgår en mekanisk knusing for å gi en jevnere partikkelstørrelse. En "Waring"-blandemaskin er egnet for dette formål forutsatt at blandeperioden er meget kort. • Oppslemmingen helles opp i et rør som er delvis fylt med vann og det finner sted en sedimen-tering av cellene. En glukoseoppløsning i konsentrasjoner på opptil 50 vekt-%, inneholdende tilstrekkelig Mg++ til å gi maksimal isomerisering og justert til ca. pH 6 til 10, føres gjennom den pakkede kolonne. Kolonnen oppvarmes med fordel til 50-75°C for å øke omdanningshastigheten av glukose til fruktose og hindre vekst av eventuelle forurensende organismer. Strømningshastig-heten for utgående strøm reguleres slik at man får omsetnings-grader for glukose til fruktose på 40-45%. Omsetningsgraden for glukose til fruktose som kan nås i henhold til oppfinnelsen,går opptil 50%. To eller flere pakkede rør kan kjøres i serie om ønsket og de pakkede celler kan gjenvinnes fra kolonnene for senere bruk til glukoseisomerisasjoner. Isomerasevirkningen be-holdes selv når cellematerialet gjenvinnes og fryses, og benyttes frosset eller tørket før fornyet bruk.

Isomerisering av glukose til fruktose kan også gjennom-føres ved hjelp av forskjellige arter av Streptomyces som er flokkulert. Arter som er egnet for dette formål er S. albus,

S. echinatur, S. phaeochromogenes, S. flavovirens og S. olivaceus. Flokkulering av hele celler etter dyrking av forskjellige arter av Streptomyces gjennomføres på analog måte som beskrevet for Arthrobacter og isonieriseringen blir også utført på lignende måte.

Følgende eksempler vil ytterligere illustrere oppfinnelsen .

E ksempel 1

En Arthrobacter-art som NRRL B-3728 anbringes i sterili-sert vekstmedium inneholdende 2% dekstrose, 0,3% kjøttprotein, 0,1% gjærekstrakt, 0,6% (NH4)2HP04, 0,2% KH2P04 og 0,01% MgS04• 7H2O. pH for det resulterende mediet er 6,9. Man lar gjæringen forløpe under røring ved 28°C i 60 timer og etter dette tidsrom er buljongens pH ca. 5,5. Til væsken setter man 2% (vekt pr. volum) av en oppløsning inneholdende en egnet polyelektrolytt som "Primafloc C-7", til en sluttkonsentrasjon for polyelektrolytt på 0,25% (vekt pr. volum). Polyelektrolyttens pH innstilles først på ca. 5,0 og gjæringsmediet røres langsomt under tilsetning av polyelektrolytten. Om ønsket, tilsetter man et filterhjelpestoff som "Celite 545", til miljøet i en konsentrasjon på ca.

0,5% (vekt pr. volum) like før tilsetning av polyelektrolytt-oppløsningen. Forsiktig røring av buljongen inneholdende polyelektrolytt (og eventuelt filterhjelpestoff) fortsettes inntil man får stabile celleaggregater (ca. 10 minutter). Røringen ble deretter stanset og celleaggregatene tillates å agglomerere slik at mesteparten av den klare buljongen sbår over cellematerialet. Derpå oppsamles cellematerialet ved vakuumfiltrering eller på annen egnet måte. De innhøstede celleaggregater ble enten frosset ved -5°C eller tørket ved 55°C før bruk. Isomerase-aktiviteten hos de høstede aggregater, bestemt etter standardmetoder, er omtrent like stor som enzymaktiviteten for celler isolert fra fermenteringsmediet før behandling med flokkuleringsmiddel og filterhjelpestoff. En prøve av det separerte gjærings-medium viser videre ingen isomeraseaktivitet, hvilket tyder på fullstendig utvinning av isomerasen ved flokkuleringsteknikken.

Eksempel 2

Eksemplet illustrerer kontinuerlig omdannelse av glukose til fruktose ved hjelp av flokkulerte celler som er fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1 og lagret ved -5°C i flere timer.

Frosne flokkulerte celler nedsenkes i vann eller en glukosesirup. Cellemassen tines og knuses forsiktig ved mekaniske innretninger eller røring til partikler med temmelig jevn størrelse. Oppslemmingen settes i vakuum i ca. 30 minutter for å fjerne innsluttede gasser fra cellepartiklene. En kolonne med temperaturreguleringskappe og diameter 2,5 cm fylles delvis med vann eller glukosesirup og den avgassede oppslemming helles opp i kolonnen. Den pakkede kolonne oppvarmes til 60°C og en 2 M oppløsning av glukose med pH 8,0 og inneholdende 0,004 M MgCl2* 6H20 føres gjennom kolonnen med strømningshastigheter som reguleres slik at man oppnår den ønskede omsetningsgrad for glukosen. Man kan oppnå omsetninger på opptil 50% etter denne metoden.

Eksempel 3

Eksemplet illustrerer fremstilling av tørkede flokku-

lerte celler og bruk av tørkede celler til kontinuerlig rør-isomerisering av glukose til fruktose.

Man utfører flokkuleringen ved å benytte en kombinasjon

av kationisk og anionisk flokkuleringsmiddel. 5 deler frisk Arthrobacter-kultur (pH 5,6) behandles med en del 1%-ig (vekt

pr. volum) oppløsning av kationisk "Primafloc C-7". Mediet inneholdende flokkuleringsmiddel røres langsomt til det er dannet store celleaggregater. En del 1%-ig (vekt pr. volum) anionisk "Primafloc A-10" (anionisk flokkuleringsmiddel) tilsettes som oppløsning og man fortsetter å røre til de store aggregatene brytes ned til fine partikler. Man lar de flokkulerte celler agglomerere som i eksempel 1. Den klarede buljong skilles fra og de flokkulerte celler opparbeides ved enkel vakuumfiltrering.

pH for begge flokkuleringsoppløsninger innstilles med natronlut før tilsetning til næringsmediet. Den kationiske oppløsning av "Primafloc C-7" innstilles på pH 5 og den anioniske "Primafloc A-10" innstilles på pH 7. Slutt-pH for den flokkulerte kultur er på

ca. 5,6.

Den filtrerte cellekaken ekstruderes gjennom en passende dyse før man tørker ekstrudatet i en vifteovn i ca. 24 timer ved ca. 55°C. Det tørkede cellematerialet granuleres i en mølle og siktes til 20-40 mesh. De granulerte, tørkede celler pakkes i et rør og man isomeriserer glukose som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 4

Aspergillus niger dyrkes i næringsmedium som inneholder glukose, fruktose, MgS04-7H20, KH2P04, (NH4)2HP04, urea og mais-bløtningsvann. Etter gjæringen tilsetter man en kationisk polyelektrolytt i en mengde på 0,3 vekt-% basert på næringsmediets volum. Man rører tilstrekkelig kraftig til å få cellene til å agglomerere. De flokkulerte celler høstes og fylles på en kolonne av egnet størrelse. Den fylte kolonnen oppvarmes til 40°C og man fører en 5%-ig oppløsning av invert sukker gjennom kolonnen og får et eluat som inneholder glukonsyre og fruktose.

Eksempel 5

Streptomyces olivaceus, art NRRL B-3583 dyrkes i næringsmedium som inneholder 0,7% xylose, 0,3% dekstrose, 0,5% kjøtt-ekstrakt, 0,25% gjærekstrakt, 1,0% pepton, 0,5% NaCl, 0,05% MgS04-7H20 og 0,024% CoCl2>6H20. Man fortsetter gjæringen ved 28 C i 24 timer. En 2 vekt-%-ig (vekt pr. volum) oppløsning av kationisk polyelektrolytt settes til gjæringsmiljøet i en mengde som svarer til 0,05% (vekt- pr. volum) av det tørre agglomererings-middel. Buljongen røres kort for å lette sammenløpning av cellene. Deretter stopper man å røre og lar de flokkulerte celler sedimentere ut. Celleaggregatene høstes på den måten som er beskrevet i eksempel 1. De agglomererte celler tørkes ved 60°C i 24 timer før man forsiktig knuser den tørkede cellemasse for å redusere partikkelstørrelsen. Det knuste cellematerialet fylles på en kolonne delvis fylt med 1,0 M glukoseoppløsning.

Den fylte kolonnen oppvarmes til 7 0°C og en 1,0 M glukoseopp-løsning inneholdende 0,04 M MgCl2'6H20 innstilt på pH 8 føres gjennom kolonnen for å gi omdannelse av glukose til fruktose.

Eksempel 6

Saccharomyces cerevisiae dyrkes i næringsmedium som inneholder molasse. Etter passende gjæringstid tilsettes poly-elektrolyttoppløsning til buljongen under tilstrekkelig røring til å bevirke agglomerering av cellene. Den flokkulerte cellemassen utvinnes og brukes til kontinuerlig kolonneoperasjon hvor kolonnetemperaturen er 60°C, og en 0,5 M oppløsning av sukrose med pH 5,0 føres gjennom kolonnen hvorved sukrose over-føres til invert sukker.

Eksempel 7

Aspergillus oryzae dyrkes i næringsmdeium som inneholder hvetekli blandet med ytterligere karbohydrater, mineraler og buffere. Man utfører gjæringen i 48 timer ved 30°C og deretter tilsettes egnet polyelektrolytt til buljongen. Agglomereringen av de flokkulerte celler hjelpes ved forsiktig røring. De flokkulerte cellene høstes ved dekantering og filtrering. Der-

på anbringes de flokkulerte celler i en kolonne med temperatur-kappe og oppvarmes til 50°C. En nøytral 0,2 M oppløsning av

-4

acetyl-DL-methionin inneholdende 5 x 10 M Co++ ført gjennom kolonnen som gir et eluat som inneholder L-methionin.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte til gjennomføring av en enzymkatalysert omdannelse av et substrat ved at dette bringes i kontakt med et aggregat omfattende hele mikrobeceller hvortil er knyttet aktive mengder av enzymet, karakterisert ved at det anvendes et aggregat som er dannet ved bruk av anionisk og/eller kationisk polyelektrolytt som flokkuleringsmiddel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aggregatet tørkes før bruk i den enzymkatalyserte omdannelse.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aggregatet fryses før bruk i den enzymkatalyserte omdannelse.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at substratet er en glukoseholdig væske, idet glukosen omdannes til fruktose med et glukose-isomeriserende enzym.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den glukoseholdige væske kontinuerlig føres gjennom et sjikt av de flokkulerte celler.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at sjiktet holdes ved en temperatur mellom 50 og 90°C, og at den glukoseholdige væske har en pH-verdi på 6-10, idet glukoseandelen omdannet til fruktose utgjør 1-50%.

7. Enzymholdig aggregat for bruk ved utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, omfattende hele mikrobeceller hvortil er knyttet nevnte enzym, karakterisert ved at cellene er flokkulert med minst 1 vekt-%, basert på vekten av nevnte celler av et anionisk og/eller kationisk polyelektrolytt-flokkuleringsmiddel, hvilket aggregat er frosset eller tørket, fortrinnsvis etter at det er ekstrudert.

8. Tørket aggregat ifølge krav 7, karakterisert ved at det er malt og siktet etter at det er tørket.