CN103194520A - 酶催化转酯化反应制备光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶催化转酯化反应制备光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的方法，将外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物与酰基供体摩尔比为1∶1～1∶4的混合物加入有机溶剂中，再加入磁性固定化脂肪酶，控制磁性固定化脂肪酶与外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物的相对用量为1mg∶1ml～100mg∶1ml，反应温度10℃～60℃，搅拌下反应2-36h，磁场中分离出固定化酶停止反应；经柱层析分离得到光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物和其乙酸酯；本发明利用磁性固定化酶的高活性、高选择性和高稳定性来实现，固定化酶在磁场作用下快速分离，无机械损失并高效循环使用，催化效率高，成本低，工艺简捷。

Description

酶催化转酯化反应制备光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的方法

技术领域

本发明涉及一种酶催化转酯化反应拆分制备光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的方法，特别是涉及一种以磁性无机-有机复合物固定化酶作催化剂的制备方法。

背景技术

四氢吡喃是多醚抗生素的关键结构单元，作为手性砌块，4-羟基四氢吡喃类化合物是许多药物合成的重要中间体。在药物合成中，若以4-羟基四氢吡喃类化合物的单一对映体体为原料，将省去了外消旋药物分子经手性试剂后拆分过程，又提高了原料利用率和产品质量，因此，开发4-羟基四氢吡喃衍生物单一对映体的制备技术具有重要意义。

合成四氢吡喃类化合物的方法主要有：杂原子D-A反应，分子内Micheal加成反应和Prins环化反应。EP1493737A1描述了一种由相应的醛与异戊烯醇反应制备4-羟基吡喃的方法，方法中醛过量使用，催化剂是无机酸，如氢氯酸、硫酸，优选甲磺酸或对苯磺酸，由于使用液体酸操作难度大环境污染严重。CN102428077A公开了一种在在强酸性阳离子交换剂的存在下异戊烯醇与异戊醛反应制备外消旋2-取代的四氢吡喃的方法。CN102603690A公开了外消旋四氢吡喃类化合物一种一锅法制备方法，以丙二酸二乙酯为原料，与取代二卤代醚经合环、水解、脱羧制备四氢吡喃-4-甲酸及其衍生物，方法原料廉价易得，工艺条件稳定，操作简单，收率为75.6％～82.2％，是较理想化的工业化生产路线，而光学活性的4-羟基四氢吡喃衍生物的制备可以借助酶的高度立体选择性进行拆分获得。文献中[Tetrahedron letters，(2007)48：4631～4633)]利用游离的皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugose lipase)动力学拆分4-羟基四氢吡喃衍生物的外消旋体，得到其光学活性对映体。但是，游离脂肪酶在有机溶剂中易成簇失活，稳定性差，分离困难，重复使用中机械损失严重，这些问题限制了酶催化法在生产实际中应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁性固定化脂肪酶催化转酯化反应拆分制备光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的方法。

光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的制备方法，包括以下步骤：

1)利用磁性固定化脂肪酶催化外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物与酰基供体作用，在的有机介质中进行转酯化拆分；

2)将外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物与酰基供体摩尔比为1∶1～1∶4的混合物加入有机溶剂中，再加入磁性固定化脂肪酶，控制磁性固定化脂肪酶与外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物的相对用量为1mg∶1ml～100mg∶1ml，反应温度10℃～60℃，搅拌下反应2-36h，磁场中分离出固定化酶停止反应；经柱层析分离得到光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物和其乙酸酯；反应温度优选20℃～40℃。

3)所述的外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物可以是但不限于芳基、烷基、烷氧基及其卤取代等衍生物；

4)所述的酰基供体可以是乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯和乙酸酐的一种；

5)所述的有机溶剂有甲苯、苯、环己烷、正己烷、正庚烷、异辛烷、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、异丙醚等中的一种或上述溶剂的相互混合获得的混合溶剂，只要所用的有机溶剂对于反应是惰性的，包括芳烃、取代芳烃、烷烃、卤代烷烃或者醚；

6)所述的脂肪酶可选市售的柱状假丝酵母脂肪酶(Candida Cylindracea lipase，CCL)和皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida Rugosa lipase，CRL)、猪胰脂肪酶(Porcine Pancreaticlipase，PPL)、假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas sp lipase，PSL)、南极假丝酵母脂肪酶(Candida Antarctica lipase，CAL)中的一种；

7)所述的磁性固定化酶的磁性载体可以是但不限于MFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂(M＝Fe、Mn、Co和Zn)，其中-(CH₂)₃-NH₂基团含量为0.5-1.5mmol/g，粒径为50-300nm，饱和磁化率为10～60emu/g，载酶量在100-200mg/g范围；

8)反应体系中，外消旋4-羟基四氢吡喃浓度为10mmol/L～2500mmol/L，酰基供体浓度10mmol/L～2500mmol/L，磁性固定化脂肪酶用量为2mg/ml～30mg/ml。

本发明的优点在于：是通过将4-羟基四氢吡喃衍生物和酰化剂溶解于有机溶剂中，在磁性固定化脂肪酶的催化作用下，4-羟基四氢吡喃衍生物和酰化剂发生不对称转酯化反应，获得具有ee值高于75％的光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物和其乙酸酯，反应对映选择性高，获得的手性对映体光学纯度高。磁性固定化酶作催化剂，反应可在常温下进行，条件温和，操作方便，设备简单。该技术是利用磁性固定化酶的高活性、高选择性和高稳定性来实现，固定化酶在磁场作用下快速分离，无机械损失并高效循环使用，催化效率高，成本低，工艺简捷，适合于工业化生产应用。

附图说明

图1本发明所用的MnFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化PSL酶的SEM照片；

图2实施例1中2-苯基-4-羟基四氢吡喃转酯化拆分对映体的高效液相色谱图；1：(2R，4S)-2-苯基四氢吡喃-4醇乙酸酯；2：(2S，4R)-2-苯基四氢吡喃-4醇乙酸酯；3：(2R，4S)-2-苯基-4-羟基四氢吡喃；4：(2S，4R)-2-苯基-4-羟基四氢吡喃；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

采用本发明生产光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物，是利用脂肪酶在有机溶剂中高度的对映选择性，将外消4-羟基四氢吡喃衍生物中的一种手性对映酰基化为乙酸酯，从而实现拆分，以衍生物2-芳基-4-羟基四氢吡喃与酰化剂乙酸乙烯酯反应为例，转酯化拆分如下：

转酯化拆分后各物质的含量由手性柱高效液相色谱检测。以2-苯基-4-羟基四氢吡喃转酯化为例，得到的单一体的对映体过量值计算如下：

(2R，4S)-2-苯基-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值(ee_s，％)计算式为：

${\mathrm{ee}}_s(\%)=\frac{{\left[S\right]}_s-{\left[R\right]}_s}{{\left[S\right]}_s+{\left[R\right]}_s}---\left(1\right)$

式(1)中：[S]_s-------(2R，4S)-2-苯基-4-羟基四氢吡喃的摩尔浓度；[R]_s-------(2S，4R)-2-苯基-4-羟基四氢吡喃的摩尔浓度

(2S，4R)-2-苯基四氢吡喃-4-醇-乙酸酯对映体过量值(ee_p，％)计算式为：

${\mathrm{ee}}_p(\%)=\frac{{\left[R\right]}_p-{\left[S\right]}_p}{{\left[R\right]}_p+{\left[S\right]}_p}---\left(2\right)$

式(2)中：[R]_p-------(2S，4R)-2-苯基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的摩尔浓度；

[R]_p-------(2R，4S)-2-苯基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的摩尔浓度

本发明中的磁性复合物MFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂(M＝Fe、Mn、Co和Zn)是由商品磁粉MFe₂O₄(M＝Fe、Mn、Co和Zn)进行表面功能化修饰制得。0.5g MFe₂O₄磁粉分散于15mL乙醇中，滴加1.5mL NH₃·H₂O，超声分散20min，转移至40℃恒温水浴箱中机械搅拌下加入5mL正硅酸乙酯，反应10min后再按滴加0.1～1.0mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应6h后将温度升至60℃熟化2h形成复合物MFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂，此固体在磁场中分离用去离子水洗涤后于60℃进行真空干燥。

磁性固定化脂肪酶的制备操作过程：0.1g磁性复合物MFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂分散在10mL正庚烷中，加入0.1mL0.1mol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀后加入0.01g脂肪酶，于30℃恒温水浴摇床中振荡固定化3h后，磁场中分离出固定化酶，室温真空干燥后备用。

实施例1酶催化转酯化反应制备光学活性2-苯基-4-羟基四氢吡喃和其乙酸酯

将0.05mol2-苯-4-羟基四氢吡喃和0.05mol的乙酸乙烯酯加入250ml反应器中，然后加入100ml庚烷混合均匀后加入0.1克磁性Fe₃O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化PSL酶，在30℃搅拌下反应24小时，磁场所中分离出固定化酶，得到的手性对映体(2R，4S)-2-苯-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值ee_s99.0％，(2S，4R)-2-苯基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的对映体过量值ee_p为88.6％。

实施例2酶催化转酯化反应制备光学活性2-苯基-4-羟基四氢吡喃和其乙酸酯

将0.05mol2-苯-4-羟基四氢吡喃和0.05mol的乙酸异丙烯酯加入250ml反应器中，然后加入100ml环己烷烷混合均匀后加入0.1克磁性MnFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化PSL酶，在30℃搅拌下反应36小时，磁场所中分离出固定化酶，得到的手性对映体的含量由手性柱高效液相色谱分析，(2R，4S)-2-苯-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值ee_s为98.0％，(2S，4R)-2-苯基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的对映体过量值ee_p为87.6％。

实施例3酶催化转酯化反应制备光学活性2-苯-4-羟基四氢吡喃和其乙酸酯

将0.05mol2-苯-4-羟基四氢吡喃和0.05mol的乙酸乙烯酯加入250ml反应器中，然后加入100ml甲苯混合均匀后加入0.1克磁性MnFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化CRL酶，在30℃搅拌下反应24小时，磁场所中分离出固定化酶，得到的手性对映体(2R，4S)-2-苯-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值ee_s为99.0％，(2S，4R)-2-苯基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的对映体过量值ee_p为92.0％。

实施例4酶催化转酯化反应制备光学活性2-氯苯基-4-羟基四氢吡喃和其乙酸酯

将0.05mol2-氯苯-4-羟基四氢吡喃和0.05mol的乙酸乙烯酯加入250ml反应器中，然后加入100ml甲苯混合均匀后加入0.1克磁性MnFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化CCL酶，在30℃搅拌下反应24小时，磁场所中分离出固定化酶，得到的(2R，4S)-2-氯苯基-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值ee_s为98.0％，(2S，4R)-2-氯苯基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的对映体过量值ee_p为88.0％。

实施例5酶催化转酯化反应制备光学活性2-丁基-4-羟基四氢吡喃和其乙酸酯

将0.05mol2-丁基-4-羟基四氢吡喃和0.05mol的乙酸乙烯酯加入250ml反应器中，然后加入100ml甲苯混合均匀后加入0.1克磁性MnFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化CCL酶，在30℃搅拌下反应8小时，磁场所中分离出固定化酶，得到的手性对映体(2R，4S)-2-丁基-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值ee_s为98.0％，(2S，4R)-2-丁基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的对映体过量值ee_p为78.0％。

实施例6酶催化转酯化反应制备光学活性2-丁基-4-羟基四氢吡喃和其乙酸酯

将0.05mol2-丁基-4-羟基四氢吡喃和0.05mol的乙酸乙烯酯加入250ml反应器中，然后加入100ml甲苯混合均匀后加入0.1克磁性MnFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂固定化CCL酶，在20℃搅拌下反应6小时，磁场所中分离出固定化酶，得到的手性对映体(2R，4S)-2-丁基-4-羟基四氢吡喃的对映体过量值ee_s为84.0％，(2S，4R)-2-丁基四氢吡喃-4-醇乙酸酯的对映体过量值ee_p为75.2％。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种酶催化转酯化反应制备光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物的方法，其特征在于，将外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物与酰基供体摩尔比为1∶1～1∶4的混合物加入有机溶剂中，再加入磁性固定化脂肪酶，控制磁性固定化脂肪酶与外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物的相对用量为1mg∶1ml～100mg∶1ml，反应温度10℃～60℃，搅拌下反应2-36h，磁场中分离出固定化酶停止反应；经柱层析分离得到光学活性4-羟基四氢吡喃衍生物和其乙酸酯。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应温度为20℃～40℃。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外消旋4-羟基四氢吡喃衍生物包括芳基、烷基、烷氧基及其卤取代衍生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酰基供体为乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯和乙酸酐中的一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂是甲苯、苯、环己烷、正己烷、正庚烷、异辛烷、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、异丙醚等中的一种或上述溶剂的相互混合获得的混合溶剂，或者是芳烃、取代芳烃、烷烃、卤代烷烃或者醚。 

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶选自市售的柱状假丝酵母脂肪酶(Candida Cylindracea lipase，CCL)和皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida Rugosa lipase，CRL)、猪胰脂肪酶(Porcine Pancreatic lipase，PPL)、假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas sp lipase，PSL)、南极假丝酵母脂肪酶(Candida Antarctica lipase，CAL)中的一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性固定化酶的磁性载体是MFe₂O₄SiO₂-(CH₂)₃-NH₂(M＝Fe、Mn、Co和Zn)，其中-(CH₂)₃-NH₂基团含量为0.5-1.5mmol/g，粒径为50-300nm，饱和磁化率为10～60emu/g，载酶量在100-200mg/g范围。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，外消旋4-羟基四 氢吡喃浓度为10mmol/L～2500mmol/L，酰基供体浓度10mmol/L～2500mmol/L，磁性固定化脂肪酶用量为2mg/ml～30mg/ml。 

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