Przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia enzymatycznie katalizowanej przemiany substratu, zawie¬ rajacego weglowodany lub aminokwasy. ^nane jest stosowanie enzymów, pochodzacych z komórek mikroorganizmów, do prowadzenia reakcji chemicznych. Do prowadzenia takich przemian stosuje sie zazwyczaj procesy okresowe, prowadzone przy uzyciu preparatów bezkomórkowych. Enzymy uwalnia sie z komórek zazwyczaj na drodze mechanicznej lub przez autolize, jest to jednak proces kosztowny, stwarzajacy czesto dodatkowe problemy techniczne i natury ekono¬ micznej.Rózne trudnosci, zwiazane z zastosowaniem calych komórek, jak równiez enzymów bezkomórkowych, doprowadzily ostatnio do wzrostu zainteresowania sposobami wytwarzania róznych unieruchomionych enzy¬ mów. Unieruchomione enzymy stosuje sie w procesach okresowych i w procesach ciaglych, prowadzonych w ko¬ lumnach. Stosowanie unieruchomionych enzymów wymaga jednak oddzielania enzymu od mikroorganizmu, oczyszczenia i zwiazania enzymu z nosnikiem, takim jak dekstran lub pochodne celulozy, zywice organiczne lub perelki szklane. Procesy ekstrakcji i oczyszczania sa czasochlonne i towarzyszy im zwykle znaczna strata po¬ czatkowej aktywnosci enzymu. Ponadto wiadomo, ze substancje nierozpuszczalne, takie jak komórki, znacznie wydajniej usuwa sie z cieczy przy uzyciu polielektrolitów, zywic naturalnych lub alunu amonowego. Np. w fer¬ mentacji za pomoca enzymów pozakomórkowych, w celu ulatwienia usuwania niepozadanych komórek i popra¬ wienia klarownosci przesaczu, zawierajacego enzym, zwykle stosuje sie polielektrolity. Niektóre aspekty mechani¬ zmu klaczkowania bakterii za pomoca polielektrolitu opisano w pracy P.L. Busch i W. Stumm „Enviromental Science and Technology" 2, 40—53 (styczen, 1968), jak równiez w pracy L.L. Gasnera i D.J.C. Wanga „Biotech- "nology and Bioengineering" 12, 873-887 (1970).Jak wspomniano poprzednio, w ostatnich latach poswieca sie znaczna uwage klaczkowaniu komórek mi¬ kroorganizmów przede wszystkim w zwiazku z biologiczna obróbka scieków i klarowaniem lugów fermentacyj-2 99 373 nych. Stwierdzono, ze w wielu enzymatycznych procesach mozna stosowac cale komórki mikroorganizmów lub agregaty bezkomórkowych preparatów enzymatycznych, otrzymane przy uzyciu odpowiedniego srodka klaczku- jacego.Zgodnie z wynalazkiem, enzymatycznie katalizowana przemiane substratu, zawierajacego weglowodany lub aminokwasy przez dzialanie nan enzymem, zawartym w komórkach mikroorganizmu, otrzymanych w wyniku hodowli, w odpowiednich warunkach, mikroorganizmu zdolnego do wytworzenia tego enzymu. Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze na substrat dziala sie enzymem, zawartym w komórkach mikroorganizmu, stosujac te komórki w postaci agregatu, otrzymanego przez uprzednie traktowanie calych komórek anionowym lub kationowym elektrolitem, stanowiacym srodek klaczkujacy.Stwierdzono, ze szczególnie korzystne wyniki osiaga sie, jezeli przed zastosowaniem do procesu enzyma¬ tycznie katalizowanej przemiany agregat komórek podda sie odwadnianiu przez suszenie albo wymrazanie. Od¬ wodniony agregat jest trwaly i zachowuje aktywnosc enzymatyczna w ciagu dluzszego czasu w temperaturze pokojowej.Proces wedlug wynalazku moze byc korzystnie stosowany do przeprowadzania glikozy w fruktoze za pomoca enzymu, powodujacego izomeryzacje glikozy. W tym przypadku stosuje sie komórki, pochodzace z mi¬ kroorganizmu, nalezacego do rodzaju Arthrobacter lub Streptomyces, Ciecz, zawierajaca glikoze, mozna prze¬ puszczac w sposób ciagly przez zloze, zawierajace sklaczkowane komórki, utrzymujac temperature zloza 50—90°C i korzystnie stosujac ciecz o wartosci pH = 6—10, przy czym wydajnosc przeksztalcenia glikozy we fruktoze wynosi 1—50% wydajnosci teoretycznej.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zamrozenie agregatów, zawierajacych cale komórki mikroorganizmów lub umieszczenie ich w warunkach powodujacych odwodnienie, nadaje sklaczkowanym komórkom pewna sztywnosc lub integralnosc strukturalna bez pogorszenia aktywnosci enzymu, powodujac tym samym to, ze substancja taka nadaje sie do stosowania w okresowych lub ciaglych procesach enzymatycznych. Na przyklad, przez zloze sklaczkowanych komórek mikroorganizmów mozna wielokrotnie przepuszczac roztwory substratu i zloze to nie traci w ciagu dluzszego czasu aktywnosci enzymatycznej ani zdolnosci przepuszczania cieczy z duza predkoscia.W celu przyspieszenia zadanej agregacji komórek stosuje sie rózne polielektrolitowe srodki klaczkujace.Naleza do nich polielektrolity anionowe, takie jak karboksy- podstawione poliakryloamidy, sulfonowany polisty¬ ren i kwasy wielokarboksylowe, polielektrolity kationowe, takie jak wieloaminy, polietylenoimina i kationowe poliakryloamidy, polikwasy, takie jak polilizyna i mineralne hydrokoloidy, takie jak aktywowana krzemionka.Dodatkowe przyklady polielektrolitów kationowych podano w publikacji M.F. Hoover, J. Macromol Sci. Chem.A3(6),str. 1327-1417(1970).W celu osiagniecia zadanej agregacji mozna stosowac polaczenie dwóch lub wiekszej liczby srodków klacz- kujacych. Wyboru odpowiedniego srodka klaczkujacego dla okreslonego przypadku dokonuje sie latwo, dodajac niewielkie ilosci róznych srodków do malych próbek roztworu lub zawiesiny substancji, zawierajacej enzym i porównujac strukture i wyglad powstalych agregatów komórek. W niektórych przypadkach korzystne jest sto¬ sowanie lacznie ze srodkami klaczkujacymi srodków ulatwiajacych saczenie i polimerycznych adsorbentów. Np. polimeiyczne adsorbenty amberlitowe, takie jak estry kwasu akrylowego i pomocnicze srodki ulatwiajace sacze¬ nie, takie jak ziemia okrzemkowa i azbest, wykazuja skuteczne dzialanie, gdy dodaje sieje do srodowiska w czasie klaczkowania. Sposób wedlug wynalazku nie jest jednak ograniczony do poprzednio wymienionych srodkówi stosujac podobne substancje uzyskuje sie równie zadowalajace wyniki.Srodek klaczkujacy dodaje sie do substancji, zawierajacej enzym, korzystnie w postaci roztworu lub zawie¬ siny. Niekiedy konieczne jest przed zmieszaniem nastawienie wartosci pH roztworu srodka klaczkujacego i/lub srodowiska, zawierajacego enzym. Zalezy to od stosowanego mikroorganizmu, trwalosci enzymu i wartosci pH, przy której srodek klaczkujacy jest najbardziej skuteczny. Klaczkowanie korzystnie prowadzi sie w temperaturze pokojowej, a ilosc potrzebnego srodka klaczkujacego, wynosi zazwyczaj 1-50% wagowych w stosunku do masy wilgotnych komórek lub preparatu enzymatycznego.Srodowisko, w którym prowadzi sie klaczkowanie nalezy mieszac dosc intensywnie, aby spowodowac zetkniecie substancji, zawierajacej enzym, ze srodkiem klaczkujacym. Nalezy unikac jednak nadmiernego miesza¬ nia, poniewaz stwarza to tendencje do pekania swiezo powstalych agregatów i jest sprzeczne z celem klaczkowa¬ nia. Dokladna regulacja mieszania daje trwale agregaty, umozliwiajac prawie calkowite odzyskanie substancji, zawierajacej enzym przy uzyciu typowych operacji, takich jak dekantacja, saczenie i odwirowywanie. Otrzymane agregaty mozna wprawdzie bez dalszej obróbki stosowac w procesach enzymatycznych, jednakze na skutek upakowania i osadzania sie tych agregatów w kolumnie maleje predkosc przeplywu i czas pracy takiej kolumny, pracujacej w sposób ciagly, jest znacznie krótszy.99 373 3 W celu unikniecie tego, przed zastosowaniem w procesach enzymatycznych, korzystnie wymraza sie lub suszy sklaczkowana substancje, zawierajaca enzym. Obróbka taka nie tylko zwieksza predkosc przeplywu roztworu substratu, lecz takze ulatwia operowanie sklaczkowanyrri materialem i umozliwia jego magazynowanie wciagu dluzszego okresu czasu. Temperatura wymrazania nie ma decydujacego znaczenia i wystarcza stosowanie temperatury 0°C lub nizszej. Czas wymrazania zalezy oczywiscie od stosowanej temperatury i od masy wymraza- nych agregatów. Otrzymana substancja sklaczkowana ma taka konsystencje, ze daje sie wytlaczac w rózne ksztalty, odpowiednie do stosowania w procesach enzymatycznych. Wytloczone agregaty stosuje sie wraz z obo¬ jetna substancja nosna do przygotowania wypelnienia kolumn do pracy ciaglej, badz tez wymraza sie je lub suszy przed uzyciem.Szczególnie korzystne jest suszenie sklaczkowanej substancji, gdyz umozliwia ono jej mielenie i przesiewa¬ nie wedlug rozmiarów czastek, co z kolei umozliwia wypelnianie kolumny produktem jednolitym. Suszenie sklaczkowanej substancji pozwala tez na przechowywanie jej przez dluzszy okres czasu w temperaturze pokojo¬ wej. Suszy sie w dowolny, dogodny sposób np. w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza lub pod zmniej¬ szonym cisnieniem w suszarni bebnowej, ale stosowana temperatura i czas suszenia nie powinny wplywac ujemnie na enzym. Czas suszenia jest rózny, korzystnie jednak suszy sie az do otrzymania dostatecznej kruchosci, umozliwiajacej mielenie.Sklaczkowana substancje stosuje sie w szeregu przemian katalizowanych enzymatycznie, takich jak izome¬ ryzacja, utlenianie, odwodornianie, hydroliza i redukcja. Substancje dostosowuje sie do procesu prowadzonego w sposób okresowy lub ciagly, ale przemiany, w czasie których nastepuje uwalnianie gazu, sa nieco mniej odpo¬ wiednie do prowadzenia w kolumnach, pracujacych w sposób ciagly. Ilosc substancji zawierajacej enzym, potrze¬ bna wdanym procesie, zalezy od wielu czynników, takich jak wlasciwa aktywnosc enzymatyczna substancji, zawierajacej enzym i jej dostepnosc dla substratu, jak równiez szybkosc i pozadany stopien przemiany. W opera¬ cjach prowadzonych w sposób ciagly w kolumnach, ilosc potrzebnej substancji zawierajacej enzym, zalezy takze od wymiarów kolumny i zadanej predkosci przeplywu.Substrat, korzystnie w postaci roztworu lub emulsji, poddaje sie dzialaniu sklaczkowanej substancji w okresie czasu, wystarczajacym do przeprowadzenia zadanej przemiany. Parametry procesu, takie jak temperatu¬ ra, wartosc pH i stezenie substratu, zaleza od trwalosci enzymu i warunków, w których przejawia on optymalna aktywnosc, odpowiednia dla danej przemiany. Produkt przemiany wyosobnia sie w dowolny dogodny sposób lub ewentualnie poddaje go dalszej obróbce.Sposób wedlug wynalazku jest wyjasniony w odniesieniu do okreslonych mikroorganizmów i enzymów. Na sterylnej pozywce, stanowiacej zródlo weglowodanu, azotu i soli nieorganicznych, hoduje sie wybrany szczep Arthrobacter, taki jak NRRL B - 3724, NRRLB-3725] NRRLB-3726, NRRLB-3727, lub NRRL B - 3728. W sposób, podany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3645848, prowa¬ dzi sie fermentacje w temperaturze 30°C, az do osiagniecia maksymalnej aktywnosci izomerazy, oznaczanej typowymi metodami. Wilgotne komórki w postaci zawiesiny w brzeczce stanowia wówczas zazwyczaj 4% wago¬ wych calej brzeczki. Do brzeczki, której wartosc pH doprowadzono uprzednio do 5,0, dodaje sie w postaci 2% wodnego roztworu, poliwinyloimidazoline, taka jak produkt o nazwie handlowej Primafloc C—7 (kationowy srodek klaczkujacy produkcji firmy Rohm and Haas w Filadelfl). Ilosc dodanego srodka klaczkujacego wynosi 0,25% wagowych w przeliczeniu na mase brzeczki. Dodawanie prowadzi sie lagodnie, mieszajac brzeczke. Two¬ rzenie sie agregatów calych komórek konczy sie zwykle w ciagu 10-15 minut. Przerywa sie wówczas mieszanie i masa sklaczkowanych komórek osadza sie na dnie kadzi fermentacyjnej. Komórki zbiera sie, dekantujac wiekszosc klarowanej brzeczki i odsaczajac sklaczkowane komórki pod zmniejszonym cisnieniem.Zebrane agregaty calych komórek zamraza sie i utrzymuje w ciagu 8 godzin w temperaturze —5°C, po czym przygotowuje sie z nich wypelnienie kolumny, stosujac material w postaci rozmrozonej. Podczas przygoto¬ wywania wypelnionej kolumny agregaty szlamuje sie w wodzie i zgniata mechanicznie, otrzymujac czastki o bar¬ dziej jednolitej wielkosci. Do tego celu nadaje sie mieszalnik Waringa pod warunkiem, ze mieszanie jest ograniczo¬ ne do bardzo krótkiego okresu czasu. Szlam wlewa sie do kolumny, wypelnionej czesciowo woda, w której nastepuje osadzanie sie komórek. Przez wypelniona kolumne przepuszcza sie roztwór glikozy o stezeniu do 50% wagowych, zawierajacy dostateczna ilosc jonów Mg** do uzyskania maksymalnej izomeryzacji, którego wartosc pH wynosi 6—10.W celu zwiekszenia przemiany glikozy na fruktoze i zahamowania wzrostu mikroorganizmów, stanowia¬ cych zanieczyszczenia, kolumne korzystnie ogrzewa sie do temperatury 50—75°C. Szybkosc przeplywu strumie¬ nia odcieku reguluje sie tak, aby uzyskac przemiane glikozy na fruktoze, wynoszaca 40—45% przemiany mozli¬ wej teoretycznie. Uzyskany sposobem wedlug wynalazku stopien przemiany glikozy na fruktoze, wynosi do 50% lub wiecej, zaleznie od stosowanej temperatury izomeryzacji. W miare potrzeby, dwie lub wiecej kolumny4 ^!Si^l""-.-,: 99373 ¦¦ z wypelnieniem moga pracowac szeregowo, a z kolumn mozna odzyskiwac komórki, stanowiace wypelnienie i stosowac je dalej do izomeryzacji glikozy. Aktywnosc izomerazy zostaje zachowana nawet wówczas, gdy przed ponownym uzyciem material komórkowy odzyskuje sie i'cli lodzi, wymraza lub suszy.Izomeryzacje glikozy na fruktoze prowadzi sie równiez przy zastosowaniu róznych sklaczkowanych szcze¬ pów Streptomyces. Nadaja sie do tego celu i szczepy S.albus, S.echinatur, S.achromogenes, S.phaeochromogenes, S.flavovirens i S.olivaceus. Klaczkowanie calych komórek lub enzymu bezkomórkowego, otrzymanych z hodo¬ wli róznych szczepów Streptomyces, prowadzi sie analogicznie, jak opisano dla Arthrobacter. Podobnie prowadzi sie tez izomeryzacje.Przyklad I. W wyjalowionej pozywce, zawierajacej 2% dekstrozy, 0,3% bialka miesnego, 0,1% ekstra¬ ktu drozdzowego, 0,6% /NK4/2HPO4, 0,2% KH2P04 i 0,01% MgS04 • 7H20, umieszcza sie szczep Arthrobacter NRRL B — 3728. Pozywka ta ma wartosc pH = 6,9. W ciagu 60 godzin w temperaturze 28°C prowadzi sie fermentacje, ciagle mieszajac pozywke. Po tym okresie czasu wartosc pH brzeczki wynosi 5,5. Do brzeczki dodaje sie roztwór odpowiedniego polielektrolitu, takiego jak Primafloc C-7, o stezeniu 2% wagowo/objetoscio¬ wych, otrzymujac ostateczne stezenie polielektrolitu 0,25% wagowo/objetosciowych. Wartosc pH roztworu poli¬ elektrolitu nastawia sie najpierw na 5 i dodaje sie go do wolno mieszanej brzeczki fermentacyjnej. Ewentualnie do brzeczki o stezeniu 0,5% wagowo/objetosciowych bezposrednio przed dodaniem roztworu polielektrolitu dodaje sie srodki ulatwiajace saczenie, takie jak celit i miesza lagodnie az do powstania trwalych agregatów komórek (okolo 10 minut). Nastepnie przerywa sie mieszanie i pozwala na aglomeracje agregatów komórek, co umozliwia oddzielenie wiekszosci przezroczystej brzeczki od substancji komórkowej. Substancje komórkowa odsacza sie nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem lub w inny, dogodny sposób. Otrzymane agregaty komórek przed uzyciem zamraza sie w temperaturze —5aC albo suszy w temperaturze 55°C. Aktywnosc izomerazy w otrzymanych agregatach, okreslona typowymi metodami, jest porównywalna z aktywnoscia enzymatyczna komórek wydzielonych z brzeczki fermentacyjnej przed obróbka srodkiem klaczkujacym i srodkiem ulatwiaja¬ cym saczenie. Ponadto analiza oddzielonej brzeczki fermentacyjnej wykazuje brak aktywnosci enzymatycznej, wskazujacy na calkowite oddzielenie izomerazy na drodze klaczkowania.Przyklad II. Przyklad ten przedstawia ciagla przemiane glikozy na fruktoze przy uzyciu sklaczkowa¬ nych komórek, otrzymanych jak w przykladzie I i przechowywanych w ciagu kilku godzin w temperaturze —5°C. Zamrozone sklaczkowane komórki zanurza sie w wodzie lub w syropie glikozowym. Mase komórkowa pozostawia sie do rozmrozenia i lagodnie kruszy mechanicznie lub za pomoca mieszania, otrzymujac czastki w przyblizeniu o jednolitych wymiarach. Otrzymany szlam utrzymuje sie wciagu 30 minut pod zmniejszonym cisnieniem, aby z czastek komórek usunac zokludowane gazy. Odgazowany szlam wlewa sie do kolumny o sre¬ dnicy 4,54 cm, wyposazonej w plaszcz grzejny i czesciowo wypelnionej woda lub syropem glikozowym.Aby otrzymac pozadany stopien konwersji glikozy, wypelniona kolumne ogrzewa sie do temperatury 60°C i przepuszcza sie przez nia, regulujac szybkosc przeplywu, 2M roztwór glikozy, zawierajacy 0,004 M MgCl2 * 6H20. Stopien przemiany wynosi do 50% przemiany teoretycznej.P,r z y k l a d III. Przyklad ten przedstawia przygotowanie suszonych sklaczkowanych komórek i ich za¬ stosowanie do ciaglej izomeryzacji glikozy na fruktoze, prowadzonej w kolumnie. Sklaczkowanie osiaga sie dzieki lacznemu zastosowaniu anionowych i kationowych srodków klaczkujacych. 5 czesci swiezej hodowli Arthrobacter (pH = 5,6) zadaje sie 1 czescia roztworu kationowego srodka klaczkujacego Primafloc C-7 o steze¬ niu 1% wagowo/objetosciowy. Brzeczke z dodatkiem srodka klaczkujacego miesza sie powoli az do powstania duzych skupien komórek. Nastepnie dodaje sie 1 czesc roztworu anionowego srodka klaczkujacego Primafloc A—10 o stezeniu 1% wagowo/objetosciowym i kontynuuje mieszanie az do rozpadniecia sie duzych agregatów na drobne czastki. Sklaczkowane komórki pozostawia sie az do agregacji, jak w przykladzie I, oddziela przezro¬ czysta brzeczke i sklaczkowane komórki oddziela przez saczenie pod zmniejszonym cisnieniem. Przed dodaniem do brzeczki nastawia sie przy pomocy wodorotlenków wartosc pH obu roztworów srodków klaczkujacych.Wartosc pH roztworu kationowego srodka Primafloc C-7 doprowadza sie do 5, a anionowego srodka Primafloc A—10 do 7. Koncowa wartosc pH hodowli poddawanej klaczkowaniu wynosi 5,6. Odsaczone komórki wytlacza sie przez odpowiednia matryce i suszy w ciagu 24 godzin w suszarce w temperaturze 55°C. Otrzymana sucha substancje granuluje sie w mlynie i przesiewa na sicie 20—40 mesz. Wysuszone granulowane komórki umieszcza sie w kolumnie jako wypelnienie i prowadzi izomeryzacje glikozy, jak w przykladzie II.Przyklad IV. Na pozywce, zawierajacej glikoze, fruktoze, MgS04 • 7H2 O, KH2 P04, /NH4 /2 HP04, mocznik i namokowy wyciag z kukurydzy, hoduje sie szczep Aspergillus niger. Pod koniec okresu fermentacji do pozywki dodaje sie polielektrolit kationowy w ilosci równowaznej 0,3% wagowych odniesionych do objetosci brzeczki. Calosc miesza sie wystarczajaco intensywnie, aby powstaly agregaty komórek. Sklaczkowane komórki oddziela sie i umieszcza w kolumnie o odpowiednich wymiarach, wyposazonej w plaszcz grzejny. Wypelniona V99373 . ' 5 kolumne ogrzewa sie do temperatury 40°C i przepuszcza sie przez nia 5% roztwór cukru inwertowanego, otrzy¬ mujac odciek, zawierajacy kwas glikonowy i fruktoze.P r z y k"l ad V. Na pozywce, zawierajacej 0,7% ksylozy, 0,3% dekstrozy, 0,5% NaCl, 0,5% MgS04 • 7H20 i 0,024% CoCl2 • 6H2 O hoduje sie szczep Streptomyces olivaceus NRRL B - 3583. Fermentacja przebiega w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C. Do brzeczki fermentacyjnej dodaje sie roztwór polielektrolitu kationowego o stezeniu 2% wagowo/objetosciowych w ilosci odpowiadajacej 0,05% wagowo/objetosciowych su¬ chego srodka kraczkujacego. Brzeczke miesza sie intensywnie, aby przyspieszyc agregacje komórek. Nastepnie przerywa sie mieszania i sklaczkowanym komórkom pozwala sie osiasc. Agregaty komórek oddziela sie, jak w przykladzie I. Sklaczkowane komórki suszy sie wciagu 24 godzin w temperaturze 60°C, po czym produkt kruszy sie lagodnie tak, aby nadawal sie do pracy w kolumnie. Pokruszony material komórkowy umieszcza sie w kolumnie z plaszczem, wypelnionej czesciowo 1,0 M roztworem glikozy.Wypelniona kolumne ogrzewa sie do temperatury 70°C i przepuszcza sie przez nia 1,0 M roztwór glikozy, zawierajacy 0,04 M MgCl2 • 6H20 o warto¬ sci pH doprowadzonej do 8, powodujac przemiane glikozy na fruktoze.Przyklad VI. Na pozywce zawierajacej melase hoduje sie szczep Saccharomyces cerevisiae. Po odpo¬ wiednim okresie fermentacji do brzeczki dodaje sie roztwór polielektrolitu i miesza wystarczajaco intensywnie, aby doprowadzic do agregacji komórek. Sklaczkowane komórki oddziela sie i stosuje w operacji przemiany sacharozy w cukier inwertowany, prowadzonej w sposób ciagly w kolumnie w temperaturze 60aC. Przechodzacy przez kolumne 0,5 M roztwór sacharozy ma wartosc pH = 5.Przyklad VII. Na pozywce, zawierajacej otreby pszenne, zmieszane z dodatkiem weglowodanów, sub¬ stancji mineralnych i buforujacych, hoduje sie szczep Aspergillus oryzae. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 30°C, po czym do bulionu dodaje sie roztwór odpowiedniego polielektrolitu. Agregacje sklaczkowanych komórek wspomaga sie delikatnym mieszaniem. Nastepnie sklaczkowane komórki umieszcza sie w kolumnie z plaszczem grzejnym i ogrzewa do temperatury 50°C. Przez kolumne przepuszcza sie obojetny 0,2 M roztwór acetylo-DL-metioniny, zawierajacy 5X10~4 M Co++. Otrzymuje sie odciek, zawierajacy L-metioni- ne. PL