DE19547748A1

DE19547748A1 - Verfahren zur Behandlung einer Fermentationsbrühe, die Polysaccharid enthält

Info

Publication number: DE19547748A1
Application number: DE1995147748
Authority: DE
Inventors: Francis X Quinn; Frederic Monot
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1996-06-27
Also published as: FR2728269B1; GB2296249A; GB9525951D0; FR2728269A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer wäßrigen Lösung einer Fermentationbrühe, welche Exopoly saccharide enthält. Dieses Verfahren erlaubt insbesondere, die Lösung sehr einfach zu reinigen, indem das Polysaccharid in einer der flüssigen Phasen konzentriert wird, die sich im Ver laufe des Verfahrens abscheiden.

Die Polysaccharidbrühen werden durch ein wohlbekanntes Fermen tierungsverfahren erhalten: ein Polysaccharid produzierender Mikroorganismus (Pilz, Bakterium) wird in einem wäßrigen Nähr medium, das ein Kohlenstoffsubstrat umfaßt, ganz besonders die Glukose, kultiviert.

Für die Produktion von Xanthan kann man beispielsweise Xanthomo nas campestris verwenden, für die Produktion von Scleroglucan kann man Sclerotium rolfsii oder Sclerotium glucanicum verwen den, und für Schizophyllan den Pilz Schizophyllum commune.

Durch die US-PSen 4,326,052, 4,326,053, 4,377,636 und 4,385,123 kennt man das Gellan genannte Polysaccharid S-60, dessen Ver wendung in wäßriger Lösung als Verdickungs-, Gelier- und Stabi lisierungsmittel auf dem Gebiet der Agrar- bzw. Ernährungswirt schaft, der Farben oder der Klebstoffe bekannt ist.

Das Gellan ist ein exozelluläres Polysaccharid, das durch das Bakterium Pseudomonas elodea (ATCC 31461), manchmal auch als Auromonas elodea klassifiziert, produziert wird. Dieses Bak terium wurde aus Pflanzenmaterial (clodea), das in Pennsylvanien gesammelt wurde, isoliert. Das Bakterium wurde durch Kang und Veeder charakterisiert und in der US-PS 4,326,053 beschrieben.

Das Gellan wird auch durch aerobe Fermentierung produziert.

Das Verfahren zur Extraktion von Gellan aus der Fermentations brühe, das klassischerweise verwendet wird, umfaßt insbesondere eine Pasteurisierung, welcher eine Entfernung der Zellen durch Filtrieren oder. Zentrifugieren, dann eine Ausfällung des Poly saccharides mit einem Lösungsmittel, wie Isopropanol, folgt. Die Ausfällung ist aber ein schwer durchzuführendes Verfahren, da es große Mengen an Lösungsmittel, ein Erhitzen und ein Verdünnen der Brühe vor Zugabe des Lösungsmittels erfordert. Darüber hi naus kann es eine Aggregation des Polymeres in Lösung hervorru fen.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Be handlung einer wäßrigen Lösung einer Fermentationsbrühe, welche Exopolysaccharide von mikrobiellem Ursprung enthält. Bei dem Verfahren verursacht man eine Phasentrennung der Lösung durch Zugabe einer bestimmten Menge eines Tensides bzw. grenzflächen aktiven Stoffes.

Man kann das Tensid Tropfen für Tropfen ohne Rühren einbringen.

Man kann zwischen einschließlich 0,1 und 10 g/l Tensid pro 1 g/l in der Lösung enthaltenem Polysaccharid einbringen und bevorzugt zwischen einschließlich 1 und 5 g/l Tensid.

Man kann eine erste Phase gewinnen, die hauptsächlich praktisch gereinigtes Polysaccharid enthält.

Man kann die erste Phase durch Zugabe von Trifluortrichlorethan behandeln, man kann ein Homogenisieren, dann ein Zentrifugieren durchführen, um im wesentlichen vollständig die geringe verblei bende Konzentration an Proteinen zu entziehen.

Eine zweite Phase kann hauptsächlich Rückstände und das Tensid umfassen.

Das Tensid kann anionisch oder nicht-ionisch sein.

Das Tensid kann Natriumdodecylsulfat sein.

Die Polysaccharide können aus der Gruppe ausgewählt werden, die durch das Gellan, Welan, Rhamsan, Xanthan, Scleroglucan, Schizo phyllan, Curdlan, Pullulan, die Dextrane, Alginat und Succinglu can gebildet ist.

Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, welche eine Fermentationsbrühe, die Polysaccharide mikrobiellen Ursprungs enthält und eine nützliche Menge Tensid umfaßt.

Alle derzeit bekannten Anwendungen von Polysacchariden mikro biellen Ursprunges können bei der Verwendung des durch das Ver fahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Produktes einge setzt werden. Bevorzugte Anwendungen können sein: als Mittel zur Verdickung, Stabilisierung oder Viskosifizierung, in den Berei chen Lebensmittel, Kosmetik, Farben bzw. Anstrichfarben, Papier industrie oder Flüssigprodukten der Erdölbohrung.

Des weiteren zeigt, im Fall von Gellan, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Produkt insbesondere den Vorteil, leicht in einer veresterten Form erhalten zu werden.

Bei dem bekannten Verfahren ist der Erhalt von handelsüblichem Gellan das Ergebnis von drei Schritten:

- natives Gellan wird direkt aus der Fermentationsbrühe nach ihrem Erhitzen auf 95°C während 5 Minuten und Ausfällung durch Isopropylalkohol erhalten,
- der zweite Schritt der Entesterung des nativen Gellans besteht in der Erhöhung des pH-Wertes der Lösung auf 10 mit Natron- oder Kalilauge, wenn sich die Fermentationsbrühe bei 80°C befindet. Man hält diesen pH-Wert während 10 Minuten auf diesem Wert,
- die Lösung wird dann durch Schwefelsäure neutralisiert, dann wird das Produkt mit Alkohol ausgefällt. Das nicht-geläu terte bzw. nicht-geklärte Gellan ist nahezu zu 50% aus unlös lichem Material zusammengesetzt, das hauptsächlich aus ganzen Zellen und zellulären Rückständen besteht, diese Verunreinigun gen werden in diesem Fall vom entesterten Produkt durch Zentri fugieren oder Filtrieren bei 70°C entfernt.

Diese Arbeitsweise verursacht die Spaltung der Esterbindungen der Seitengruppen des nativen Polysaccharids, welches ein Acetat und ein Glycerat enthält. Das entesterte bzw. von Veresterungen befreite Polysaccharid wird unter dem Namen GELRITE oder KELCO- GEL von der Firma MERK & Co. (USA) vertrieben. Die Beschreibung des Produktes und eines Herstellungsverfahrens sind in den US- PSen 4,326,052, 4,326,053, 4,377,636 und 4,385,123 beschrieben.

Man weiß, daß die aus Gellan hergestellten Gele mit dem Grad der Entesterung des Polysaccharides mehr und mehr brüchig werden. Wenn man Gele ausgehend von entestertem Gellan herstellt, bei spielsweise zur Verwendung in der Agrarwirtschaft, muß man we sentliche Mengen an Kationen zusetzen, um das polymorphe Gitter bzw. Netzwerk zu stabilisieren. Um die Leistungsfähigkeit ihrer entesterten Gellane zu verbessern, fügt die Firma MERK & Co. (USA) im allgemeinen die folgenden Konzentrationen an Kationen zu: Na⁺ (2 mg/g), K⁺ (20 mg/g), Ca⁺⁺ (5 mg/g), Mg⁺⁺ (1,5 mg/g).

Im Verhältnis zu dem mit dem handelsüblichen entesterten Gellan erhaltenen Gelen, sind die mit dem gemäß der vorliegenden Erfin dung erhaltenen entesterten Gellan erhaltenen Gele weniger brü chig bzw. bröckelig bzw. spröde und können ihre erhöhte Stabili tät gegenüber Hochtemperaturen oder starker Salzhaltigkeit zei gen. Tatsächlich ist die Struktur des Gellans so, daß es klar ist, da die veresterten Anteile ihm eine sehr gute Stabilität verleihen.

Beim Studium der nachfolgenden Beispiele wird die Erfindung besser verstanden werden und ihre Vorteile werden deutlicher erscheinen.

Versuch 1

- Man stellt eine wäßrige Gellanlösung aus einer Fermenta tionsbrühe her, welche etwa 9,2 g/l Gellan und 3,3 g/l Zellen enthält, die zur Hälfte aus Proteinen besteht. Die Lösung wird auf die Konzentration von 1 bis 2 g/l Gellan verdünnt.
- Man rührt die Lösung bei etwa 300 bis 750 Umdrehungen- Minute bei einer Temperatur von 30°C.
- Man setzt der Gellanlösung ein gleiches Volumen einer wäßrigen Lösung von SDS (Natriumdodecylsulfat) Tropfen für Trop fen ohne Rühren und bei 30°C zu, im Takt von etwa 1 Tropfen pro Sekunde.
- Eine Phasentrennung findet in dem Maße der Zugabe von Tensid statt.
- Man bringt die so erhaltene Lösung in ein Kühlmittel bei etwa 4°C, beispielsweise während 1 bis 30 Tagen ein, um die Ausfällung von freiem Tensid in der Lösung zu beschleunigen.
- Man entfernt mit einer Spritze die überständige Phase, welche hauptsächlich praktisch gereinigtes Gellan enthält. Etwa 75% an ursprünglichem Gellan sind in dieser Phase enthalten. Es soll festgehalten werden, daß es möglich ist, die Vorgehensweise an der verbleibenden Lösung zu wiederholen.
- Man zentrifugiert die überständige Phase bei 12000 Um drehungen/Minute während 30 Minuten bei 4°C.
- Man läßt die Gellanlösung abklären, dann führt man eine Abtrennung der in der Gellanlösung verbleibenden Proteine durch, indem man der Lösung eine im wesentlichen gleich Menge Trifluor trichlorethan zusetzt. Man mischt zur Homogenisierung, dann führt man ein Zentrifugieren durch.

Der erhaltene Überstand ist reich an verestertem Gellan und enthält sehr wenig Proteine. Der gemessene Wert an Proteinen liegt unter der Bestimmungsgrenze des Biuret-Verfahrens, etwa unter 0,2 g/l. Das Biuret-Verfahren ist von D. Herbert, P.J. Phipps und R.E. Strange in "Methods in microbiology, Band 5-B", Herausg. J.R. Norris und D.W. Ribbons, Academic Press, London, Seite 209-344 (1971) beschrieben.

Man kann die rückständigen Proteine auch durch Dialyse entfer nen, indem man eine Membran mit einer Schnittstelle von 10⁴bis 10⁵ Dalton verwendet.

Versuch 2

Das Verfahren zur Behandlung einer Polysaccharidbrühe gemäß der Erfindung wurde mit einer Xanthanbrühe wiederholt.

Das während dieses Versuches verwendete Xanthan besitzt eine Molekularmasse von 5 × 10⁶, einen Pyruvatgehalt von 70% und einen Acetatgehalt von 100%.

Die Konzentration an Xanthan in der Brühe liegt in der Größen ordnung von 30 g/l.

Eine wäßrige Lösung der Brühe wird mit 10 Gramm Brühe und 80 ml reinem Wasser hergestellt. Die Konzentration an Xanthan in der Lösung beträgt etwa 1 g/l.

Ein gleiches Volumen einer wäßrigen Lösung des Tensids SDS (Na triumdodecylsulfat) von 5 g/l wird Tropfen für Tropfen bei Umge bungstemperatur und ohne Rühren zugefügt.

Während der Zugabe des Tensides findet eine Phasentrennung statt. Die überständige Phase ist reich an Xanthan, mit einer Ausbeute von über 75%.

Die Konzentration an Protein in der an Xanthan reichen Phase liegt unter der Bestimmungsgrenze des Biuret-Verfahrens.

Die zwei Versuche wurden mit weiteren Tensiden, als dem SDS, wiederholt, beispielsweise für die anionischen Tenside:

- Natrium-α-Olefinsulfonat
- ethoxylierte Alkoholphosphate
- Natriumlignosulfonat
- Natriumalkyllaurylsulfonat
- Natrium-Dioctylsulfosuccinat
- Sophorolipid in Säureform
- Sophorolipid in roher Form, pH = 6
- Sophorolipid in roher Form, pH = 3,85.
Für die nicht-ionischen: die ethoxylierten Alkylphenole.

Die erhaltenen Ergebnisse sind sehr ähnlich mit denen, welche mit SDS erhalten wurden, was zeigt, daß die anionischen oder nicht-ionischen Tenside in dem Behandlungsverfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können.

Man muß festhalten, daß das verwendete Tensid in der am wenig sten an Polysaccharid reichen Phase konzentriert ist und für weitere Verwendungen, nach einem Abtrennungsschritt der Rück stände, Proteine und Zellen, gemäß bekannten Verfahren, zurück gewonnen werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung einer wäßrigen Lösung einer Fer mentationsbrühe, welche Exopolysaccharide von mikrobiellem Ur sprung enthält, im Hinblick auf ihre Extraktion, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Phasentrennung der Lösung durch Zugabe einer bestimmten Menge eines Tensides verursacht, das Tropfen für Tropfen ohne Rühren eingebracht wird und dadurch daß man eine überständige Phase gewinnt, welche hauptsächlich praktisch gereinigtes Polysaccharid enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen einschließlich 0,1 und 10 g/l Tensid pro 1 g/l Polysac charid, das in der Lösung enthalten ist, und bevorzugt zwischen einschließlich 1 und 5 g/l Tensid einbringt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die überständige Phase durch eine Zugabe von Trifluortrichlorethan behandelt, daß man ein Homogenisieren, dann ein Zentrifugieren durchführt, um im wesentlichen vollstän dig diese geringe Restkonzentration an Proteinen zu entfernen.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tensid aus einer zu der überstehen den Phasen unteren Phase zurückgewinnt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid anionisch oder nicht-ionisch ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid Natriumdodecylsulfat ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharide aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Gellan, Welan, Rhamsan, Xanthan, Scleroglucan, Schizophyllan, Curdlan, Pullulan, den Dextranen, Alginat und Succinglucan besteht.