CN106220521A - 一种全膜提取l‑异亮氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基酸生产技术领域，公开了一种全膜提取L‑异亮氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）微滤膜过滤和絮凝除杂，步骤2）超滤膜过滤，步骤3）反渗透膜浓缩，步骤4）浓缩结晶。本发明通过膜技术结合絮凝剂除杂，工艺简单可行，大大提高了产品的收率和纯度。

Description

一种全膜提取L-异亮氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种全膜提取L-异亮氨酸的方法。

背景技术

L-异亮氨酸（L-isoleucine）是人体必需氨基酸，也是三种支链氨基酸之一，因其具有特殊的结构和功能，在人体生命代谢中具有特别重要的地位。它的分子内有2个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体，自然界中存在的仅为L-异亮氨酸。L-异亮氨酸作为人体八种必需氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、化妆品和农业等领域。食品上主要用于强化、平衡各种氨基酸，提高食品的营养价值。医药上，三种支链氨基酸组成的复合氨基酸输液以及大量用于配置治疗型特种氨基酸药物，可取代糖而提供能量，是比较昂贵的氨基酸原料之一。由于L-异亮氨酸和L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，不仅可以使纯水和含有无机酸和盐的水溶液成凝胶而且可以使有机溶剂和油成胶状，可以制备成水凝胶，其在生物医药、食品行业等领域被广泛应用。

目前，L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。工业生产上实施的大部分为发酵法。

1） 提取法：L-亮氨酸在蛋白质中的含量相对较多，比如干酪素、人发、角蛋白、血色素等。在酸性条件下将蛋白质水解，用碱中和使亮氨酸沉淀，然后用β-萘矾酸使沉淀结晶。最后用离子交换法、层析法分离亮氨酸。国内仍有一些工厂利用水解天然蛋白质分离提取亮氨酸，是因为提取法生产亮氨酸对设备和技术要求不高，但是利用这种方法得到的亮氨酸产品纯度不高，不能用于药品，同时还费时、污染严重、收率低、不适合大规模工业化生产。

2）化学合成法：化学合成法又分 Storeker法、α-卤代酸法、相转移催化法等。Storeker法是将异戊醛制成氰醇再制成氨基睛后水解，或将异戊醛先制成乙内酞尿衍生物后加压加热水解；α-卤代酸法是将异己酸在三氯化磷存在的情况下加入溴生成α-溴异己酸，再与氨作用生成亮氨酸。相转移催化法是利用活化氨基酸酯在TEBA和50% NaOH的二氯甲烷水浓液中与卤代烷反应合成亮氨酸。

3）发酵法：通过微生物发酵来生产L-异亮氨酸具有成本低，反应条件温和，易于大规模生产等优点，因此这是目前用来生产L-异亮氨酸最主要的方法。发酵法分为添加前体发酵和直接发酵两种。早期异亮氨酸发酵是利用芽孢杆菌、假单胞菌等菌种使用葡萄糖等作为发酵碳源，再添加特定的前体物质（如α-氨基丁酸、α-羟基丁酸、D-苏氨酸、α-酮基异戊酸等）以避免氨基酸合成途径的反馈抑制，经微生物作用将其有效地转变为异亮氨酸。直接发酵法是在微生物原来自身具有合成所需氨基酸基础上，通过诱变处理，筛选出各种营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-异亮氨酸的目的。

L-异亮氨酸应用于食品方面，主要用于食品强化，使各种氨基酸平衡，提高食品的营养价值。在医药方面，主要用于配制复合氨基酸制剂，特别应用于高支链氨基酸输液（如3H输液等）及口服液（肝安干糖浆等）。此外，由于L-异亮氨酸和L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。在国外，还将其大量用于乳牛催乳以及饲料添加剂，以及将L-异亮氨酸添加到饮料中生产功能饮料等。

全膜法是围绕先进的膜科技而提出的全新的工艺设计理念，主要是将不同的膜工艺有机地组合在一起。目前，国内外主要将全膜法应用于废水处理，一般以常规水源或经生化、过滤等常规处理后的生物发酵液为进水，采用“微滤、超滤、纳滤、反渗透”四种膜分离的技术的组合工艺，分别作为除菌体、除蛋白、除色素、脱盐等目的。

全膜法高效提取L-异亮氨酸绿色新工艺，即在整个L-异亮氨酸的提取工艺过程中，全部采用膜组件来完成的一种新技术新工艺，将全膜法应用于L-异亮氨酸提取的概念为国内外首创。

随着近年来膜技术在国内外得到广泛的推广，并且膜成本在不断的下降，膜分离纯化技术应用到L-异亮氨酸提取过程中将产生良好的经济效益。应用膜技术不仅能提高产品质量还能减少废水的排放，保护环境，实现自动化控制和清洁生产，降低生产成本，还能改善工人的工作环境，提高工作效率。目前国内外膜技术的应用多采用单一膜运行，解决某一具体问题，并没有形成一种全膜法提取L-异亮氨酸的工艺。申请人之前的专利技术2009100187695尽管也采用了膜提取技术，该技术不受温度的影响，对热敏性物质没破坏，但是产品收率和纯度还有待提高，达不到医药级别水平，亟待需要改进。

发明内容

本发明的目的是为解决现有技术存在生产成本高、工艺复杂、纯度低等技术问题，提供一种全膜提取L-异亮氨酸的方法，以克服现有技术的不足。

本发明是通过以下技术方案进行：

一种全膜提取L-异亮氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）微滤膜过滤和絮凝除杂，步骤2）超滤膜过滤，步骤3）反渗透膜浓缩，步骤4）浓缩结晶。

具体地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）微滤膜过滤和絮凝除杂：将L-异亮氨酸发酵液通过微滤膜一次过滤，得到发酵液的微滤透析液和菌体蛋白，菌体蛋白经烘干后出售；然后添加占微滤透析液1%（w/w）的絮凝剂，200转/min搅拌10min，然后静置120min，再进行微滤膜二次过滤，收集沉淀和上清液；

步骤2）超滤膜过滤：将步骤1）中的上清液通过超滤膜过滤，得到超滤透析液和浓缩液，浓缩液和步骤1）的沉淀混合，经烘干后用来生产饲料蛋白；

步骤3）反渗透膜浓缩：将步骤2）中的超滤透析液通过反渗透膜浓缩，得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水直接回用于生产；

步骤4）浓缩结晶：将步骤3）中的反渗透浓缩液通过真空浓缩至L-异亮氨酸含量为45%（w/w），然后降至室温，离心得到L-异亮氨酸粗品；将粗品配制成浓度为5-8%（w/w）的溶液，添加针剂活性炭，添加量为0.5-3.0%（w/w），处理时间为1h，pH5.5-6.5；然后再次浓缩至L-异亮氨酸含量40%（w/w），再降至室温，离心得到L-异亮氨酸粗品；将粗品配制成浓度为5-8%（w/w）的溶液，添加针剂活性炭脱色，添加量为0.1-1.0%（w/w），处理时间为1h，pH5.5-6.5；然后浓缩至L-异亮氨酸含量35%（w/w），再降至室温，离心、干燥得到L-异亮氨酸产品。

所述絮凝剂按照如下工艺制备而得：

1）往淀粉中加占淀粉两倍质量的纯化水，搅拌均匀得到悬浊液，然后加入与淀粉等质量的羧甲基纤维素钠，200转/min搅拌30min，然后置于80℃烘干至水分含量5%（质量百分比）以下，得到改性淀粉；

2）按照5:1:0.2的质量比取壳聚糖、腐植酸钠以及果胶，混合搅拌均匀，然后添加占壳聚糖两倍质量的2M的氢氧化钠水溶液，30KHz的超声10min，最后500转/min搅拌3min，得到改性壳聚糖；

3）将玉米秸粉、海泡石分别粉碎得到玉米秸秆粉和海泡石粉，将玉米秸秆粉、海泡石粉以及硅藻土按照3:1:1的质量比混合搅拌均匀，添加到占硅藻土5倍重量的浓度为1M的氢氧化钠溶液中，200转/min搅拌120min，然后过滤，干燥，研磨成粒径为10-20目的粉末；

4）将改性淀粉、改性壳聚糖以及步骤3）所得粉末按照5:3:2的质量比混合搅拌均匀，然后置于密闭反应釜中，以2℃/s的升温速率升至150℃，保温30min，取出，投入到搅拌器中，500转/min搅拌3min，得到混合料，置于烘箱中，80℃烘干90min，取出，粉碎即得。

优选地，

所述微滤膜一次过滤、二次过滤的条件均为：微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为50℃；

所述超膜过滤的条件为：超滤膜截留分子量为200Da，超滤温度为40℃；

所述反渗透膜浓缩条件为：温度为30-50℃，工作压力：进压为1-40bar，出压为1-36bar，压力差为1-34bar。本发明主要得到了下述三种产品：高纯度优质菌体蛋白、饲料蛋白和高品质L-异亮氨酸。

本发明可以将L-异亮氨酸生产过程中产生的副产物进行资源化利用，而且节能减排，因此为L-异亮氨酸产品的高效提取提供了一种新的绿色工艺。

该发明工艺具有以下几个突出的优点：

1、通过膜技术结合新型絮凝剂除杂，工艺简单可行，相对于申请人之前的专利技术，大大提高了收率和纯度，获得了高品质产品，企业收益相应增加；

2、本发明提供一种新型絮凝剂，适合氨基酸发酵液纯化，避免化学物质，絮凝除杂效果好，成本低廉，环保无污染；通过添加本发明絮凝剂可提高收率5%以上，纯度可提高20%以上；

3、采用微滤除菌体，菌体蛋白可实现98%回收，比传统工艺中气浮法提取蛋白高20%，符合环保要求的同时提高了菌体蛋白副产物的品质，增加了副产物的价值，高值化明显；

4、采用超滤去除色素、胶体和大分子物质，膜的过滤精度高，提升后序L-异亮氨酸滤液质量，利于L-异亮氨酸提取，提高产品品质；通过控制洗水量，膜过滤后收率提高且得到质量较好的滤液，滤液透光达90%以上；

5、采用反渗透法浓缩超滤透析液，实现冷浓缩，对后序的浓缩节约了大量蒸汽，而且过程中产生纯净水可直接回用于生产作为配料用水，节能减排效果显著，同时可提高产品浓度；

6、膜过滤后料液透光较高，操作不受温度的影响，对热敏性物质没破坏，收率高、质量好，不发生相变，可以较好地保存产品性质，同时具有快速、经济的特点；

7、整个膜再生阶段各种膜洗水综合处理，几乎无废水的排放，真正实现绿色制造，达到闭路循环；

8、与传统工艺相比，本发明彻底淘汰了离子交换工序，节省大量酸碱，避免浓度废水的产生。本发明大幅度提高了产品质量，降低了生产成本，减少了废水的排放，提高了工作效率，在整个L-异亮氨酸的提取工艺过程中实现了自动化控制和清洁生产，是一种全部采用膜组件来完成的一种新技术新工艺。同时，在膜的再生整个过程中综合利用酸、碱洗水，实现了节能降耗的目的。

总之，采用“全膜法”结合新型絮凝剂处理可将澄清与除菌一步完成，所得滤液清澈透亮，为后提取工序创造良好条件，同时大幅节约酸、碱及水的用量，而且提高了产品收率，还可以高效回收菌体，减轻环保压力，与传统的工艺相比，全膜法提取工艺的经济效益主要体现在两个方面，一是成本的降低，二是产品质量的提高，因此，本发明具有显著的经济效益、社会效益和环保效益。

具体实施方式

以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本发明创新精神的限制。

实施例1

一种全膜提取L-异亮氨酸的方法，其包括如下步骤：

步骤1）微滤膜过滤和絮凝除杂：将质量含量为1.83%的1350kg L-异亮氨酸发酵液通过微滤膜一次过滤，得到发酵液的微滤透析液和菌体蛋白，菌体蛋白经烘干后作为优质菌体蛋白出售；然后添加占微滤透析液1%（w/w）的絮凝剂，200转/min搅拌10min，然后静置120min，微滤膜二次过滤，收集沉淀和上清液；

所述微滤膜一次过滤、二次过滤的条件均为：微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为50℃；

步骤2）超滤膜过滤：将步骤1）中的上清液通过超滤膜过滤，得到超滤透析液和浓缩液，浓缩液和步骤1）的沉淀混合，经烘干后用来生产饲料蛋白；所述超膜过滤的条件为：超滤膜截留分子量为200Da，超滤温度为40℃；

步骤3）反渗透膜浓缩：将步骤2）中的超滤透析液通过反渗透膜浓缩，得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水直接回用于生产，反渗透膜浓缩条件为：温度为40℃，工作压力：进压为20bar，出压为16bar，压力差为4bar；

步骤4）浓缩结晶：将步骤3）中的反渗透浓缩液通过真空浓缩至L-异亮氨酸含量为45%（w/w），然后降至室温，离心得到L-异亮氨酸粗品；将粗品配制成浓度为8%（w/w）的溶液，添加针剂活性炭，添加量为3.0%（w/w），处理时间为1h，pH 5.5；然后再次浓缩至L-异亮氨酸含量40%（w/w），再降至室温，离心得到L-异亮氨酸粗品；将粗品配制成浓度为8%（w/w）的溶液，添加针剂活性炭脱色，添加量为1.0%（w/w），处理时间为1h，pH 6；然后浓缩至L-异亮氨酸含量35%（w/w），再降至室温，离心、干燥得到L-异亮氨酸产品21.32kg。经检测：L-异亮氨酸的提取率为86.5%，HPLC检测纯度为99.3%。

所述絮凝剂按照如下工艺制备而得：

1）往淀粉中加占淀粉两倍质量的纯化水，搅拌均匀得到悬浊液，然后加入与淀粉等质量的羧甲基纤维素钠，200转/min搅拌30min，然后置于80℃烘干至水分含量5%（质量百分比）以下，得到改性淀粉；

2）按照5:1:0.2的质量比取壳聚糖、腐植酸钠以及果胶，混合搅拌均匀，然后添加占壳聚糖两倍质量的2M的氢氧化钠水溶液，30KHz的超声10min，最后500转/min搅拌3min，得到改性壳聚糖；

3）将玉米秸粉、海泡石分别粉碎得到玉米秸秆粉和海泡石粉，将玉米秸秆粉、海泡石粉以及硅藻土按照3:1:1的质量比混合搅拌均匀，添加到占硅藻土5倍重量的浓度为1M的氢氧化钠溶液中，200转/min搅拌120min，然后过滤，干燥，研磨成粒径为10-20目的粉末；

4）将改性淀粉、改性壳聚糖以及步骤3）所得粉末按照5:3:2的质量比混合搅拌均匀，然后置于密闭反应釜中，以2℃/s的升温速率升至150℃，保温30min，取出，投入到搅拌器中，500转/min搅拌3min，得到混合料，置于烘箱中，80℃烘干90min，取出，粉碎即得。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种全膜提取L-异亮氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）微滤膜过滤和絮凝除杂，步骤2）超滤膜过滤，步骤3）反渗透膜浓缩，步骤4）浓缩结晶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）微滤膜过滤和絮凝除杂：将L-异亮氨酸发酵液通过微滤膜一次过滤，得到发酵液的微滤透析液和菌体蛋白，菌体蛋白经烘干后出售；然后添加占微滤透析液1%（w/w）的絮凝剂，200转/min搅拌10min，然后静置120min，再进行微滤膜二次过滤，收集沉淀和上清液；

步骤2）超滤膜过滤：将步骤1）中的上清液通过超滤膜过滤，得到超滤透析液和浓缩液，浓缩液和步骤1）的沉淀混合，经烘干后用来生产饲料蛋白；

步骤3）反渗透膜浓缩：将步骤2）中的超滤透析液通过反渗透膜浓缩，得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水直接回用于生产；

步骤4）浓缩结晶：将步骤3）中的反渗透浓缩液通过真空浓缩至L-异亮氨酸含量为45%（w/w），然后降至室温，离心得到L-异亮氨酸粗品A；将粗品A配制成浓度为5-8%（w/w）的溶液，添加针剂活性炭，添加量为0.5-3.0%（w/w），处理时间为1h，pH5.5-6.5；然后再次浓缩至L-异亮氨酸含量40%（w/w），再降至室温，离心得到L-异亮氨酸粗品B；将粗品B配制成浓度为5-8%（w/w）的溶液，添加针剂活性炭，添加量为0.1-1.0%（w/w），处理时间为1h，pH5.5-6.5；然后浓缩至L-异亮氨酸含量35%（w/w），再降至室温，离心、干燥得到L-异亮氨酸产品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂按照如下工艺制备而得：

1）往淀粉中加占淀粉两倍质量的纯化水，搅拌均匀得到悬浊液，然后加入与淀粉等质量的羧甲基纤维素钠，200转/min搅拌30min，然后置于80℃烘干至水分含量5%（质量百分比）以下，得到改性淀粉；

2）按照5:1:0.2的质量比取壳聚糖、腐植酸钠以及果胶，混合搅拌均匀，然后添加占壳聚糖两倍质量的2M的氢氧化钠水溶液，30KHz的超声10min，最后500转/min搅拌3min，得到改性壳聚糖；

3）将玉米秸粉、海泡石分别粉碎得到玉米秸秆粉和海泡石粉，将玉米秸秆粉、海泡石粉以及硅藻土按照3:1:1的质量比混合搅拌均匀，添加到占硅藻土5倍重量的浓度为1M的氢氧化钠溶液中，200转/min搅拌120min，然后过滤，干燥，研磨成粒径为10-20目的粉末；

4）将改性淀粉、改性壳聚糖以及步骤3）所得粉末按照5:3:2的质量比混合搅拌均匀，然后置于密闭反应釜中，以2℃/s的升温速率升至150℃，保温30min，取出，投入到搅拌器中，500转/min搅拌3min，得到混合料，置于烘箱中，80℃烘干90min，取出，粉碎即得。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述微滤膜一次过滤、二次过滤的条件均为：微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为50℃；

所述超膜过滤的条件为：超滤膜截留分子量为200Da，超滤温度为40℃；

所述反渗透膜浓缩条件为：温度为30-50℃，工作压力：进压为1-40bar，出压为1-36bar，压力差为1-34bar。