CN112980759A - 增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，是通过在茂源链霉菌中，利用人工强启动子kasOp*过量表达内源Subtilisin编码基因，促进了谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，使谷氨酰胺转氨酶的发酵产量得以提高。本发明通过增强Subtilisin编码基因的转录水平，促进了谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，以此来提高谷氨酰胺转氨酶的发酵水平，最终谷氨酰胺转氨酶发酵产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株提高22％。通过本发明可显著提高谷氨酰胺转氨酶的发酵产量，同时使发酵成大幅降低。

Description

增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种提高Subtilisin编码基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TGase)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TGase作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TGase制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等。目前该酶产量仍然较低，有待进一步提升。本发明发现，Subtilisin蛋白参与TGase酶原的活化成熟，是一个与TGase产量提高有重要关系的蛋白。进一步的，本发明通过基因组学信息找到了Subtilisin编码基因SMDS_5092。增强Subtilisin编码基因的表达可以促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种提高Subtilisin编码基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法；通过在茂源链霉菌IPIO中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源的Subtilisin编码基因SMDS_5092，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的菌株，所述菌株的Subtilisin编码基因过量表达。

作为本发明的一个实施方案，所述菌株为茂源链霉菌。

作为本发明的一个实施方案，所述菌株过量表达内源的Subtilisin编码基因。

作为本发明的一个实施方案，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPI O的Subtilisin编码基因SMDS_5092。其序列如SEQ ID NO.1所示。获得的突变株基于过量表达内源Subtilisin编码基因SMDS_5092，促进TGase酶原的活化成熟，最终提升TGase的产量。

第二方面，本发明涉及一种用于过量表达Subtilisin编码基因的整合型质粒载体，所述载体包含源于茂源链霉菌的Subtilisin编码基因。

作为本发明的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因源于茂源链霉菌IPIO。

作为本发明的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因为序列如SEQ ID NO.1所示的Subtilisin编码基因SMDS_5092。

作为本发明的一个实施方案，所述过量表达为同源过量表达。

第三方面，本发明涉及一种用于过量表达Subtilisin编码基因的整合型质粒载体的构建方法，通过PCR扩增得到Subtilisin编码基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

作为本发明的一个实施方案，通过PCR扩增得到1527bp的SMDS_5092基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*中人工强启动子kasOp*下游的NdeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1754。

作为本发明的一个实施方案，所述扩增采用的引物为序列如SEQ ID NO.2/3所示的引物SMDS_5092-F/R。

第四方面，本发明涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，将前述的整合型质粒载体，或前述的方法构建得到的整合型质粒载体接合转移导入受体菌茂源链霉菌中进行重组获得所述菌株。

作为本发明的一个实施方案，所述重组为位点特异性重组。

作为本发明的一个实施方案，重组之后还包括通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株的步骤。

第五方面，本发明涉及一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强Subtilisin编码基因的转录水平以提高茂源链霉菌发酵生产氨酰胺转氨酶的产量。

作为本发明的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因源于茂源链霉菌IPIO。

作为本发明的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因为序列如SEQ ID NO.1所示的Subtilisin编码基因SMDS_5092。

作为本发明的一个实施方案，在茂源链霉菌过量表达内源的Subtilisin编码基因获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。作为一个具体示例，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092，获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。通过在茂源链霉菌IPIO中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源的Subtilisin编码基因SMDS_5092，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，进而提高谷氨酰胺转氨酶产量。

作为本发明的一个实施方案，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵26-28h。还可包括收集发酵液并进行酶活检测的步骤。

作为一个具体示例，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200rpm的条件下发酵26h。

作为本发明的一个实施方案，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3w/v％。作为一个具体示例，所述种子培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.2w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2w/v％。

作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3w/v％，发酵促进剂0.1-0.4w/v％。作为一个具体示例，所述发酵培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.2w/v％，K₂HPO₄·3H₂O0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％。

本发明所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,XinranWang,Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification and Engineeringof Post-PKS Modification Bottlenecks for Ansamitocin P-3Titer Improvement inActinosynnema pretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280.Biotechnology Journal2017,12,1700484》中记载。

本发明所涉及的菌株茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO)由江苏东汇生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2020196，保藏日期为2020.6.10。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明发现Subtilisin蛋白参与TGase酶原的活化成熟，是一个与TGase产量提高有重要关系的蛋白；增强Subtilisin编码基因的表达可以促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量；

2)本发明进一步在茂源链霉菌IPIO中，利用整合型载体pDR3-K*，在IPIO染色体上分别插入一个拷贝、来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092，实验室摇瓶水平下较对照菌株(空白载体整合菌株)酶活提高22％；通过本发明可显著提高TGase的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为SMDS_5092基因过量表达质粒构建示意图；

图2为Subtilisin编码基因增强表达突变株与对照菌株TGase发酵产量示意图；

图3为Subtilisin编码基因增强表达突变株与对照菌株发酵液SDS-PAGE示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备Subtilisin编码基因SMDS_5092过量表达的突变株WD02的具体过程。具体包括以下步骤：

第一步：构建质粒pLQ1754：以茂源链霉菌IPIO基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物SMDS_5092-F/R，通过PCR扩增得到SMDS_5092基因片段(1527bp)。在质粒pDR3-K*中人工强启动子kasOp*(W,Wang,X,et al.An EngineeredStrong Promoter for Streptomycetes[J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(14).)下游的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pLQ1754，如图1。

*第一步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：

NdeI识别位点： EcoRI识别位点：

5′...CA^TATG...3′ 5′...G^AATTC...3′

3′...GTAT^AC...5′ 3′...CTTAA^G...5′

*第一步所用到的引物序列为：

引物名称	碱基序列
		SMDS_5092-F	ATAT<u>CATATG</u>GCTCATCTGCGCCCCAGA SEQ ID NO.2
SMDS_5092-R	ATAT<u>GAATTC</u>TCAGTTCTTCACGGCCGCCA SEQ ID NO.3

*第一步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：

PCR反应体系：DNA模板30ng，引物20pmol，50％DMSO 5μL，dNTP 10nmol，缓冲液25μL，Taq DNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至50μL；

PCR条件：95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 2min；循环30次；72℃ 10min。

第二步：将第一步构建得到的过量表达的质粒载体pLQ1754通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到SMDS_5092基因过量表达的突变株。具体包括以下步骤：

将基因过量表达的质粒pLQ1754转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中。将对应ET12567(pUZ8002)接种于含有Apr(终浓度50μg/mL)、Kan(终浓度50μg/mL)和Chl(终浓度25μg/mL)三种抗生素的LB中，37℃培养20h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时制备的茂源链霉菌IPIO新鲜菌丝体(约24h培养物)，用2×孢子预萌发液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的ISP4MYM固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。12h后取出平板，分别将安普霉素(终浓度50μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在ISP4MYM固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5d后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素(终浓度50μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素的ISP4MYM固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到SMDS_5092基因加倍的突变株，记为WD02。

*第二步中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：

PCR体系：DNA模板10～100ng，引物10pmol，50％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液10μL，加纯水补齐至20μL；

引物序列为：

kasOp*-F：TGTTCACATTCGAACGGTCT SEQ ID NO.4；

SMDS_5092-R：ATATGAATTCTCAGTTCTTCACGGCCGCCA SEQ ID NO.3

PCR条件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 2min；循环30次；72℃ 10min。

实施例2

本实施例为利用Subtilisin编码基因过量表达的突变株WD02发酵产生TGase的过程。具体步骤如下：将Subtilisin过量表达的菌株WD02涂布于固体ISP4MYM培养基上活化，30℃培养5-7d后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200rpm条件下发酵26h，收集发酵液进行酶活检测。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

实施例3

本实施例为利用比色法检测TGase的酶活的方法。具体为：取100μL稀释10-20倍的发酵液上清于试管中，其中一管加入100μL水作为对照，加入1mL 37℃预热好的A液，37℃反应10min后，加入1mL B液终止反应。用1cm的石英比色皿，在分光光度计525nm处测定发酵液的吸光度。最终将OD₅₂₅带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TGase的酶活。

其中，溶液配制方法如下：

A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸(Na-CBZ-GLN-GLY)于烧杯中，加350mL水，调节pH为6.0，加水定容至400mL。

B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％FeCl₃溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。

图2为Subtilisin编码基因增强表达突变株与对照菌株TGase相对发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下突变株的产量对比野生型菌株提高22％。

图3为Subtilisin编码基因增强表达突变株与对照菌株发酵液SDS-PAGE示意图。结果表明，突变株的TGase酶原(pro-TGase)完全活化为TGase。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

上海东之汇生物科技有限公司

泰兴市东圣生物科技有限公司

<120> 增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法

<130> KAG45791

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO (Streptomyces mobaraensis IPIO)

<400> 1

atggctcatc tgcgccccag acgccggcac gccgccctcg cgttccccgt cggcctggcc 60

ctcaccgcct cgatcggctt cctgccgggc accgcctcgg ccgccgcgcc ggccgcgaag 120

gccccgcagg ccaaggtgcg gacggacggg ccactgctgt cgtacgtggt caacacgggg 180

accgcgcggg ccacgctcga ccaggtgaag aaggccgtcg gaagcaacgg cggcagcatc 240

gtggagtcgt acgacaagat cggcgtcatc gtcgtccact ccaagaaccc cgacttcgcc 300

aaggcgctgc gcacggtgcc cggcgtcgag tcggccggtg ccacccggac cgcgcccatc 360

accccggcgg ccaccacgga cgtcggcaag cccgagaagc tgaagctgtc gaaggccaac 420

gcgctggccg ccgccaagac cgccaagccg ggcaaggagc cgctggagag cctccagtgg 480

gacatggccg ccatcaaggc ggacaaggcc gcgaagatca acccgggcag ccgcaaggtc 540

accgtcggcg tcatcgacac gggcgtcgac gacacccacc ccgacctcgc cccgaacttc 600

tcccgcgccc agtcggccag ctgcgtcacc ggcaaggccg acaccagcgc gggcgcctgg 660

cgcccgtaca accccaagga ggactaccac gggacgcacg tcgccggcac catagccgcg 720

gcgcgcaacg ggataggcgt cacgggcgtc gccccgaaca ccaaggtctc cgccatcaag 780

gtgagcacca agaccggcag cttcttctac gcggagagcg tggtctgcgc cttcgtcttc 840

gccgccgacc acggcatagc ggtgacgaac aacagctact acgtcgaccc gtggatgttc 900

aactgcgcga acgacgcgga ccagaaggcg atagccgacg cggtcgagcg cgccaccgcg 960

tacgccgacc gcaagggcgt cgtcaacgtc gcctccgcgg gcaactccaa cttcgacctg 1020

gccgcgaaga agatcacgga caagtcgagc cccaacgaca ccaagcccgg ttcgcgtgac 1080

atcgacccgt ccacctgcct ggacgtcccg gcccagctgc ccggcgtcgt caccgtctcc 1140

gcgaccggcg tcaactcgct gaagtcgtac tactccaact acggccaggg cgtcatcgac 1200

gtcgcagccc ccggcggcga catccgccag gtgccggacg cccccgccaa ggacggccgc 1260

atcctgtcca ccatgccggg tggcgactac gcctacctgc agggcacctc gatggccggc 1320

ccgcacgtgg ccggtgtggc ggcgctgctg aaggcgacgc acccgaagtc caacgcggcc 1380

gagatccagt ggatcctcaa ggcccaggcg aagaacccgg gctgcccggt caacgccccc 1440

gcggacgctc cctgcgtcgg caccaagaac atcaacagcc actacggcta cggcatcgtc 1500

gacgccctgg cggccgtgaa gaactga 1527

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atatcatatg gctcatctgc gccccaga 28

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atatgaattc tcagttcttc acggccgcca 30

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttcacatt cgaacggtct 20

Claims (10)

1.一种高产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述菌株的Subtilisin编码基因过量表达。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092。

3.一种用于过量表达Subtilisin编码基因的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体包含源于茂源链霉菌的Subtilisin编码基因。

4.根据权利要求3所述的整合型质粒载体，其特征在于，所述Subtilisin编码基因为序列如SEQ ID NO.1所示的Subtilisin编码基因SMDS_5092。

5.一种根据权利要求3或4所述的整合型质粒载体的构建方法，其特征在于，通过PCR扩增得到Subtilisin编码基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

6.一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，将如权利要求3或4所述的整合型质粒载体，或如权利要求5所述的方法构建得到的整合型质粒载体接合转移导入受体菌茂源链霉菌中进行重组获得所述菌株。

7.一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于，通过增强Subtilisin编码基因的转录水平以提高茂源链霉菌发酵生产氨酰胺转氨酶的产量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵26-28h。收集发酵液进行酶活检测。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3w/v％，K₂HPO₄·3H₂O0.1-0.3w/v％；

所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3w/v％，发酵促进剂0.1-0.4w/v％。

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