CN102533923A - 有机溶剂共溶剂生物拆分制备(s)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法 - Google Patents

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黄金
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Abstract

本发明提供了涉及一种在水-有机溶剂共溶体系中生物拆分制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。所述方法包括：以外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以脂肪酶Novozym 435为生物催化剂，在pH 6.0～7.8的磷酸盐缓冲液与亲水性有机溶剂混合组成的水-有机溶剂共溶剂体系中，于25℃～60℃、200r/min下进行生物催化不对称水解反应18h～56h，反应完全后，反应液经分离纯化得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。本发明利用含亲水性有机溶剂的共溶剂反应体系，可有效提高脂肪酶Novozym 435催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的生物拆分效果，产率最高可达49.0％，反应时间可由水相转化的64h缩短至56h。

Description

有机溶剂共溶剂生物拆分制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种在水-有机溶剂共溶体系中生物拆分制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。
(二)背景技术
S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中间体。西司他丁与亚胺培南复配的抗菌药物——泰能
Figure BDA0000121940550000011
具有极强的广谱抗菌活性，同时也具有β-内酰胺酶抑制作用，在临床上应用广泛，市场需求量逐年递增。光学纯的2，2-二甲基环丙烷甲酸的制备方法主要有化学法和生物法两种，后者相比于前者具有反应条件温和、专一性强和产率高等特点。
在生物拆分外消旋底物制备手性化合物的反应过程中，由于一些拆分底物的水溶性较差，造成了反应的传质和扩散等问题，导致反应产物的时空产率较低。在体系中引入适量的亲水性有机溶剂，与水相介质构成单相共溶体系，可在一定程度上解决底物水溶性差的问题，从而增加底物的溶解度，有利于反应的平衡向产物合成方向移动，提高拆分效率。此外，溶剂的加入还可以使酶的某些功能基团有一定的展开，增加酶的活性，提高酶的催化效率。李春元等(Enantioselective enzymatic hydrolysis ofracemic glycidyl butyrate by lipase from Bacillus subtilis with improvedproperties.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 2008，55：152-156)对脂肪酶生物拆分消旋丁酸缩水甘油酯进行了研究，结果表明在反应体系中加入一定量的1，4-二氧六烷和乙二醇可以提高酶活性。
生物拆分外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的反应过程如下图：
Figure BDA0000121940550000021
底物：2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯(DMCPE)
产物：S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸(S-(+)-DMCPA)
本申请人的在先申请中国专利200910100305.9(公开号CN101597626A)提供了一种以脂肪酶Novozym 435为催化剂对外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯进行生物拆分获得S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法，该方法在水相体系中进行，产率较低(40％以下)，若要达到较高产率(45％以上)需较长反应时间(64h以上)。反应过程中添加表面活性剂AOT时，由于AOT常温下呈白色蜡状固体，在水中的溶解度不高(1.5g/100g水，25℃)，而且有较高的粘稠性，导致脂肪酶Novozym435易于结块，不利于酶回收后再利用。此外，由于酶与AOT分子的强烈静电和疏水相互作用，在酶回收洗涤时会使吸附在大孔吸附树脂上的酶分子脱落，从而降低酶的稳定性。添加亲水性有机溶剂时，转化反应在保持较高的产率和较短的反应时间的前提下，脂肪酶Novozym 435在转化反应结束后在反应液中仍能保持较好的分散性，更易于回收后再利用。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种在含有机溶剂共溶剂的反应体系中有效提高脂肪酶Novozym 435催化外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分效果的新方法。
本发明采用的技术方案是：
一种在水-有机溶剂共溶剂体系中生物拆分制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法，所述方法包括：以外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以脂肪酶Novozym 435为生物催化剂，在pH 6.0～7.8的磷酸盐缓冲液与亲水性有机溶剂混合组成的水-有机溶剂共溶剂体系中，于25～60℃、200r/min条件下进行生物催化外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应18～56h，反应完全后，反应液经分离纯化得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸；所述的脂肪酶Novozym 435购自丹麦诺和诺德公司(Novo Nordisk，Bagsvard，Denmark)。
所述水-有机溶剂共溶剂体系中亲水性有机溶剂体积浓度为1～30％，所述亲水性有机溶剂为下列之一：N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、丙酮、异丙醇、丙二醇、甲醛、四氢呋喃。
所述共溶剂体系中，外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯底物的初始浓度为35mmol～140mmol/L，脂肪酶Novozym 435添加量为10～30g/L。
优选的，所述亲水性有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，在水-有机溶剂共溶剂体系中的体积浓度为5％～25％。
所用磷酸盐缓冲液pH优选为7.0～7.8。
本发明中所述的产物产率和产物ee值测定采用气相色谱法。反应结束后反应液用两倍体积乙酸乙酯萃取，定容后采用气相色谱分析。
气相色谱法的具体操作条件为：日本岛津GC-2014气相色谱仪，N2000色谱工作站，美国Chirasil-Dex CB毛细管柱。载气为氮气；流速为2mL/min；进样量：1μL；分流比为15∶1；检测器为氢火焰离子检测器；进样口温度和检测器温度为250℃；柱温为程序升温：80℃保留3min，然后以8℃/min升温至180℃，保留3min。
产率计算方法为：
内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。
产率： Y ( % ) = C SP C 0 × 100 %
Csp为S-(+)-2，2-甲基环丙烷甲酸浓度，C0为底物初始浓度。
萃取后产物的分离纯化可按常规方法进行，具体可如下：用浓度为2mol/L的NaOH溶液调节反应液pH值至9.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取萃余液，用2mol/L的浓HCl调节萃余液pH至2.0，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯，取乙酸乙酯层，挥发除去乙酸乙酯后即得产物(S)-(+)-2，2-甲基环丙烷甲酸。
本发明的有益效果在于：本发明利用含亲水性有机溶剂的共溶剂反应体系，可有效提高脂肪酶Novozym 435催化外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的生物拆分效果，产率最高可达49.0％，反应时间可由水相转化的64h缩短至56h，与水相添加表面活性剂的方案相比，添加亲水性有机溶剂时，脂肪酶Novozym 435在转化反应结束后在反应液中仍能保持较好的分散性，同时酶的稳定性较好，从而可多次用于催化不对称水解反应。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：添加亲水性有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以增加底物溶解性，提高脂肪酶Novozym 435催化拆分2，2-甲基环丙烷甲酸乙酯的反应效率。
将0.5ml DMF溶于9.5ml 1mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，加入0.5mmol的底物2，2-甲基环丙烷甲酸乙酯，脂肪酶Novozym 435加量为160mg，在50ml锥形瓶中进行酶促拆分反应。反应温度为30℃，摇床转速200r/min，反应24h。反应结束后，用两倍体积乙酸乙酯萃取，定容至20ml，进行气相色谱分析，所得产物浓度为2.1g/L，产物ee值为98.6％，产率为36.4％。
实施例2～8：
参照实施例1的方法，改变亲水性有机溶剂的种类，以水相体系于相同条件下反应作为对照(即反应介质为10ml pH 7.2、1mol/L的磷酸缓冲液)，考察不同亲水性有机溶剂对2，2-甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表1：
表1
Figure BDA0000121940550000051
结论：优选DMF为较佳的有机溶剂。此外，丙二醇也可提高脂肪酶Novozym 435催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的生物拆分效果。
实施例9～15：
参照实施例1的方法，改变反应体系中DMF的体积分数，考察DMF体积分数对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表2：
表2
Figure BDA0000121940550000061
结论：DMF体积分数在5％～25％范围内为佳，其中最优的DMF体积分数为15％。
实施例16～22：
参照实施例1的方法，在反应体系中加入相同量的DMF，改变缓冲液pH，考察缓冲液pH对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表3：
表3
结论：缓冲液pH在7.0～7.8范围内为佳，其中最优的缓冲液pH为7.2。
实施例23～29：
参照实施例1的方法，考察缓冲液离子强度对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表4：
表4
结论：缓冲液离子强度在0.6～1.2mol/L范围内为佳，其中最优的缓冲液离子强度为1.0mol/L。
实施例30～36：
参照实施例1的方法，改变底物浓度，考察底物浓度对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表5：
表5
结论：综合考虑产物浓度和产率，优选的底物浓度为65mmol/L。实施例37～43：
参照实施例1的方法，改变转化温度，考察其对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表6：
表6
Figure BDA0000121940550000082
Figure BDA0000121940550000091
结论：综合考虑产物ee值和产率，优选的转化温度30℃。
实施例44～50：
参照实施例1的方法，改变转化时间，考察转化时间对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯生物拆分的影响，结果见表7：
表7
Figure BDA0000121940550000092
结论：转化时间在32h～56h范围内为佳，其中最优的转化时间为56h。

Claims (4)

1.一种在水-有机溶剂共溶剂体系中生物拆分制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法，所述方法包括：以外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以脂肪酶Novozym 435为生物催化剂，在pH 6.0～7.8的磷酸盐缓冲液与亲水性有机溶剂混合组成的水-有机溶剂共溶剂体系中，于25℃～60℃、200r/min下进行生物催化不对称水解反应18～56h，反应完全后，反应液经分离纯化得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸；所述水-有机溶剂共溶剂体系中亲水性有机溶剂体积浓度为1～30％，所述亲水性有机溶剂为下列之一：N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮、异丙醇、丙二醇、甲醛。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共溶剂体系中，底物外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯初始浓度为35mmol～140mmol/L，脂肪酶Novozym 435添加量为10～30g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述亲水性有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，在水-有机溶剂共溶剂体系中的体积浓度为5％～25％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所用磷酸盐缓冲液pH为7.0～7.8。
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