WO2013167088A2 - L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物 - Google Patents

L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物 Download PDF

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keto acid
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郑长胜
郭莉娜
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天津凯莱英制药有限公司
凯莱英医药化学（阜新）技术有限公司
吉林凯莱英医药化学有限公司
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    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01009—Leucine dehydrogenase (1.4.1.9)

Definitions

  • the present invention relates to the field of pharmaceutical synthesis, and in particular to a method for synthesizing an L-cyclic alkyl amino acid and a pharmaceutical composition therewith .
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Currently, the synthesis of chiral non-natural cyclic alkyl amino acids is mainly carried out by chemical methods, including the asymmetric catalytic hydrogenation of precious metals to achieve a single configuration of a key intermediate, and the use of chiral reagents. Racemates, asymmetric synthesis using chiral auxiliary groups, and directed synthesis using chiral starting materials.
  • Asymmetric catalytic hydrogenation of precious metals is used to achieve a single configuration conversion of a key intermediate.
  • the disadvantage is that expensive asymmetric catalysts are expensive, and the reaction requires a large amount of organic solvent.
  • the present invention is to provide a method for synthesizing an L-cyclic alkyl amino acid and a pharmaceutical composition therewith, and to obtain an L-cyclic alkyl amino acid having high optical purity.
  • a method for synthesizing an L-cyclic alkyl amino acid comprising: Step A, preparing a cyclic alkyl keto acid having the structural formula (I) or structural formula (II) Or a cyclic alkyl keto acid salt; Step B, a cyclic alkyl ketone acid or a cyclic alkyl keto acid salt with ammonium formate, leucine dehydrogenase,
  • the amino acid sequence of the leucine dehydrogenase is SEQ ID No. 1.
  • the gene sequence encoding the above leucine dehydrogenase is SEQ ID No. 2.
  • the expression process of the above leucine dehydrogenase comprises: inserting a DNA fragment comprising the gene sequence SEQ ID No.
  • step B comprises: mixing a cyclic alkyl ketone acid or a cyclic alkyl ketone acid salt with ammonium formate in water, adjusting the pH to 8.0 to 8.5 to obtain a mixed solution, and adding a crude enzyme mixture to the mixed solution.
  • the coenzyme NAD + is reacted at 30 to 40 ° C to form an L-cyclic alkyl amino acid.
  • the amount of the crude enzyme mixture is 2 to 12 ml per mol of the cyclic alkyl keto acid; the amount of the coenzyme NAD + is 0.005 to 0.1 mol per mol of the cyclic alkyl keto acid, formic acid
  • the amount of ammonium added is 1.5 to 5 moles.
  • the above synthesis method further comprises: adding a concentration of hydrochloric acid to adjust the system to a value of ⁇ 1 in the system after the reaction, passing through the diatomaceous earth to obtain a filtrate; adjusting the pH of the filtrate to 5.0 ⁇ After 7.0, the acid cation exchange resin was too strong to obtain a crude product; the crude product was concentrated, washed with an alcohol solvent, and dried to obtain a purified L-cyclic alkyl amino acid.
  • the method for preparing the above cyclic alkyl ketone acid of the formula (I) comprises the steps of: preparing a Grignard reagent having a cyclic alkyl halide of the formula (III); and the Grignard reagent and diethyl oxalate Obtaining a cyclic alkyl keto acid, wherein the structural formula (III)
  • 3 ⁇ 4 is 1 or 2
  • the intermediate product undergoes a hydrolysis reaction by a biological enzyme.
  • ⁇ 3 in the above structural formula (III) the intermediate product undergoes a hydrolysis reaction under the action of sodium hydroxide or potassium hydroxide.
  • the preparation method of the above cyclic alkyl ketone salt of the formula (I) comprises: preparing a Grignard reagent having a cyclic alkyl halide of the formula (III); and conducting the Grignard reagent with diethyl oxalate Substituting the reaction to obtain an intermediate product; subjecting the intermediate product to hydrolysis reaction to obtain a cyclic alkyl keto acid; reacting the cyclic alkyl keto acid with a cyclic alkyl keto acid salt, wherein the structural formula (III) is
  • the intermediate product undergoes a hydrolysis reaction under the action of sodium hydroxide or potassium hydroxide.
  • the above cyclic alkyl ketone salt is a cyclopropyl keto acid salt
  • the preparation method of the cyclopropyl keto acid salt comprises the following steps: oxidizing the cyclopropyl methyl ketone under basic conditions to obtain a cyclopropyl group Ketonate.
  • the above oxidation process uses KMn0 4 as an oxidant, and the oxidant is reduced to disappear after the oxidation reaction is completed.
  • the method for preparing the above cyclic alkyl ketone salt of the formula (I) comprises the steps of: subjecting a cyclic alkyl formaldehyde to a reduction reaction to obtain a cyclic alkyl methyl alcohol; and making a cyclic alkyl methyl alcohol
  • the 3 ⁇ 4th generation reaction is carried out to obtain a second cyclic alkyl methyl halide having the formula (IV); a Grignard reagent for preparing a second cyclic alkyl halide; and the substitution reaction of the Grignard reagent with diethyl oxalate to obtain an intermediate a product; a hydrolysis reaction of an intermediate product to obtain a cyclic alkyl keto acid; and a ring reaction to obtain a cyclic alkyl ketone
  • the preparation method of the above cyclic alkyl ketone salt of the formula (I) further comprises a process for preparing a cyclic alkyl formaldehyde, which comprises the steps of: preparing a cyclic alkyl halide having the formula (III); A aldehyde synthesis reaction to obtain a cyclic alkyl formaldehyde; wherein, structural formula (III)
  • the preparation method of the above cyclic alkyl ketone acid having the structural formula ( ⁇ ) includes the following steps: a carboxylic acid having a structural formula (V) is subjected to a Grignard reagent addition reaction to obtain an intermediate product ; intermediate product in alkaline strip
  • a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of an L-cyclic alkyl amino acid and a pharmaceutically acceptable carrier, and the L-cyclic alkyl amino acid is prepared according to the above synthetic method.
  • the specific leucine dehydrogenase having the amino acid sequence of SEQ ID No.
  • cyclic alkyl amino acid which is formed by the conversion of a leucine dehydrogenase and a coenzyme, has a conversion ratio of more than 80%, a high chiral selectivity, and a two-step process using a keto acid as a substrate.
  • a method for synthesizing an L-cyclic alkyl amino acid comprising: Step A, preparing a cyclic alkyl keto acid having the structural formula (I) or structural formula (II) or a cyclic alkyl keto acid salt; Step B, mixing a cyclic alkyl ketone acid or a cyclic alkyl keto acid salt with ammonium formate, leucine dehydrogenase, formate dehydrogenase, and auxiliary NAD + to reduce the amino group a reaction to form an L-cyclic alkyl amino acid, wherein,
  • Formula (I) Mi is H or a price
  • the amino acid sequence of leucine dehydrogenase is SEQ ID No. l
  • the above synthesis method utilizes a specific leucine dehydrogenase having an amino acid sequence of SEQ ID No. 1 in combination with formate dehydrogenase and coenzyme NAD + to cause reductive amination of a cyclic alkyl keto acid to form an L-cyclic alkyl group.
  • the amino acid, chiral center is formed by the conversion of leucine dehydrogenase and coenzyme.
  • the conversion rate of the raw material is over 80%, and the chiral selectivity is high.
  • the keto acid can be used as a substrate to complete L in two steps.
  • the leucine dehydrogenase encoded by the above gene sequence has good selectivity and catalytic conversion rate for catalyzing the synthesis of L-cyclic alkyl amino acid by cyclic alkyl ketone acid and ammonium formate.
  • the expression process of the leucine dehydrogenase comprises: inserting a DNA fragment comprising the above gene sequence SEQ ID No.
  • the above-mentioned DNA fragment having the above gene sequence is inserted into a vector to obtain a recombinant plasmid, and the activity and content of the leucine dehydrogenase obtained by the induction of the recombinant plasmid and the inducer are good, and the host strain is broken.
  • the crude enzyme mixture obtained after centrifugation contains both leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase contained in the methylotrophic host bacteria.
  • the present invention can directly utilize the crude enzyme mixture to catalyze the keto acid to amino acids. Conversion.
  • the temperature and the change of the medium may affect the specific activity of the leucine dehydrogenase and the formate dehydrogenase in the obtained crude enzyme solution, and the obtained crude enzyme mixture can be obtained.
  • the specific activity of the leucine dehydrogenase is 50 to 100 U/ml
  • the specific activity of the formate dehydrogenase is 20 to 50 U/ml.
  • the step B of the above synthesis method comprises: adding a cyclic alkyl ketone acid or a cyclic alkyl ketone acid salt and ammonium formate to an aqueous solution to adjust the pH to 8.0 to 8.5.
  • the crude enzyme mixture and the coenzyme NAD + are added , and the reaction is carried out at 30 to 40 ° C until the conversion of the starting material is completed to obtain an L-cyclic alkyl amino acid.
  • step B water is used as a solvent to greatly reduce the production cost, and no organic solvent is generated, and the synthesis process is green and environmentally friendly, and further adapted to industrialized mass production.
  • the amount of the crude enzyme mixture it is preferred to add the amount of the crude enzyme mixture to 2 to 12 ml per gram of the cyclic alkyl ketone acid; corresponding to each mole.
  • the cyclic alkyl keto acid, the coenzyme NAD + is added in an amount of 0.005 to 0.1 mol, and the ammonium formate is added in an amount of 1.5 to 5 mol.
  • the synthesizing method further comprises: adding a concentration of ⁇ 1 of the concentrated hydrochloric acid adjusting system to the system after the reaction, passing through the diatomaceous earth to obtain a filtrate; After adjusting the pH of the filtrate to 5.0 ⁇ 7.0, the acid cation exchange resin is too strong to obtain a crude product; the crude product is concentrated, the pH is adjusted to 7.0, the alcohol solvent is washed, and dried to obtain a purified L-cyclic alkyl group. Amino acid.
  • the method for producing a cyclic alkyl keto acid having the formula (I) in the above synthesis method comprises the steps of: preparing a cyclic alkyl halide having the formula (III); Grignard test U ; the Grignard reagent and diethyl oxalate were substituted to obtain an intermediate product; the intermediate product was hydrolyzed
  • a cyclic alkyl keto acid is obtained, wherein the structural formula (III) is ⁇ )" ⁇ , ni ⁇ l and X is a halogen.
  • the above synthetic cyclic alkyl keto acid has a short route and does not involve the use of a precious metal catalyst. , thereby ensuring the absence of heavy metal residues in the obtained cyclic alkyl keto acid; no precious metal catalyst is used in the subsequent synthesis of the L-cyclic alkyl amino acid, further ensuring the obtained L-cyclic alkyl group There is also no heavy metal residue in the amino acid.
  • the intermediate product is hydrolyzed by the action of the biological enzyme.
  • the reaction under the biological enzyme condition is not only milder. Moreover, the reaction rate and the yield of the reaction product are more easily controlled. For example, the synthesis of cyclobutyl keto acid by cyclohexyl oxoacetate catalyzed by Candida antarctica is used.
  • the above preparation method has the structural formula (III) and ⁇ ⁇ 3
  • the cyclic alkyl halide is a substrate to synthesize a cyclic alkyl keto acid
  • the hydrolysis reaction is carried out by an inorganic base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide, the conversion efficiency of the intermediate product is made high.
  • a cyclic alkyl amino acid cannot be synthesized using a cyclic alkyl keto acid as a substrate
  • a cyclic alkyl ketone having the structural formula ( ) in the above synthesis method is preferred.
  • the preparation method comprises the following steps: preparing a Grignard reagent having a structural formula of a cyclic alkyl halide; and subjecting the Grignard reagent to diethylation of diethyl oxalate to obtain an intermediate product; and subjecting the intermediate product to hydrolysis reaction to obtain a cyclic alkyl keto acid
  • the cyclic alkyl ketone is reacted to obtain a cyclic alkyl keto acid salt, wherein the structural formula
  • m ⁇ i , x is a halogen and is a monovalent cation.
  • the above route for synthesizing a cyclic alkyl keto acid is shorter than that of the prior art, and does not involve the use of a precious metal catalyst, thereby ensuring that no heavy metal remains in the obtained cyclic alkyl keto acid;
  • the precious metal catalyst is also not used in the synthesis of the L-cyclic alkyl amino acid, further ensuring that no heavy metal remains in the obtained L-cyclic alkyl amino acid.
  • the above cyclic alkyl keto acid is a cyclopropyl keto acid salt
  • the preparation method of the cyclopropyl keto acid salt comprises the following steps: oxidizing the cyclopropyl methyl ketone under basic conditions to obtain a cyclopropyl keto acid salt.
  • the methyl ketone is a substrate to synthesize a cyclopropyl amino acid, and only the cyclopropyl methyl ketone is subjected to an oxidation reaction under basic conditions to obtain a cyclopropyl keto acid salt, and then the cyclopropyl ketone salt and the ammonium formate are obtained.
  • the above formula has a cyclic alkyl ketone of the formula ( ).
  • the preparation method of the acid salt comprises the following steps: reducing the cyclic alkyl formaldehyde to obtain a cyclic alkyl methyl group An alcohol; a halogenated reaction of a cyclic methyl alcohol to obtain a second cyclic alkyl methyl halide having the formula (IV); a Grignard reagent for preparing a second cyclic alkyl halide; and a Grignard reagent and oxalic acid
  • the diethyl ester is subjected to a substitution reaction to obtain an intermediate product; the intermediate product is hydrolyzed to obtain a cyclic alkyl keto acid; and the cyclic alkyl keto acid is reacted with CH 3 OM or an alkyl ketone salt, wherein the structural formula (IV) is
  • the preparation method of the above embodiment adopts a simple preparation method in which a cyclic alkyl ketone salt is obtained without the participation of a heavy metal catalyst, and then the cyclic alkyl ketone is further synthesized by using the cyclic alkyl keto acid salt.
  • the use of a precious metal catalyst is not involved in the acid process, thereby ensuring that no heavy metal residues are present in the obtained cyclic alkyl keto acid; no precious metal catalyst is used in the subsequent synthesis of the L-cyclic alkyl amino acid. It is further ensured that no heavy metal remains in the obtained L-cyclic alkyl amino acid.
  • the cyclic alkyl formaldehyde used in the above examples may be a method for synthesizing cyclic alkyl formaldehyde by using a cyclic olefin as a substrate in the prior art, and preferably the method for preparing the above cyclic alkyl ketone having the formula (I)
  • the invention also comprises a process for preparing a cyclic alkyl formaldehyde, which comprises the steps of: preparing a cyclic acetaldehyde synthesis reaction of a cyclic alkyl halide having the formula (III) to obtain a cyclic alkyl formaldehyde; wherein, the structural formula
  • the method for preparing a cyclic alkyl ketone acid having the formula ( ⁇ ) includes the following steps: a carboxylic acid having a structural formula (V) is subjected to a Grignard reagent addition reaction to obtain an intermediate a product; the intermediate product is subjected to a hydrolysis reaction under basic conditions to obtain a cyclic alkyl keto acid, wherein the structural formula (V) is
  • the hydrolysis reaction is carried out under basic conditions to obtain a cyclic alkyl ketone acid having a large conversion ratio, thereby ensuring the purity of the obtained cyclic alkyl amino acid.
  • I-PrMgCl/THF is catalyzed by reaction with diisopropylamine.
  • a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of an L-cyclic alkyl amino acid and a pharmaceutically acceptable carrier, the L-cyclic alkyl amino acid being prepared according to the above synthesis method Made.
  • the L-cyclic alkyl amino acid of the present invention has a high purity, and thus the pharmaceutical composition having the same has a smaller target and side effects than the prior art pharmaceutical composition having an L-cyclic alkyl amino acid. low.
  • the leucine dehydrogenase used in the following examples is a leucine dehydrogenase having the amino acid sequence of SEQ ID No. 1, wherein the gene sequence encoding the leucine dehydrogenase of Examples 1 to 7 is derived from Bacillus sphaericus .
  • the expression process of leucine dehydrogenase is as follows: a DNA fragment comprising the gene sequence SEQ ID No. 2 is synthesized, and the above-prepared DNA fragment is inserted into the pET-22b (+) vector to obtain a recombinant plasmid; the above recombinant plasmid is transformed.
  • the crude aqueous solution was purified by a strong acid cation exchange resin resin column of type 001 x7, and the obtained crude product was washed with absolute ethanol and then suction filtered, and the filter cake was dried to obtain a white solid product; the filtrate was subjected to a strongly acidic cation of type 001 x7.
  • the exchange resin resin column was purified to obtain a white solid product, and the obtained white solid product obtained a total of 87 g, the internal standard of the electrode was >97%, the chiral purity was >99%, and the yield was 49%.
  • the alkane reagent was initiated; then the four-necked flask was cooled to 40 ° C, and a solution of 72 g of bromocyclobutane in 288 ml of tetrahydrofuran was added dropwise thereto for about 2.5 hours, and the bromocyclobutane was reacted according to the following reaction formula; After heating to 40 ⁇ 50 °C for about 1h, Grignard reagent is obtained, and the temperature is lowered to room temperature and nitrogen is used for protection.
  • the enzyme mixture and 2.14 g of ⁇ - ⁇ + form a mixed system, and the pH value of the above mixed system is adjusted to be between 8.0 and 8.5, and the temperature is raised to 30 to 40 ° C to react the mixed system according to the following reaction formula; After about 44h, the mixed system was traced, and the reaction of the raw materials was completed, and the temperature was lowered to room temperature.
  • aqueous phase (containing 385.7 g of sodium salt;), 13.74 g of ⁇ - ⁇ +, 443.5 g of ammonium formate, 4.36 L of leucine dehydrogenase and enzyme ratio with an enzyme specific activity of 70 U/ml.
  • the crude enzyme mixture of 35 U/ml formate dehydrogenase was added to a four-necked flask, and the mixture was completely dissolved to form a mixed system. About 10 mL of concentrated ammonia water was added to the mixed system to adjust the pH of the mixed system to about 8. Then, the mixed system is heated to 30-40 ° C for about 3 days, and the sampled and traced raw materials are converted.
  • the prepared Grignard reagent is pressed into the above mixed system by using nitrogen gas, and the temperature of the dropping process is controlled to be less than -20 ° C, and the dropwise addition is completed in about 2 hours; the mixed system after the reaction is heated to -10 ⁇ 5 ° C, Insulation for lh; then cool down to -20 ° C, add about 1.08 L of concentrated hydrochloric acid to adjust the pH of the system to between 4 and 5; then add 1.5 L of water, 0.5 L of ethyl acetate to the system, stir and separate The aqueous phase and the organic phase were extracted twice with 800 mL of ethyl acetate. The organic phase was washed twice with 1 L of saturated sodium bicarbonate solution, then twice with 1.5 L of saturated brine, and the organic phase was concentrated. 4.41 kg of a yellow liquid, cyclohexyloxyacetate.
  • the filter cake was washed with 700 mL of water and the aqueous washing liquid was collected; the filtrate was separately treated with 7 L and 6 L of methyl t-butyl ether.
  • the impurities were extracted, the methyl tert-butyl ether was discarded, and the pH of the system was adjusted to 1 ⁇ 2 with 1.6L concentrated hydrochloric acid; then extracted twice with 5L, 2L dichloromethane to the aqueous phase without product, the obtained two
  • the methylene chloride phases were combined, dried over 0.5 kg of anhydrous sodium sulfate, filtered, filtered, and then filtered and washed with 1L of dichloromethane.
  • the specific activity was a crude enzyme mixture of 40 U/ml formate dehydrogenase, 701 g of sodium 2-cyclohexyl-2-oxyacetate, and 24.8 g of P-NAD+. After total dissolution, add 47g of concentrated ammonia water to the system, adjust the pH of the system to 8.0 8.5, and raise the temperature to 30 ⁇ 40 °C for overnight reaction. After the reaction is complete, add 1.05 L of concentrated hydrochloric acid to the system to terminate the reaction, and then let the system pass.
  • the filter cake and the filtrate were obtained from a l ⁇ 2 cm diatomaceous earth pad, and the filter cake was washed twice with 0.7 L of purified water to obtain a water washing solution, and then the water washing liquid and the filtrate were transferred to a 20 L four-necked bottle to form a mixed solution to a mass of 1.1 L.
  • the concentration of the mixed solution is adjusted to 5 ⁇ 6 by the concentration of 50% sodium hydroxide solution.
  • the mixed solution is filtered to obtain the filter cake and the filtrate.
  • the filter cake is washed twice with 2 L of purified water, and then 5 times of pure water is used.
  • the reaction was terminated by adding 40 ml of 2 mol/L hydrochloric acid to the system, and 40 ml of a water solution was added thereto, and the aqueous phase obtained by liquid separation was extracted with 250 ml of ethyl acetate to obtain an organic phase, and the organic phase obtained by separation and the organic phase obtained by extraction were combined. It was washed three times with 50 ml of water, 50 ml of saturated brine, and the organic phase was concentrated to give 98.0 g of crude cyclohexyloxyacetate.
  • the temperature of the reaction system was raised to 30-40 ° C for three days, then the system was cooled to room temperature, and 220 mL of concentrated hydrochloric acid was slowly added dropwise to the bottle.
  • the pH of the system is adjusted to 1 ⁇ 2, and the system is passed through a diatomaceous earth pad of l ⁇ 2cm.
  • the filtrate was adjusted to pH 5-6 with 101.5 g of sodium hydroxide, placed on a refrigerator and chromatographed, and filtered to give a crude product.
  • the crude product was washed three times with 5 volumes of purified water, three times with 2 volumes of absolute ethanol, and dried to obtain 23.7 g of an internal standard >98% and a chiral purity of >99%.
  • Comparative Example 1 The process of obtaining a product by reducing the benzene ring using L-phenylalanine was disclosed in the patent WO2005/14526 Al. Add L-phenylalanine to 200mL of water, add 200mL of isopropanol, 12.2mL of 37% hydrochloric acid and 2g of 50% Pt/Rh(4: i;) carbon, and pass hydrogen into the system to maintain 8 ⁇ 10bar, 50 -60 ° C reaction 6 ⁇ 8h. The system was then filtered, washed with 50 mL of water, and the filtrate was concentrated and adjusted to pH 5-6 with 50% sodium hydroxide.
  • step 2) Dissolve 10 g of the product of step 1) in 65 mL of concentrated hydrochloric acid, heat to 94 ° C for 17 h, then drop to room temperature and add 175 mL of 4N potassium hydroxide solution until the pH of the system is 8-9 Road and then stir the system in ice water. After 45 min, the solid was filtered, washed with 50 mL of ice water and then washed with 100 mL of ice methanol for 10 min. Then filtered, and the white solid obtained was washed twice with 50 mL of methanol, then filtered and dried in vacuo to give product, yield 55%, chiral purity >98%.
  • the chiral purity of the L-cyclic alkyl amino acids obtained in the production methods of Examples 1 to 7 by the present invention was more than 99%.
  • the L-cyclic alkyl amino acid can be obtained by the two-step synthesis method using the keto acid as a substrate of the present invention, which is shorter than the synthetic route of Comparative Document 2.
  • comparative example 1 Up to 2 heavy metal catalysts are used in the synthesis process, and the synthesis cost is high; the synthesis method of Comparative Example 2 causes some of the raw materials to be wasted, and the synthesis cost is also high.

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Abstract

本发明提供了一种 L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物。该合成方法包括：步骤 A，制备具有结构式（Ⅰ）或结构式（Ⅱ）的环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐；步骤 B，将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶 NAD + 混合，进行还原氨基化反应，生成 L-环状烷基氨基酸，其中，结构式（Ⅰ），n ≥1，m ≥0，M 为 H或一价阳离子；结构式（Ⅱ），n 2 ≥0，m 2 ≥0，M 2 为 H或一价阳离子；亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为 SEQ ID No. 1。利用特定亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶、辅酶 NAD + 使环状烷基酮酸发生还原氨基化反应生成 L-环状烷基氨基酸，原料转化率高，手性选择性高。

Description

L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物 技术领域 本发明涉及医药合成领域， 具体而言， 涉及一种 L-环状烷基氨基酸的合成方法及 具有其的药物组合物。 背景技术 目前， 合成手性非天然的环状烷基氨基酸， 主要是采用化学方法， 包括使用贵重 金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化、 使用手性试剂拆分消 旋体、 利用手性辅基不对称合成、 使用手性原料的定向合成等方法。 然而这些方法存 在以下一些缺陷： ( 1 )使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化，其 缺点是贵重金属不对称催化剂价格昂贵， 反应需要大量有机溶剂， 产物中有重金属残 留且可能存在过度还原的副产物， 而且因为合成的原料中含有杂环， 常常会干扰贵重 金属与配体的结合， 造成催化效率不高。
(2)采用传统的手性拆分方法， 得到消旋体中一个需要的异构体， 会造成另外一 半的原料浪费。
(3 )利用手性辅基或手性原料的不对称合成， 涉及到价格昂贵的手性原料、较长 的合成路线以及大量的有机溶剂， 而且对于某些环状烷基氨基酸的合成， 得到的产品 光学纯度不高， 或者产品和杂质不易分离。 现有技术中也有一些文献报道采用生物合成的方法， 通过使用特定的酶催化， 将 一些简单烷基的酮酸转化为对应的氨基酸。 但是， 由于环状烷基氨基酸的性质比较特 殊， 现有技术目前还没有找到合适的酶以及相应的反应条件， 来通过生物转化合成带 手性环状烷基结构的氨基酸。 发明内容 本发明旨在提供一种 L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物， 得到 了光学纯度较高的 L-环状烷基氨基酸。 为了实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种 L-环状烷基氨基酸的合 成方法， 包括： 步骤 A， 制备具有结构式 （ I ) 或结构式 （ II ) 的环状烷基酮酸或环 状烷基酮酸盐； 步骤 B， 将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、 亮氨酸脱氢酶、
+混合， 进行还原氨基化反应， 生成 L-环状烷基氨基酸， 其
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或一价阳离子； 亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为 SEQ ID No. 1。 进一步地， 编码上述亮氨酸脱氢酶的基因序列为 SEQ ID No. 2。 进一步地， 上述亮氨酸脱氢酶的表达过程包括： 将包含基因序列 SEQ ID No. 2的 DNA片段插入载体， 得到基因重组质粒； 将基因重组质粒转化入宿主菌， 在培养基上 进行培养， 用诱导剂诱导亮氨酸脱氢酶的产生； 对宿主菌进行超声波破碎， 然后离心 分离得到粗酶混合液， 粗酶混合液中包含亮氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶。 进一步地， 上述粗酶混合液中， 亮氨酸脱氢酶的酶比活为 50~100U/ml， 甲酸脱氢 酶的酶比活为 20~50U/ml。 进一步地， 上述步骤 B包括： 将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐和甲酸铵在水中 混合后调节 pH值至 8.0〜8.5得到混合溶液， 向混合溶液中加入粗酶混合液以及辅酶 NAD+后于 30〜40°C下反应， 生成 L-环状烷基氨基酸。 进一步地， 对应于每摩尔环状烷基酮酸， 粗酶混合液的添加量为 2〜12ml; 对应 于每摩尔环状烷基酮酸， 辅酶 NAD+的添加量为 0.005〜0.1摩尔， 甲酸铵的添加量为 1.5〜5摩尔。 进一步地， 上述合成方法在步骤 B之后还包括： 在反应后的体系中加入浓盐酸调 节体系的 11值≤1， 过硅藻土， 得到滤出液； 将滤出液 pH值调节至 5.0〜7.0后过强酸 性阳离子交换树脂， 得到粗品； 将粗品浓缩， 加醇类溶剂洗涤， 烘干， 得到纯化的 L- 环状烷基氨基酸。 进一步地， 上述具有结构式 （ I ) 的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤： 制 备具有结构式 （III) 的环状烷基卤代物的格氏试剂； 将格氏试剂与草酸二乙酯进行取 得到环状烷基酮酸，其中，结构式（III)
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进一步地， 上述结构式 （III ) 中的 ¾为 1或 2， 中间产物在生物酶作用下发生水 解反应。 进一步地， 上述结构式 （III) 中的 ≥3， 中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用 下发生水解反应。 进一步地， 上述具有结构式 （ I ) 的环状烷基酮酸盐的制备方法包括： 制备具有 结构式 （III ) 的环状烷基卤代物的格氏试剂； 将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应 得到中间产物； 使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸； 使环状烷基酮酸与 反应得到环状烷基酮酸盐， 其中， 结构式 （III ) 为
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m≥i , x为卤素， Μ 为一价阳离子。 进一步地， 上述结构式 （III) 中的 3≤ΗΙ≤5， 中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作 用下发生水解反应。 进一步地， 上述环状烷基酮酸盐为环丙基酮酸盐， 环丙基酮酸盐的制备方法包括 以下步骤： 将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到环丙基酮酸盐。 进一步地，上述氧化过程米用 KMn04为氧化剂，并且在氧化反应完成之后将氧化 剂还原至消失。 进一步地， 上述具有结构式 （ I ) 的环状烷基酮酸盐的制备方法包括以下步骤： 使环状烷基甲醛进行还原反应得到环状烷基甲基醇； 使环状烷基甲基醇进行 ¾代反应 得到具有结构式 （IV) 的第二环状烷基甲基卤代物； 制备第二环状烷基卤代物的格氏 试剂； 将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物； 使中间产物发生水解反 应得到环状烷基酮酸；使环 反应得到环状烷基酮
酸盐， 其中， 结构式 （IV)
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l, mi=l, X为卤素，
Μ 为一价阳离子。 进一步地， 上述具有结构式 （ I ) 的环状烷基酮酸盐的制备方法还包括环状烷基 甲醛的制作过程， 制作过程包括： 制备具有结构式 （III) 的环状烷基卤代物的格氏试 ult醛合成反应得到环状烷基甲醛； 其中， 结构式 （III)
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ηι≥1, X为卤素 < 进一步地， 上述具有结构式 （Π ) 的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤： 具 有结构式 （V) 的羧酸进行格氏试剂加成反应， 得到中间产物； 将中间产物在碱性条
件下进行水解反应， 得到环状烷基酮酸， 其中， 结构式 （V)
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n2
步地， n2=l， m2=0。 根据本发明的另一方面， 提供了一种药物组合物， 包括药物有效剂量的 L-环状烷 基氨基酸以及药用载体， L-环状烷基氨基酸按照上述的合成方法制备而成。 应用本发明的技术方案， 利用氨基酸序列为 SEQ ID No. 1的特定亮氨酸脱氢酶与 甲酸脱氢酶以及辅酶 NAD+进行配合使环状烷基酮酸发生还原氨基化反应生成 L-环状 烷基氨基酸， 手性中心在亮氨酸脱氢酶和辅酶的催化作用下转化形成， 原料的转化率 达 80%以上， 手性选择性高； 而且以酮酸为底物通过两步即可完成 L-环状氨基酸的合 成， 同时， 由于原料转化率高， 得到的产物不涉及异构体的分离和纯化， 进而简化了 L-环状烷基氨基酸的合成工艺； 此外， 整个合成过程的反应条件温和， 更能适应 L-环 状烷基氨基酸的工业化大规模生产。 具体实施方式 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 下面将结合实施例来详细说明本发明， 在此需要说明的是与本领域的常规表 示方法一致， 环状结构内部的虚线环表示支链可以与环状结构的任意一个碳位相连。 在本发明一种典型的实施方式中， 提供了一种 L-环状烷基氨基酸的合成方法， 包 括： 步骤 A， 制备具有结构式 （ I ) 或结构式 （ II ) 的环状烷基酮酸或环状烷基酮酸 盐； 步骤 B， 将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、 亮氨酸脱氢酶、 甲酸脱氢 酶以及辅 NAD+混合， 进行还原氨基化反应， 生成 L-环状烷基氨基酸， 其中， 结构
式 （ I ) Mi为 H或一价
阳离子；
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M2为 H或一价 阳离子； 亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为 SEQ ID No. l 上述合成方法利用氨基酸序列为 SEQ ID No. 1的特定亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶 以及辅酶 NAD+进行配合使环状烷基酮酸发生还原氨基化反应生成 L-环状烷基氨基 酸， 手性中心在亮氨酸脱氢酶和辅酶的催化作用下转化形成， 原料的转化率达 80%以 上，手性选择性高； 而且以酮酸为底物通过两步即可完成 L-环状氨基酸的合成， 同时， 由于原料转化率高， 得到的产物不涉及异构体的分离和纯化， 进而简化了 L-环状烷基 氨基酸的合成工艺； 此外， 整个合成过程的反应条件温和， 更能适应 L-环状烷基氨基 酸的工业化大规模生产。可用于本申请的一价阳离子包括但不限于碱金属离子，氨基、 巯基等， 只要能够和酸形成盐的一价阳离子都可应用于本发明。 上述合成方法中， 编码亮氨酸脱氢酶的基因序列为 SEQ ID No. 2。 上述基因序列 编码的亮氨酸脱氢酶对催化环状烷基酮酸与甲酸铵合成 L-环状烷基氨基酸的选择性和 催化转化率均较好。 在本发明的一种优选的实施例中， 上述亮氨酸脱氢酶的表达过程包括： 将包含上 述基因序列 SEQ ID No. 2的 DNA片段插入载体， 得到基因重组质粒； 将上述基因重 组质粒转化入宿主菌， 在培养基上进行培养， 用诱导剂诱导亮氨酸脱氢酶的产生； 对 宿主菌进行超声波破碎， 然后离心分离得到粗酶混合液， 该粗酶混合液中包含亮氨酸 脱氢酶以及甲酸脱氢酶。 上述利用具有上述基因序列的 DNA片段插入载体后得到基因重组质粒， 并且利 用该基因重组质粒配合诱导剂的诱导作用得到的亮氨酸脱氢酶的活力和含量均较好， 将宿主菌破碎、 离心后得到的粗酶混合液中既含有亮氨酸脱氢酶又含有甲基营养型宿 主菌本身所含有的甲酸脱氢酶， 本发明可直接利用该粗酶混合液催化酮酸向氨基酸的 转化。 在上述实施例的实施过程中， 温度、 培养基的改变都会影响所得到的粗酶液中亮 氨酸脱氢酶的以及甲酸脱氢酶的酶比活， 所得到的粗酶混合液都能应用于本发明， 且 优选得到的粗酶混合液中， 亮氨酸脱氢酶的酶比活为 50~100U/ml， 甲酸脱氢酶的酶比 活为 20~50U/ml。 利用具有上述酶比活的粗酶混合液在催化酮酸向 L-环状烷基氨基酸 的转化过程中不仅手性选择性更高， 催化效率更好。 在本发明的又一种优选的实施例中， 上述合成方法的步骤 B包括： 将环状烷基酮 酸或环状烷基酮酸盐和甲酸铵加入水溶液中，调节 pH值至 8.0〜8.5，加入粗酶混合液 以及辅酶 NAD+， 于 30〜40°C下反应至原料转化完毕， 得到 L-环状烷基氨基酸。 上述 步骤 B中利用水做溶剂从而大大降低了生产成本， 而且无有机溶剂的产生， 合成工艺 绿色环保， 进一步适应工业化的大规模生产。 为了进一步从原料上控制成本并且通过调控各原料的用量比来得到尽量多的产 物， 优选对应于每克环状烷基酮酸， 粗酶混合液的添加量为 2〜12ml; 对应于每摩尔 环状烷基酮酸， 辅酶 NAD+的添加量为 0.005〜0.1摩尔， 甲酸铵的添加量为 1.5〜5摩 尔。 在本发明的又一种优选的实施例中， 上述合成方法在步骤 B之后还包括： 在反应 后的体系中加入浓盐酸调节体系的 11值≤1， 过硅藻土， 得到滤出液； 将滤出液 pH值 调节至 5.0〜7.0后过强酸性阳离子交换树脂， 得到粗品； 将粗品浓缩， 调节 pH值至 7.0， 加醇类溶剂洗涤， 烘干， 得到纯化的 L-环状烷基氨基酸。 由于本发明的手性选择 性较高， 在对产物的分离纯化中不涉及异构体的分离和纯化， 进而使得本发明的分离 方法比较简单， 只需要将产物与酶、 原料等进行分离即可。 在本发明的又一种优选的实施例中， 上述合成方法中具有结构式 （ I ) 的环状烷 基酮酸的制备方法包括以下步骤： 制备具有结构式 （III) 的环状烷基卤代物的格氏试 齐 U; 将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物； 使中间产物发生水解反应
得到环状烷基酮酸， 其中， 结构式 （III) 为^^)"^ ， ni≥l , X为卤 素。 上述合成环状烷基酮酸的路线较短， 而且并没涉及使用贵重金属催化剂， 从而保 证了得到的环状烷基酮酸中不存在重金属残留； 在后续的合成 L-环状烷基氨基酸的过 程中也没有使用贵重金属催化剂， 进一步保证了得到的 L-环状烷基氨基酸中也不存在 重金属残留。 在利用上述制作方法制作环丙基氨基酸或环丁基氨基酸时， 优选使中间产物在生 物酶作用下发生水解反应。 生物酶条件下进行的反应不仅反应条件更温和， 而且反应 速率、 反应产物的得率更容易控制。 比如采用南极洲假丝酵母催化环丁基氧代乙酸乙 酯合成环丁基酮酸。 当上述制作方法以具有结构式（III)且 ηι≥3的环状烷基卤代物为底物合成环状烷 基酮酸时， 优选使中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。 在利用氢 氧化钠或氢氧化钾等无机碱作用下进行水解反应时， 使得中间产物的转化效率较高。 在本发明的又一种优选的实施例中， 当不能以环状烷基酮酸为底物合成环状烷基 氨基酸时， 优选上述合成方法中具有结构式（ )的环状烷基酮酸盐的制备方法包括: 制备具有结构式 （ 的环状烷基卤代物的格氏试剂； 将格氏试剂与草酸二乙酯进行 取代反应得到中间产物； 使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸； 使环状烷基酮 进行反应得到环状烷基酮酸盐， 其中， 结构式 （ 为
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m≥i , x为卤素， 为一价阳离子。 同样， 上述合成环状烷基酮酸的路线较现有技术中的合成路线短， 而且并没涉及 使用贵重金属催化剂， 从而保证了得到的环状烷基酮酸中不存在重金属残留； 在后续 的合成 L-环状烷基氨基酸的过程中也没有使用贵重金属催化剂， 进一步保证了得到的 L-环状烷基氨基酸中也不存在重金属残留。 当上述制作方法以具有结构式（ 且 3≤ηι≤5的环状烷基卤代物为底物合成环状 烷基酮酸时， 优选使中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。 在利用 氢氧化钠或氢氧化钾等无机碱作用下进行水解反应时，使得中间产物的转化效率较高。 在本发明的又一种优选的实施例中， 上述环状烷基酮酸盐为环丙基酮酸盐， 环丙 基酮酸盐的制备方法包括以下步骤： 将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到环丙 基酮酸盐。 本实施例利用环丙基甲基酮为底物合成环丙基氨基酸， 只需要将环丙基甲 基酮在碱性条件下进行氧化反应即可得到环丙基酮酸盐，然后环丙基酮酸盐与甲酸铵、 亮氨酸脱氢酶、 甲酸脱氢酶以及辅酶 NAD+混合， 进行还原氨基化反应， 生成 L-环丙 基甘氨酸， 该过程只需两步， 而且不涉及重金属催化剂， 因此， 进一步保证了 L-环丙 基甘氨酸的手性纯度和收率。 上述将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到环丙基酮酸盐的过程中， 优选采 用 KMn04为氧化剂，并且在氧化反应完成之后将氧化剂还原至消失。在实际操作中本 领域技术人员可以采用氢氧化钠营造碱性条件， 氧化反应完成之后优选采用亚硫酸氢 钠作为还原剂还原未反应的高锰酸钾，待高锰酸钾完全被还原后只需将体系进行过滤， 滤液浓缩后即可用于下一步的反应。 在本发明的又一种优选的实施例中， 上述合成方法中具有结构式 （ ) 的环状烷 基酮酸盐的制备方法包括以下步骤： 使环状烷基甲醛进行还原反应得到环状烷基甲基 醇； 使环状甲基醇进行卤代反应得到具有结构式 （IV ) 的第二环状烷基甲基卤代物； 制备第二环状烷基卤代物的格氏试剂； 将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中 间产物； 使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸； 使环状烷基酮酸与 CH3OM 或 烷基酮酸盐， 其 中 ， 结构式 （ IV ) 为
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l , mi=l , X为卤素， Μ 为一价阳离子。 采用上述实施例的制备方法采用简单的制备方法，其中没有重金属催化剂的参与， 即可得到环状烷基酮酸盐， 然后再进一步利用该环状烷基酮酸盐合成环状烷基丙氨酸 的过程中也没有涉及使用贵重金属催化剂， 从而保证了得到的环状烷基酮酸中不存在 重金属残留； 在后续的合成 L-环状烷基氨基酸的过程中也没有使用贵重金属催化剂， 进一步保证了得到的 L-环状烷基氨基酸中也不存在重金属残留。 上述实施例中所用的环状烷基甲醛可以采用现有技术中以环烯烃为底物合成环状 烷基甲醛的方法， 优选上述具有结构式 （ I ) 的环状烷基酮酸盐的制备方法还包括环 状烷基甲醛的制作过程， 制作过程包括： 制备具有结构式 （III ) 的环状烷基卤代物的 格氏 ult醛合成反应得到环状烷基甲醛； 其中， 结构式
( III )
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ηι≥1 , X为卤素。 上述制作过程步骤简单、 操作 条件易控， 环状烷基甲醛的纯度和收率较高。 在本申请的一种优选的实施例中， 上述具有结构式 （Π ) 的环状烷基酮酸的制备 方法包括以下步骤： 具有结构式（V ) 的羧酸进行格氏试剂加成反应， 得到中间产物; 将中间产物在碱性条件下进行水解反应， 得到环状烷基酮酸， 其中， 结构式 （V ) 为
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m2 0。 以带有羧基的杂环烷基为底物进行格式试剂加成反 应， 然后在碱性条件下进行水解反应， 能够得到转化率较大的环状烷基酮酸， 进而保 证了所得到的环状烷基氨基酸的纯度。 优选上述具有结构式 ( V ) 的羧酸为 4-羧基吡喃， 即 n2=l， m2=0， 将 4-羧基吡喃 溶解在四氢呋喃中， 并在 -10~0°C之间在 I-PrMgCl/THF的催化作用下与二异丙胺进行 反应， 反应完成后再向体系中添加草酸乙酯进行加成反应， 从而得到中间产物； 再将 中间产物在氢氧化钾或氢氧化钠形成的碱性条件下进行水解反应得到 4-吡喃基酮酸。 在本发明的另一种典型的实施方式中， 提供了一种药物组合物， 包括药物有效剂 量的 L-环状烷基氨基酸以及药用载体， L-环状烷基氨基酸按照上述合成方法制备而成。 本发明的 L-环状烷基氨基酸的纯度较高， 因此具有其的药物组合物的相对于现有技术 中的具有 L-环状烷基氨基酸的药物组合物的靶点更小、 副作用更低。 下面将结合实施例和对比例进一步说明本发明的有益效果。 以下实施例所用的亮氨酸脱氢酶为氨基酸序列为 SEQ ID No. 1的亮氨酸脱氢酶， 其中编码实施例 1至 7的亮氨酸脱氢酶的基因序列来源于球形芽孢杆菌。 亮氨酸脱氢酶的表达过程如下： 合成包含基因序列 SEQ ID No. 2的 DNA片段， 将上述合成的 DNA片段插入 pET-22b (+)载体， 得到基因重组质粒； 将上述基因重组质粒转化入大肠杆菌 BL21 , 在 培养基上进行培养， 用诱导剂诱导亮氨酸脱氢酶的产生； 对大肠杆菌 BL21进行超声 波破碎， 然后离心分离得到具有酶比活为 50~100U/ml 的亮氨酸脱氢酶和酶比活为 20~50U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液。 实施例 1
L-环丙基甘氨酸的合成
1 )室温下， 向 20L四口瓶中加入 500g环丙基甲基酮、 15.6g NaOH、 8.7L水形成 混合体系，将混合体系加热至 45~55°C后，向混合体系中滴加 8.7L具有 1864.8g KMn04 的水溶液， 未溶解的 KMn04再分批加入到混合体系中， 约 10h加毕， 反应跟踪原料反 应完全， 内标收率 57.9%， 向反应完成后的混合体系中滴加 10% NaHS03破坏未反应 的 KMn04; 抽滤， 滤液浓缩至 70%后直接投下一步使用。 lH MR OOMHz, CD3C1 51.29 (m， 3H)， 1.06(m， 1H)， 0.95(m， 1H)。
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2)室温下向 5L四口瓶中加入上述步骤得到的 1627 g含量 14.5%环丙基氧代乙酸 钠的水溶液、 193.3 g甲酸铵、 2350 mL具有酶比活为 60U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比 活为 50U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、 10.18 g P-NAD+形成反应体系， 调节反应体系 的 pH值在 8.0 8.5， 并将其升温至 30~40°C， 使反应体系按照下述化学式进行反应， 反应 16h后跟踪体系， 检测原料反应完毕， 降至室温， 搅拌下缓慢向其中滴加 750 m L 浓盐酸使反应后混合体系的 pH值至 1以下； 将调酸后的体系过 1~2 cm的硅藻土垫， 用 235g氢氧化钠将得到的滤液 pH值调节至 5~6之间，得粗品水溶液。将粗品水溶液 过型号为 001 x7的强酸性阳离子交换树脂树脂柱纯化， 所得粗品用无水乙醇洗涤后进 行抽滤， 滤饼烘干得类白色固体产品； 滤液过型号为 001 x7的强酸性阳离子交换树脂 树脂柱纯化得类白色固体产品， 两次所得类白色固体产品共计得到 87 g， MR 内 标 >97%，手性纯度 >99%，收率 49%。 lH MR(400MHz, D20): 52.56 (d, 1H)， 0.91(m， 1H)， 0.49(m， 2H)， 0.34(m, 1H)， 0.23(m, 1H)。 MS: (M+H)+=116.1。
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实施例 2
L-环丁基甘氨酸的合成
1 ) 向 1L四口瓶中加入 15.13g镁屑， 160ml四氢呋喃， 2颗碘粒， 再向其中加入 具有 8g溴代环丁烷的 32ml 四氢呋喃溶液，加热四口瓶使体系中的溴代环丁烷格式试 剂引发； 然后将四口瓶降温至 40°C， 向其中滴加具有 72g溴代环丁烷的 288ml四氢呋 喃溶液， 约 2.5h滴毕， 溴代环丁烷按照以下反应式进行反应； 升温至 40~50°C保温约 lh后得到格氏试剂， 降温至室温氮气保护备用。
B「 M g,TH F MgBr
2) 向 1L四口瓶中加入具有 112.6g草酸二乙酯的 160ml四氢呋喃溶液， 用液氮乙 醇将四口瓶降温至 -50°C以下； 控温四口瓶温度在 -35 °C以下， 将制备好的 0.593mol格 式试剂压入降温后的体系中按照以下反应式进行反应， 约 lh加完； lh后取样 TLC检 测直至反应完全， 约 1.5h; 向反应体系中加入 200ml浓度为 3mol/L的盐酸终止反应， 得到混合体系； 然后 160ml用甲基叔丁基醚分三次萃取该混合体系， 萃取后得到的有 机相合并浓缩得 140g粗品环丁基氧代乙酸乙酯。 lH MR(400MHz, CD3C1): 54.30 (m, 2H)， 3.78(m, 1H)， 2.20(m, 2H), 2.01(m, 2H), 1.83(m, 2H), 1.33(t, 3H)。
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3 )向 500ml四口瓶中加入具有 100g上述环丁基氧代乙酸乙酯且 pH=7的 200ml 磷 酸盐缓冲溶液以及 2g南极洲假丝酵母形成反应体系，然后将反应体系升温至 30~40°C， 反应过程中用氨水使反应体系的 pH值保持在 7~8，具体的反应过程见下述反应式； 约 50h后 TLC检测反应毕。 将体系抽滤， 滤液用 150ml甲基叔丁基醚萃取， 得到酮酸的 的水溶液，直接用于下步反应。 lH MR(400MHz, D20): 53.66(m, 1H)， 2.17-1.75 (m， 6H)。
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4) 室温下将 640g质量含量为 6.46%的环丁基酮酸水溶液和 17.42g氢氧化钠加入 到 1L烧杯中， 搅拌， 抽滤除去析出的固体。 将滤液转至 1L四口瓶中， 并向其中加入 40.65g甲酸铵、400 mL具有酶比活为 75U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为 35U/ml甲酸 脱氢酶的粗酶混合液、 2.14 g β-ΝΑϋ+形成混合体系， 调节上述混合体系的 ρΗ值在 8.0 8.5之间， 并将其升温至 30~40°C使该混合体系按照下述反应式进行反应； 反应约 44h后跟踪混合体系， 检测原料反应完毕， 降至室温， 搅拌下向其中缓慢滴加 130 m L 浓盐酸使反应后的混合体系 pH值小于等于 1； 将经过上述调酸后的体系过 1~2 cm的 硅藻土垫， 使用氢氧化钠将收集到的滤液 pH值调节至 5~6， 得粗品水溶液； 粗品水溶 液过型号为 001 x7强酸性阳离子交换树脂树脂柱， 得到的纯化后的粗品用无水乙醇洗 涤， 然后依次经抽滤、 滤饼烘干得类白色固体产品， 抽滤得到的滤液过型号为 001 x7 强酸性阳离子交换树脂树脂柱， 纯化得类白色固体产品， 两次固体产品共计 24.8g产 品， MR内标 >97%， 手性纯度 >99%， 收率 60%。 1H MR(400MHz, D20): 53.12 (d， 1H)， 2.40(m, 1H)， 2.0-1.75(m, 6H)。 MS: (M+H)+=130.1。
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实施例 3
L-环戊基甘氨酸的合成
1 ) 向干燥的 5L四口瓶中加入 300mL 四氢呋喃、 97.9gMg、 30g溴代环戊烷、 2 粒碘， 反应引发后继续滴加 476g溴代环戊烷和 2233mL 四氢呋喃的混合液， 控制温 度 60~65°C， 约 4h后全部滴毕， 回流两小时后降至室温， 得到格氏试剂。 在另一干燥 的 5L四口瓶中加入 679.9g草酸二乙酯， 1176mL 四氢呋喃， 降温至 -40°C以下， 将上 述格氏试剂压入到该四口瓶中形成反应体系， 控制反应体系的温度在 -40°C 以下， 约 lh压毕， 保温 30min后将反应后的体系升温至室温， 然后用 3mol/L的盐酸调节体系 pH值在 3~4之间，将体系分液得到水相和有机相，水相用丙烯酸乙酯萃取后分离得有 机相， 两次得到的有机相合并后用饱和碳酸钠溶液洗至中性后再用饱和食盐水洗， 浓 缩， 得到粗品 413g， 收率 72%。
Figure imgf000015_0002
2) 在 2L四口瓶中加入 400g上述粗品、 400mL水形成混合体系， 然后将该混合 体系升温至 80°C并向其中滴加 440g质量浓度为 50% NaOH水溶液，约 lh滴毕使四口 瓶中的物质按照以下反应式反应， 然后自然降至室温， 将降温后的体系抽滤， 滤液用 正庚烷萃取得到水相和有机相， 水相直接投下一步。
Figure imgf000015_0003
3 )将上步骤得到的水相 (含钠盐 385.7g；)、 13.74g β-ΝΑϋ+、 443.5g 甲酸铵、 4.36L 具有酶比活为 70U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为 35U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液加 入到四口瓶中， 搅拌使物质全部溶解形成混合体系， 向该混合体系中加入约 10mL浓 氨水将混合体系的 pH值调节至 8左右， 然后将该混合体系升温至 30~40°C反应约 3 天后， 取样跟踪原料转化完毕， 向反应后的体系中共加入 1.2L浓盐酸使体系的 pH值 在 1 以下， 然后体系过硅藻土， 得到的滤液用 50%氢氧化钠溶液调节 pH在 5~6， 在 <30°C下将体系抽滤得到固体， 将固体烘干后用 4倍体积的纯水搅洗 2h后抽滤， 滤饼 用乙醇淋洗后烘干得到 134.6g产品，内标 >97%， ee>99%,收率 40%。 1H MR(400MHz, D20): 52.79 (d, 1H)， 1.89(m， 1H)， 1.65~1.43(m, 6H),2.19(m, 2H)。MS: (M+H)+=144.1。
Figure imgf000016_0001
实施例 4
L-环己基甘氨酸的合成
1 ) 向 20L四口瓶中加入 3320g镁屑及 500mL四氢呋喃， 2g碘， 在 20 °C下滴加 1L具有 203g溴代环己烷的四氢呋喃溶液， 搅拌至体系引发； 引发后分批滴加 1.947kg 溴代环己烷和 10L四氢呋喃的混合溶液， 控温 55~60°C， 滴加完毕后于 60~65°C保温 2h后停止加热， 所得格氏试剂氮气保护暂存。 向另一干燥的 20L反应瓶中加入 2.07kg草酸二乙酯、 2.5L四氢呋喃形成混合体系， 利用液氮乙醇将上述混合体系降温至 -40°C以下。将制好的格氏试剂利用氮气压入到上 述混合体系中， 控制滴加过程的温度小于 -20°C， 约 2h滴加完毕； 将反应后的混合体 系升温至 -10±5°C， 保温 lh; 然后降温至 -20°C， 滴加约 1.08L浓盐酸将体系 pH值调节 至 4~5之间； 然后向体系中加入 1.5L水、 0.5L乙酸乙酯， 搅拌后分液得到水相和有机 相， 水相再分别用 800mL乙酸乙酯萃取两次， 有机相分别先用 1L饱和碳酸氢钠溶液 洗涤两次， 再分别用 1.5L饱和食盐水洗涤两次， 有机相浓缩得到 4.41kg黄色液体即 环己基氧代乙酸乙酯。
Figure imgf000016_0002
2) 向 20L反应瓶中加入 4.12kg环己基氧代乙酸乙酯、 1.79kg甲醇， 并搅拌使其 全部溶解； 继续想反应瓶中加入 5.454kg水，体系温度略有升高； 滴加配制好的 2.56kg 质量浓度为 50%氢氧化钠溶液， 温度升高， 约 40min后滴毕， 然后于 50~60°C保温反 应 3h。 跟踪原料反应完全后， 体系降温至 42°C， 抽滤出不溶的固体得滤饼和滤液， 该 滤饼用 700mL水洗后收集水洗液； 滤液分别用 7L、 6L甲基叔丁基醚两次萃取杂质， 甲基叔丁基醚相弃， 水相用 1.6L浓盐酸将体系 pH值调节至 1~2； 然后分别用 5L、 2L 二氯甲烷两次萃取至水相无产品， 得到的二氯甲烷相合并， 用 0.5kg无水硫酸钠干燥 过夜， 抽滤， 滤饼再用 1L二氯甲烷泡洗， 滤饼弃， 滤液浓缩。 将浓缩后的液体用甲 醇溶，滴加甲醇钠的甲醇溶液，冰水浴下搅拌 30min后抽滤，得到白色固体 1.69kg (即 2-环己基 -2-氧乙酸钠盐）。 1H MR(500MHz, D20): 52.88 (m， 1H)， 1.88(m， 2H), 1.74~1.04(m, 8H)。
Figure imgf000017_0001
3 ) 室温下， 向 20L四口瓶中加入 996 g HCOO H4及 2.58 kg纯化水， 搅拌溶解 后， 向体系中加入 7.556 kg具有酶比活为 60U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为 40U/ml 甲酸脱氢酶的粗酶混合液、 701 g 2-环己基 -2-氧乙酸钠盐、 24.8g P-NAD+。全溶后， 向 体系中加入浓氨水 47g， 调体系 pH值在 8.0 8.5， 升温至 30~40°C反应过夜， 反应完全 后， 向体系中滴加 1.05 L浓盐酸终止反应， 然后使体系过 l~2cm的硅藻土垫得到滤饼 和滤液， 滤饼分别以 0.7 L纯化水洗两次得水洗液， 然后将水洗液和滤液转至 20 L四 口瓶中形成混合溶液，以 1.1 L质量浓度为 50%氢氧化钠溶液将混合溶液的 pH值调节 至 5~6， 抽滤该混合溶液得滤饼和滤液， 滤饼分别以 2 L纯化水洗两次后， 再用 5倍 体积纯水搅拌洗涤 3 次， 抽滤后的滤饼烘干后得产品 512.8g， 收率 82.9%， 核磁内 标 >98%， 手性纯度 >99%。 1H MR(400MHz, D20): 53.54 (d， 1H)， 1.61(m， 1H)， 1.38~1.25(m, 5H)， 0.91-0.69 (m， 5H)。
Figure imgf000017_0002
实施例 5
L-环庚基甘氨酸的合成
1 ) 向 1L四口瓶中加入 12.9g镁屑、 180ml四氢呋喃、 1颗碘粒以及 36ml 具有 9g 环庚基溴的四氢呋喃溶液形成反应体系， 加热该反应体系使之变澄清并引发， 引发后 反应体系剧烈放热， 将反应体系降温至 50°C并控制该反应体系的温度≤50°C， 滴加 324ml具有 81g环庚基溴的四氢呋喃溶液， 约 lh滴毕， 然后将体系升温至 45~55°C保 温约 5h后降温至室温得到格氏试剂。
Figure imgf000017_0003
2) 向 1L四口瓶中加入 74.6g草酸二乙酯和 160ml THF溶液形成混合体系， 用液 氮乙醇使该混合体系降温至≤-50°C。 控制混合体系温度≤-30°C， 将制备好的 n i mol 格氏试剂压入降好温的体系中， 约 0.5h加完。 约 2.5h后 TLC检测直至反应完全。 向 体系中加入 40ml 2mol/L的盐酸终止反应， 再加入 40ml水分液， 分液得到的水相用 250ml 乙酸乙酯萃取得到有机相， 将分液得到的有机相和萃取得到的有机相合后再依 次用 50ml水洗 3次、 50ml饱和食盐水洗， 有机相浓缩得 98.0g环庚基氧代乙酸乙酯 粗品。
Figure imgf000018_0001
3 ) 向 1L四口瓶中加入 98.0g环庚基氧代乙酸乙酯粗品、 196ml甲醇、 368ml 浓 度为 2mol/L 氢氧化钠溶液形成反应体系， 反应体系反应放热至 50 °C， 并保温于 40-50 °C , 约 5h后 TLC检测反应完全。 将体系浓缩至基本无熘分， 加入 320ml水， 然后分别用 100ml石油醚萃取两次， 得到的水相用 6mol/L的盐酸调 PH值在 2左右， 再分别用 120ml甲基叔丁基醚萃取两次、 120ml乙酸乙酯萃取四次得到有机相， 合并 有机相并分别用 120ml水将合并后的有机相洗涤三次、 50ml饱和食盐水洗一次， 浓缩 有机相得固体， 固体用氮气进行吹干得 29g酮酸。 1H MR(400MHz, CD3C1): 58.95 ( s， 1H)， 3.36(m, 1H)， 1.93(m, 2H)， 1.74(m， 2H)， 1.63~1.51(m, 8H)。
Figure imgf000018_0002
4)将 20.9g粗品酮酸溶于 60mL甲醇中，冰水浴下滴加 27.43g质量浓度为 29%的 甲醇钠甲醇溶液。 滴毕后冰水浴下搅拌 10min， 抽滤， 滤饼用 50L EA淋洗， 得到的白 色固体烘干后称量为 18.68g酮酸钠盐。 取 18g的酮酸钠盐， 加 90mL纯水， 过滤掉不 溶物， 滤液转至 500mL四口瓶中。 向四口瓶中加入 11.8g甲酸铵、 180mL具有酶比活 为 100U/ml 的亮氨酸脱氢酶和酶比活为 50U/ml 甲酸脱氢酶的粗酶混合液、 0.62g β-ΝΑϋ+形成反应体系， 然后用浓氨水将该反应体系的 ρΗ值调节至 8.0 8.5之间， 然 后将反应体系升温至 30~40°C反应过夜， 向四口烧瓶中缓慢滴加 40mL浓盐酸终止反 应， 体系过硅藻土， 得到的滤液冰水浴下用固体氢氧化钠调节 pH值在 5~6之间， 搅 拌 30min后抽滤， 得到白色固体； 固体再用 10mL水洗， 烘干得到 3.9gL-环庚基甘氨 酸。 内标 >97%， 手性纯度 >99%。 1H MR(400MHz, D20): 53.08 (d， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.63~1.26(m, 12H)。
Figure imgf000018_0003
实施例 6
L-环己基丙氨酸的合成
1 ) 向 500mL四口瓶中加入 llg镁屑、 30mL THF、 4g溴代环己烷形成混合体系， 将该混合体系升温至 30~40°C后向其中加入 2粒碘， 体系引发， 然后滴加剩余 61g溴 代环己烷和 230mL THF混合物。 滴加过程中微回流， lh滴毕， 体系于 60~70oC保温 2h， 然后降至室温备用， 得格氏试剂。
Figure imgf000019_0001
2) 向干燥洁净的 20L反应瓶中压入制备好的格氏试剂， 降温至 -20°C后控制格氏 试剂的温度在 -10±5°C之间， 然后向反应瓶中滴加 1.506kg二甲基甲酰胺， 约 2h滴毕， 体系于 0°C以下保温 2h。 向反应瓶中滴加 7L浓度为 4mol/L的 HC1终止反应的反应产 物。 将反应产物抽滤， 滤液静置分液， 水相分别用 2.8L EA萃取两次， 合并萃取后的 有机相，合并后的有机相用 3L饱和食盐水洗，浓缩得到 1.608kg油状液体，纯度 96%， 收率 83.5%。 1H MR(400MHz, CDC13): 59.49 ( s， 1H)， 2.13(m, 1H)， 1.74(m,2H), 1.66~1.51(m, 4H), 1.22-1.10 (m， 4H)。
Figure imgf000019_0002
3 ) 向 5L四口瓶中加入 272g油状液体、 1632mL 甲醇， 然后降温至 0°C以下， 分 批加入 92g硼氢化钠固体， 控制温度<30 。 约 2h加毕， 体系于 20~30°C保温反应。 向体系中滴加 4mol/LHCl， 使体系 pH值在 6~7之间， 然后将体系进行初步浓缩后向 初步浓缩的体系中加入甲苯进行进一步浓缩， 得到 325.9g粗品， 减压蒸熘得到 214.7g 无色液体， p=99%, 收率 82%。 lH MR(400MHz, CDC13): 53.36 (d， 2H)， 2.48(s, 1H)， 1.69~1.60(m,4H), 1.4(m， 1H)， 1.24-1.07 (m， 4H) ,0.88 (m， 2H)。
Figure imgf000019_0003
4) 向 20L四口瓶中加入 1.4kg无色液体、 甲苯 8.4L、 吡啶 969.8g， 将体系降温 至 0~-10°C， 然后滴加 1.66kg三溴化磷和 7L甲苯的混合物， 控温 5°C以下。 约 lh滴 毕， 升温至室温并反应 10h。 然后降温至 20°C以下， 滴加 5%碳酸氢钠溶液约 2.5L, 然后加入 1.85kg碳酸氢钠固体形成混合物。 将混合物分液， 得到的水相分别用 4L甲 苯萃取两次， 合并萃取后的有机相， 并用饱和食盐水洗合并后的有机相， 洗涤后的有 机相用无水硫酸钠干燥后浓缩得到 1.73kg 粗品， 减压精熘得到 722.8g 产品， 纯度 97.5%, 收率 33.3%。 1H MR(400MHz, CDC13): 53.82 (m, 1H)， 1.79~1.53(m,6H), 1.13-0.90 (m， 6H)。
Figure imgf000020_0001
5 ) 向 5L四口瓶中加入 85.4g镁屑、 500mLTHF、 30g步骤 4) 的产品， 加热至引 发， 然后滴加 570g 步骤 4) 的产品和 3.4L THF的混合液， 滴毕后于 60±5 °C保温 4h， 降至室温备用得到格氏试剂。向另一 10L反应瓶中加入 594.2g草酸二乙酯， 1.2L THF, 搅拌降温至 -40 50°C， 然后滴加制备好的格氏试剂， 约 2h滴毕， 于 -10 20°C保温反 应 1.5h得产物， 然后滴加 600mL 6mol/L的 HC1终止反应并调节产物 pH值在 2〜3之 间， 再加入 500mL水， 水相分别用 1.2LMTBE萃取三次得到有机相， 有机相合并后用 饱和食盐水洗， 浓缩后得到 935g棕色液体， 直接投下一步反应。
Figure imgf000020_0002
6) 向 3L四口瓶中加入步骤 5 )得到的 935g棕色液体、 839mL纯水， 然后向四口 瓶中滴加 203.1g NaOH和 203.1g水的混合溶液， 控制温度小于 40°C。 约 2h滴毕， 反 应约 5h后将四口瓶中的体系抽滤， 得到的滤液用 HC1将 pH值调节至 1~2之间， 然后 分别用 ILEA萃取三次， 萃取后得到的有机相浓缩后， 滴加到甲醇钠甲醇溶液中， 制 成钠盐备用，共得到钠盐 198g， 收率 30%。 lH MR(400MHz, CDC13): 52.63 ( d， 2H)， 1.8(m, lH)， 1.63-1.56 (m， 5H)， 1.24~1.06(m,3H), 0.91 (m， 2H)。
Figure imgf000020_0003
7) 室温下， 向 5L四口瓶中加入 74 g上步骤得到的钠盐及 740 mL纯化水， 20°C 超声 5 min后过滤， 向滤液中加入 48.5 g甲酸铵、 740 mL具有酶比活为 50U/ml的亮 氨酸脱氢酶和酶比活为 30U/ml 甲酸脱氢酶的粗酶混合液及 2.55§β-ΝΑϋ+形成反应体 系， 检测反应体系的 pH值为 6~7， 以 20 mL质量浓度为 5%氨水调节反应体系的 pH 值在 8.0 8.5， 将反应体系升温至 30~40°C 反三天， 然后将体系降至室温， 向瓶中缓慢 滴加 220 mL浓盐酸使体系的 pH值调节为 1~2， 将体系过 l~2cm的硅藻土垫， 得到的 滤液用 101.5 g氢氧化钠将 pH值调节为 5~6， 置于冰箱上层析晶， 抽滤得粗品。 粗品 使用 5倍体积纯化水洗三次， 2倍体积无水乙醇洗三次， 烘干得到内标 >98%， 手性纯 度>99%的产品 23.7g。 lH MR(400MHz, D20): 53.15 (m， 1H)， 1.61~1.53(m, 5H)， 1.36 (m， 1H)， 1.23(m, 2H)， 1.08-1.00 (m， 3H) ,0.79 (m， 2H)。
Figure imgf000021_0001
实施例 7
L-4'-吡喃基甘氨酸
1 ) 向 250mL四口瓶中加入 6.2g 4-羧基吡喃， 30mL THF， 搅拌至溶解。 冰盐浴降 至 IJ-10~0°C， 控温下滴加 81.04g 12.8%的 IPMgCl/THF溶液， 约 1.5h滴毕， 然后一次性 迅速加入 5.31g 二异丙胺， 然后升温回流 2h; 将体系降温至 -30 -20 °C,， 控制 T<-5 °C 滴加 7.66g 草酸二乙酯， 约 15min滴毕， 然后自然回至室温反应 45min; 将体系降至 0-5 °C , 滴加 2.45g EtOH, 滴毕后搅拌 30min后滴加 13mL浓盐酸， 并于 50°C保温 50min， 降至室温后加入 20mL水和 30mLMTBE， 搅拌 lOmin后分液， 得到的水相分 别用 30mLMTBE萃取两次， 萃取后得到的有机相合并， 依次用 20mL 1M HC1盐酸、 20mL饱和食盐水洗， 水洗后的有机相用 MgS04干燥后浓缩， 得到 7.34g液体。 1H MR(400MHz, CD3C1): 54.30 ( m， 2H)， 3.97(t, 2H)， 3.44(t, 2H)， 3.28(m, 1H)， 1.80(t， 2H)， 1.72(m, 2H)， 1.36 (t， 3H)。
Figure imgf000021_0002
2) 向 50mL三口瓶中加入 lOmL水， 1.26g KOH， 1.16g K2HP04, 控温 T<20°C 滴加 2.5g上步得到的酮酸酯液体和 5mL MeOH的混合液，滴毕后控制 T<20°C保温 lh。 向体系中加入 10mL MTBE, 搅拌 lOmin后分液， 分液得到的水相再用 10mL MTBE 萃取， 萃取后的水相用 1.4mL 6N HCl调节 pH值至 3~4， 然后分别用 20mL EA萃取两 次；萃取后的有机相合并浓缩，得到 0.72g黄色油状物，即酮酸粗品。 lH MR(400MHz, CD3C1): 54.08 (t， 2H)， 3.54(t, 2H)， 3.50(m, 1H)， 1.87(m， 2H)， 1.72(m, 2H)。
Figure imgf000022_0001
3 ) 将上述 0.4g酮酸粗品加入到 5mL IPA中， 滴加 0.58g 28%的甲醇钠甲醇溶液， 冰浴下搅拌 5min后抽滤， 得到 0.5g类白色固体； 将此白色固体加入到 50mL锥形瓶 中， 加入 2.5mL纯水、 0.26g甲酸铵， 用浓氨水调 pH至 8.0 8.5， 然后加入 4mL具有 酶比活为 60U/ml 的亮氨酸脱氢酶和酶比活为 20U/ml 甲酸脱氢酶的粗酶混合液， 18.4mg β-ΝΑϋ+, 于 30°C恒温反应过夜。 将体系用 ImL浓盐酸调节至 ρΗ<1， 过硅藻 土抽滤后冰浴下用固体 NaOH调节至 pH在 5~6， 过强酸性阳离子交换树脂纯化产品。 得到类白色固体， ee>99%。 lH MR(400MHz， D20): 53.99 (t， 2H)， 3.44(t, 2H)， 3.00 (d， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.57 (m， 2H)， 1.33 (m， 2H)。
Figure imgf000022_0002
对比例 1 采用专利 WO2005/14526 Al, 公开的使用 L-苯丙氨酸还原苯环得到产品的过程。 将 L-苯丙氨酸加入到 200mL水中，加入 200mL异丙醇、12.2mL 37%盐酸和 2g 50% Pt/Rh(4: i;)碳， 体系中通入氢气， 维持 8~10bar， 50-60°C反应 6~8h。 然后将体系过滤， 用 50mL水洗， 滤液浓缩后用 50%氢氧化钠调 pH5~6。然后降温至 0~10°C， 抽滤得到 的固体， 用 20mL水洗， 然后再 50~70°C真空干燥。
Figure imgf000022_0003
对比例 2 采用美国专利 US 6191306公开的方法合成环丙基甘氨酸 1 ) 将环丙基甲醛 175g溶于 1.75L甲醇中， 然后加入 322mL S-α-甲基苄胺。 回流
1.5h后降温至 30°C， 然后加入 162.8g氰化钾， 反应升温至 32°C搅拌过夜， 然后加入 580mL水。 用 40mL浓盐酸将体系调至 pH 10， 然后加入 1.8L水， 分出水相， 水相用 EA萃取 3次， 0.7L/次。 有机相合并后用无水硫酸镁干燥， 然后过滤， 滤液浓缩得到 黄色油状物， 收率 98%。 产物 （S,S): (R,R)=3.2: 1。
Figure imgf000023_0001
2)将 10g 步骤 1 ) 的产物溶于 65mL浓盐酸中， 加热至 94°C保温 17h， 然后降至 室温一下滴加 175mL 4N 氢氧化钾溶液， 直至体系 pH 8-9„ 然后体系冰水中搅拌 45min， 过滤固体， 并用 50mL冰水洗然后用 lOOmL冰甲醇洗 10min。 然后过滤， 得 到的白色固体再分别用 50mL甲醇洗涤两次， 然后过滤， 真空干燥， 得到产品， 收率 55%, 手性纯度>98%。
H
Figure imgf000023_0002
3 ) 将 16.8g上步得到的 (S)-苯乙基 -(S)-环丙基甘氨酸和 200mL THF， lOOmL水， 4.76g 10% Pd/C混合， 然后加入 17mL 甲酸， 然后搅拌过夜。 反应完后， 过滤掉催化 剂， 将滤液浓缩， 然后加入甲醇后再浓缩， 反复操作几次， 真空干燥得到 4.75g固体 产物，。
Figure imgf000023_0003
利用 MR内标得到实施例 1至 7以及对比例 1至 2的 L-环状烷基氨基酸的手性 纯度， 并记录在表 1中。 表 1
Figure imgf000023_0004
由表 1中的数据可以看出， 实施例 1至实施例 7采用本发明的制备方法得到的 L- 环状烷基氨基酸的手性纯度均大于 99%。 此外， 通过本发明的以酮酸为底物通过两步 合成方法即可得到 L-环状烷基氨基酸， 比对比文件 2的合成路线更短。 而且对比例 1 至 2在合成过程中均采用了重金属催化剂， 合成成本较高； 对比例 2的合成方法， 会 使其中部分原料浪费， 合成成本也较高。 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的 任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种 L-环状烷基氨基酸的合成方法， 其特征在于， 包括：
步骤 A， 制备具有结构式 （ I ) 或结构式 （ II ) 的环状烷基酮酸或环状焼 基酮酸盐；
步骤 B，将所述环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、 甲酸脱氢酶以及辅酶 NAD+混合， 进行还原氨基化反应， 生成 L-环状烷基氨基 酸， 其中，
所述结构式 （ I ) 为
i
Figure imgf000025_0001
Mi为 H或一价 阳离子；
所述结构式 （ II ) 为
Figure imgf000025_0002
M2为 H或一价阳离子； 所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为 SEQ ID No. 1。 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 编码所述亮氨酸脱氢酶的基因 序列为 SEQ ID No. 2。 根据权利要求 2所述的合成方法， 其特征在于， 所述亮氨酸脱氢酶的表达过程 包括： 将包含所述基因序列 SEQ ID No. 2的 DNA片段插入载体， 得到基因重组 质粒；
将所述基因重组质粒转化入宿主菌， 在培养基上进行培养， 用诱导剂诱导 所述亮氨酸脱氢酶的产生；
对所述宿主菌进行超声波破碎， 然后离心分离得到粗酶混合液， 所述粗酶 混合液中包含所述亮氨酸脱氢酶以及所述甲酸脱氢酶。
4. 根据权利要求 3所述的合成方法， 其特征在于， 所述粗酶混合液中， 所述亮氨 酸脱氢酶的酶比活为 50~100U/ml， 所述甲酸脱氢酶的酶比活为 20~50U/ml。
5. 根据权利要求 3或 4所述的合成方法， 其特征在于， 所述步骤 B包括： 将所述环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐和所述甲酸铵在水中混合后调节 pH值至 8.0〜8.5得到混合溶液，向所述混合溶液中加入所述粗酶混合液以及辅 酶 NAD+后于 30〜40°C下反应， 生成所述 L-环状烷基氨基酸。
6. 根据权利要求 5所述的合成方法， 其特征在于，
对应于每摩尔所述环状烷基酮酸， 所述粗酶混合液的添加量为 2〜12ml; 对应于每摩尔所述环状烷基酮酸， 所述辅酶 NAD+的添加量为 0.005〜0.1 摩尔， 所述甲酸铵的添加量为 1.5〜5摩尔。
7. 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 所述合成方法在所述步骤 B之 后还包括：
在反应后的体系中加入浓盐酸调节所述体系的 11值≤1， 过硅藻土， 得到 滤出液；
将所述滤出液 pH值调节至 5.0〜7.0后过强酸性阳离子交换树脂， 得到粗
P
ρπ ;
将所述粗品浓缩， 加醇类溶剂洗涤， 烘干， 得到纯化的所述 L-环状烷基氨 基酸。
8. 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 所述具有结构式 （ I ) 的环状 烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：
制备具有结构式 （III) 的环状烷基卤代物的格氏试剂；
将所述格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物； 使所述中间产物发生水解反应得到所述环状烷基酮酸，
其中， 结构式 （III) 为
Figure imgf000027_0001
9. 根据权利要求 8所述的合成方法， 其特征在于， 所述结构式 （III) 中的 1^为 1 或 2， 所述中间产物在生物酶作用下发生水解反应。
10. 根据权利要求 8所述的合成方法， 其特征在于， 所述结构式 （III) 中的 ≥3， 所述中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。
11. 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 所述具有结构式 （ I ) 的环状 烷基酮酸盐的制备方法包括：
制备具有结构式 （III) 的环状烷基卤代物的格氏试剂；
将所述格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；
使所述中间产物发生水解反应得到所述环状烷基酮酸； 使所述环状烷基酮 酸与 ¾ΟΜ 或 Μ ΟΗ进行反应得到所述环状烷基酮酸盐，
其中， 结构式 （III) 为
Figure imgf000027_0002
m≥i , x为卤素， Μ 为一价阳离子。
12. 根据权利要求 11所述的合成方法，其特征在于，所述结构式（III)中的 3≤η≤5， 所述中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。
13. 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 所述环状烷基酮酸盐为环丙基 酮酸盐， 所述环丙基酮酸盐的制备方法包括以下步骤： 将环丙基甲基酮在碱性 条件下进行氧化得到所述环丙基酮酸盐。
14. 根据权利要求 13所述的合成方法， 其特征在于， 所述氧化过程米用 10^! 04为 氧化剂， 并且在氧化反应完成之后将所述氧化剂还原至消失。
15. 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 所述具有结构式 （ I ) 的环状 烷基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：
使环状烷基甲醛进行还原反应得到环状烷基甲基醇；
使所述环状烷基甲基醇进行卤代反应得到具有结构式 （IV) 的第二环状焼 基甲基卤代物；
制备所述第二环状烷基卤代物的格氏试剂；
将所述格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物； 使所述中间产物发生水解反应得到所述环状烷基酮酸；
使所述环状烷基酮酸与 ¾ΟΜ 或 Μ ΟΗ进行反应得到所述环状烷基酮 酸盐，
其中， 结构式 （IV) 为
in(H2
Figure imgf000028_0001
，
ni ^ l , mi=l , X为卤素， Μ 为一价阳离子。 根据权利要求 15所述的合成方法， 其特征在于， 所述具有结构式（ I )的环状 烷基酮酸盐的制备方法还包括所述环状烷基甲醛的制作过程， 所述制作过程包 括：
制备具有结构式 （III) 的环状烷基卤代物的格氏试剂；
使所述格氏试剂进行 Bouveault醛合成反应得到环状烷基甲醛； 其中， 结构式 （III) 为
Figure imgf000029_0001
ηι≥1 , X为卤素。
17. 根据权利要求 1所述的合成方法， 其特征在于， 所述具有结构式 （ II ) 的环状 烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：
具有结构式 （V ) 的羧酸进行格氏试剂加成反应， 得到中间产物； 将所述中间产物在碱性条件下进行水解反应， 得到所述环状烷基酮酸， 其中， 所述结构式 （V ) 为
Figure imgf000029_0002
根据权利要求 17所述的合成方法， 其特征在于， 所述 =1， 所述 m2=0。 一种药物组合物， 其特征在于， 包括药物有效剂量的 L-环状烷基氨基酸以及药 用载体， 所述 L-环状烷基氨基酸按照权利要求 1至 18中任一项所述的合成方 法制备而成。
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