BRPI0519207B1 - Polinucleotídeos, polipeptídeos com atividade gamaglutamil quinase, vetor, hospedeiro transformado, e processo para produzir l-prolina - Google Patents

Abstract

gama-glutamil quinase, sequências de ácido nucléico,veículo recombinante e processo para produzir l-prolina. a invenção refere-se a variantes mutadas do gene prob de bactéria corineforme , que codificam y-glutamil quinase, e a processo para produção fermentativa de l-prolina usando bactéria que contém essa mutação.

Description

[001] A presente invenção se refere a uma enzima que tem ativi- dade de Y- glutamil quinase. Mais particularmente, a presente inven- ção caracteriza aquelas enzimas que tem um aminoácido proteinogê- nico diferente de glicina na posição 149 da seqüência de aminoácido ou uma posição comparável.

[002] As enzimas que tem atividade de Y - glutamil quinase são preferivelmente empregadas na produção fermetativa de L-prolina. A via biossintética de L-prolina, começando a partir de glutamato, está

Esquema 1 tradução do esquema 1: glutamato; gama-glutamil quinase: proB; glu- tamato-5-fosfonato; glutamato-5-semialdeído desidrogenase proA; NADP fosfanato; pirrolina-5-carboxilato-reductase; L-pirrolina; L- glutamato; y-semialdeído; espontâneo; L—Δ1—pirrolina—5—carboxilato

[003] Sabe-se que aminoácidos podem ser produzidos por cepas fermentadoras de, por exemplo, bactéria corineforme, em particular Corynebacterium glutamicum. Devido à grande importância, esforços estão continuamente sendo feitos para melhorar os processos de produção. Melhoras nos procedimentos podem referir-se a medidas com relação a tecnologia de fermentação, tais como, por exemplo, agitação ou suprimento de oxigênio, ou a composição do meio nutriente, tal como, por exemplo, concentração de açúcar durante a fermentação, ou a elaboração para a forma do produto, por exemplo por meio de cromatografia de troca de íons, ou as propriedades de performance intrínsecas do microorganismo em si.

[004] As propriedades de desempenho desses microorganismos são melhoradas pela aplicação de métodos de mutagênese, seleção e escolha de mutantes. Isso resulta em cepas que são resistentes a anti- metabólitos ou auxotróficos para metabólitos importantes para regulação e produção de aminoácidos. Um anti-metabolito conhecido é o análogo de prolina 3,4-desidro-DL- prolina (DHP).

[005] Há alguns anos, métodos de DNA recombinante tem sido igualmente usados para melhorar cepas de Corynebacterium produtoras de L-aminoácidos pela amplificação de genes de biosíntese de aminoácidos individuais e investigação do efeito sobre a produção de aminoácido.

[006] A seqüência de nucleotídeo do genoma de Corynebacterium glutamicum é descrita, inter alia, em EP-A-1108790 e também foi depositada no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) sob os nú-meros de acesso NC_003450.2 e BX927148.1 a BX927157.1.

[007] Sleator et al., relatam a possibilidade de causar superprodução na biosíntese de prolina pela mutação de proB-Gen de Listeria monocitogenes (Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 4560-5). As mutações ali especificadas e referidas como bem-sucedidas dizem respeito a genes proB que codificam para Y-glutamil quinases que tem as seguintes mutações: V121I, A144V e E146K . Além disso, menção é feita ao fato de que as regiões nas quais essas mutações ocorrem correspondem muito bem à região também identificada em outros organismos como uma região alvo para mutações vantajosas.

[008] Foi portanto o objetivo da presente invenção tornar disponíveis, variantes de proteína adicionalmente mutadas e, onde apropriado, melhoradas de uma Y-glutamil quinase, que podem ser empregadas vantajosamente em um processo técnico para produção fermenta- tiva de L-prolina.

[009] Esse objetivo e outros objetivos que não são especificados em detalhe mas surgem de uma forma obvia a partir da arte anterior são alcançados pela especificação de Y-glutamil quinases da reivindicação 1. Reivindicação 2 tem foco em enzimas preferidas desse tipo. Reivindicação 3 e 4 se referem às seqüências de nucleotídeos que codificam essas enzimas, respectivamente, enquanto a reivindicação 5 tem foco em veículos produzidos de forma recombinante que tem as seqüências de nucleotídeos já mencionadas. A reivindicação 5, finalmente se refere a processo de produção de acordo com a invenção para L-prolina com o auxílio das enzimas mencionadas.

[010] Pelo fornecimento de uma Y-glutamil quinase (produto do gene proB) que tem um aminoácido proteinogênico diferente de glicina na posição de aminoácido 149 ou uma posição comparável, o objetivo estabelecido é alcançado particularmente surpreendentemente, embora não menos vantajosamente. Comparado com as enzimas selvagens, Y - glutamil quinases que tem uma mutação apropriada ajudam a produzir L-prolina de uma maneira melhorada em um processo de produção fermentativo. Usando os métodos de acordo com a invenção, é possível melhorar o desempenho dos organismos hospedeiros ou do processo de fermentação com relação a um ou mais dos parâmetros selecionados a partir do grupo de concentração do produto (produto por volume), rendimento do produto (produto formado por fonte de carbono consumida) e formação de produto (produto formado por volume e tempo) ou ainda outros parâmetros de processo e combinações desses por pelo menos 0,5% , pelo menos 1% , pelo menos 1,5% ou pelo menos 2% , com base na cepa inicial ou cepa parental ou o processo de fermentação com o uso das ditas enzimas.

[011] Preferência é dada para fornecer Y-glutamil quinases nas quais um aminoácido preferivelmente, L-aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste de Lys , Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val , Gln, His , Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys ou Phe está presente na posição de aminoácido como definida de acordo com a invenção ou uma posição comparável. (Os aminoácidos mencionados, incluindo glicina, também são referidos como aminoácidos proteinogênicos na técnica). Preferência muito particular é dada para a substituição de gli- cina com ácido L-aspártico na posição 149 (G149D) na dita enzima. A maior preferência é dada para uma Y-glutamil quinase de acordo com a invenção, como especificado acima, que tem 369+-40 , preferivelmente +-20 , mais preferivelmente +-10 e mais particularmente preferivelmente +-5 aminoácidos ou +-3 aminoácidos de extensão. Enzimas intrínsecas ao hospedeiro, chamadas aminopeptidases, são conhecidas como sendo capazes de clivar o aminoácido metionina N- terminal da proteína formada. Sabe-se ainda que clivar um (1 ) ou dois (2) e não mais do que três (3 ) aminoácidos da terminação C da proteína prejudica a atividade da enzima apenas de forma desprezível, no máximo, se ocorrer. Entretanto, a enzima pode aumentar de tamanho por anexar certas proteínas de fusão (vide abaixo).

[012] A presente invenção também abrange a seqüência de amino- ácido de SEQ ID NO.: 2 , preferivelmente 4 , ou uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a ela, com as seqüência compreendendo a substituição de aminoácido de glicina por outro aminoácido, em particular quaisquer dos aminoácidos preferidos mencionados, na posição 149 ou uma posição comparável. Dessa forma a invenção também abrange aquelas enzimas que tem os graus de identidade acima mencionados ao nível do aminoácido em comparação com SEQ ID NO.: 2 , preferivelmen- te 4. Essas enzimas podem da mesma forma se originar de fontes naturais. Alternativamente, elas podem ter sido modificadas por tecnologia de DNA recombinante de tal forma que o versado na técnica pode predizer a atividade enzimática a ser retida ou essencialmente retida (cf . por exemplo Sambrook et al , “Molecular Cloning, A Laboratory Handbook” , 2a edição 1989 , CSH Press , Cold Spring Harbor, Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology” , John Wiley & Sons , NY 2001). Dessa forma, aminoácidos que não estão presentes no sítio ativo e cuja substituição por um aminoácido “do mesmo tipo” é, em princípio, não esperada de resultar em uma estrutura tridimensional substancialmente alterada podem ser substituídos por um aminoácido “do mesmo tipo”. Pode ser esperado, por exemplo, que certos aminoácidos com cadeias laterais não polares (aminoácidos do mesmo tipo) podem ser substituídos, por exemplo, isoleucina por valina, sem ter uma influencia (substancial) sobre a função biológica ou enzimática da enzima de acordo a invenção, ou sobre a atividade enzimática. O versado na técnica pode, com base nesse conhecimento, alcançar conclusões correspondentes também para a substituição de outros tipos de aminoácidos (por exemplo a substituição de aminoácidos básicos por outros aminoácidos básicos ou de aminoáci- dos com cadeias laterais polares não carregadas por outros aminoácidos desse grupo).

[013] Preferência é dada da mesma forma a uma Y-glutamil qui- nase que tem pelo menos seqüência de aminoácidos correspondente às posições, ou posições comparáveis, 145 a 154 , mais preferivelmente 130 a 169 e muito particularmente preferivelmente 110 a 189 de SEQ.ID NO.: 2 , preferivelmente 4 , sendo possível para a extensão da seqüência de aminoácido de Y-glutamil quinase corresponder aos números indicados acima.

[014] Em uma modalidade ainda mais preferida, as enzimas de acordo com a invenção compreendem adicionalmente pelo menos uma seção de aminoácidos heterólogos pela qual esses polipeptídeos são caracterizados como proteínas de fusão. Exemplos de componentes heterólogos da proteína de fusão de acordo com a invenção podem ser sinalizadores (por exemplo sinalizador de His ou sinalizador Flag) que podem ser empregados na purificação das proteínas de fusão de acordo com a invenção. Em outras modalidades, os componentes heterólogos podem ter uma atividade enzimática separada. Em tal caso, os dois componentes enzimáticos são preferivelmente conectados por um ligante, tal como uma glicina flexível, ou ligante glicina- serina de 6-10 aminoácidos de extensão, a fim de garantir a funcionalidade dos componentes. O termo “heterólogo”, como aqui usado, pode significar, por um lado, que os componentes da proteina de fusão não ocorrem naturalmente juntos em uma forma covalentemente ligada, e por outro lado, que os componentes são derivados de espécies diferentes. Proteínas de fusão são geralmente preparadas por meio de tecnologia de DNA recombinante (vide Sambrook et al., loc. cit.).

[015] Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere a uma seqüência de nucleotídeos (seqüência de ácido nucléico) que codifica Y-glutamil quinase de acordo com a invenção, como especificado acima. Consequentemente, a invenção também se refere a se- qüências de nucleotídeos replicáveis que codificam para a enzima Y- glutamil quinase, sendo possível para as seqüências de aminoácidos correspondentes codificadas por essas seqüências de nucleotídeos terem algum aminoácido proteinogênico, exceto glicina, na posição 149 ou uma posição comparável.

[016] As seqüências de ácido nucléico da invenção codificam preferivelmente uma Y-glutamil quinase, com a seqüencia de aminoá- cido codificada, correspondente compreendendo um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste de Lys , Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His , Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys ou Phe na posição 149 ou uma posição comparável. Uma seqüência de nucleotí- deo que codifica uma Y-glutamil quinase que tem um ácido L-aspártico na posição 149 ou uma posição comparável é muito particularmente preferida.

[017] A invenção da mesma forma se refere a seqüências de ácido nucléico replicáveis que codificam uma Y-glutamil quinase que tem a substituição de aminoácido de acordo com a invenção na posição 149 ou uma posição comparável, com essas seqüências a) sendo pelo menos 70% idênticas a SEQ. ID. NO.: 1, pre-ferivelmente SEQ. ID. NO.: 3 , or b) codificando uma Y-glutamil quinase de acordo com a invenção, que tem 369+40 aminoácidos de extensão, ou c) codificando uma Y-glutamil quinase de acordo com a invenção, que tem a seqüência de aminoácido de SEQ. ID. NO.: 2 , preferivelmente SEQ. ID. NO.: 4 , pelo menos nas posições ou posições comparáveis 145 a 154 , ou d) codificando uma Y-glutamil quinase de acordo com a invenção, que tem a seqüência de aminoácido de SEQ. ID. NO.: 2 , preferivelmente SEQ. ID. NO.: 4 , pelo menos nas posições ou posições comparáveis 145 a 154 e hibridiza sob condições experimentais es- tringentes à seqüência de nucleotídeos complementar a SEQ. ID. NO.: 1 ou SEQ. ID. NO.: 3, ou f) seqüência de nucleotídeos replicável que codifica a enzima de acordo com a invenção, Y-glutamil quinase, e cuja seqüência de base compreende adenina na posição 446, como representado em SEQ. ID. NO.: 3.

[018] O escopo das reivindicações preferivelmente compreende da mesma forma seqüências de ácido nucléico replicáveis que codificam Y—glutamil quinase de acordo com a invenção, que tem 369+20, mais preferivelmente +10 e o mais preferivelmente + 5 ou + 3, resí- duos de aminoácidos de extensão.

[019] A invenção também se refere a uma seqüência de nucleotí- deo como representada em SEQ. ID. NO.: 1, preferivelmente SEQ. ID. NO.: 3. Como já mencionado, a invenção também abrange aquelas seqüências que são pelo menos 70% idênticas àquela seqüência no nível de nucleotídeo. Um exemplo de uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 70% idêntica aquela de SEQ. ID. NO.: 3 é mostrada em SEQ. ID. NO.: 5. SEQ. ID. NO.: 6 mostra a seqüência de aminoá- cido de Y-glutamil quinase, codificada por SEQ. ID. NO.: 5.

[020] A invenção igualmente se refere a seqüências de acido nu- cléico replicáveis que codificam Y-glutamil quinases que incluem preferivelmente pelo menos a seqüência de aminoácido correspondentes às posições 130-169 ou posições comparáveis, e muito particularmente preferivelmente posições 110 a 189 de SEQ ID NO : 2, preferivelmente 4, e que hibridizam sob condições experimentais severas com a se- qüência de nucleotídeo complementar a SEQ ID NO.: 1 ou SEQ ID NO.: 3. O termo “complementar” significa de acordo com a invenção que a complementaridade se estende sem intervalos por toda a região da molécula de acido nucléico de acordo com a invenção. Em outras palavras, de acordo com a invenção é dada preferência a complementaridade que se estende por 100% de toda a região da seqüência de acordo com a invenção, isto é, a partir da terminação 5’ representada até a terminação 3’ representada, em particular a região codificante (cds). Em modalidades ainda mais preferidas, a complementaridade se estende por uma região de pelo menos 19, preferivelmente pelo menos 21, nucleotídeos sucessivos que preferivelmente não codificam o sítio ativo de atividade enzimática.

[021] Preferência é dada àquelas seqüências de ácido nucléico derivadas de bactéria corineforme, preferivelmente Corynebacterium glutamicum. Seqüências de ácido nucléico de genes ou alelos, que estão presentes na população de uma espécie, são também referidas na técnica como genes ou alelos endógenos.

[022] A presente invenção se refere adicionalmente a veículos re- combinantes (rec) que tem as seqüências de nucleotídeos de acordo com a invenção. Veículos adequados são quaisquer modalidades consideradas para esse fim pelo perito, em particular vetores e organismos hospedeiros. Exemplos de organismos hospedeiros que podem ser mencionados sob esse aspecto são leveduras tais como Hansenula polyinorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, procariotos tais como E. coli , Bacillus subtilis, bactéria corineforme tal como Corynebacte- rium glutamicum, ou eucariotos tais como células de mamíferos, células de insetos, ou células de plantas. Esses organismos acumulam, onde apropriado já antes das medidas da presente invenção, L-prolina em suas células ou no meio de fermentação que as circundam. Dessa forma, nessa modalidade preferida, o hospedeiro de acordo com a invenção, é uma célula hospedeira recombinante que foi transformada ou transfectada com uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção ou um vetor de acordo com a invenção (veja abaixo) ou provi-dos com eles por meio de conjugação (os termos “transformação”, “transfecção” e “conjugação” são usados de forma sinônima de acordo com a presente invenção). Transformação e transfecção, respectivamente podem ser realizadas de acordo com métodos conhecidos, por exemplo por meio de co-precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, eletroporação, bombardeamento de partículas ou infecção viral. A célula de acordo com a invenção pode conter o ácido nucléico recombinante extracromossomalmente ou de uma forma integrada ao cromossomo. Em outras palavras, a transfecção/transformação pode ser estável ou transitória. Os processos para clonagem são bem-conhecidos do perito (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis , T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual , 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Cepas de E. coli podem ser utilizadas para a preparação recom- binante e métodos de mutagênese, que incluem inter alia: E. coli XLl Blue, NM 522 , JM101 , JM109 , JM105 , RRl , DH5α, TOP10 , HB101 , BL21 codon plus , BL21 (DE3) codon plus , BL21 , BL21 (DE3 ), MM294. Plasmídeos usados inter alia para clonagem do construto de gene que tem o ácido nucléico de acordo com a invenção no organismo hospedeiro são da mesma forma conhecidos do versado na técnica (vide também PCT/EP03/07148; veja abaixo). Um hospedeiro do gênero Corynebacterium, dos quais menção particular pode ser feita, é a espécie Corynebacterium glutamicum que é conhecida na técnica. Exemplos de cepas selvagens conhecidas na técnica do gênero Corynebacterium são: Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium effiziens DSM 44549 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 e Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

[023] Informação com relação a classificação taxonômica de cepas desse grupo de bactérias podem ser encontradas, inter alia, em Kampfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42 , 989-1005 (1996)) e em US-A-5, 250, 434. Há alguns anos (Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 41 (2) , 255-260 (1991)), bactérias corineformes com os nomes de espécie “Brevibac- terium flavum”, “Brevibacterium lactofermentum” e “Brevibacterium divaricatum” tem sido classificadas sob a espécie Corynebacterium glutamicum. Bactéria corineforme com o nome de “Corynebacterium melassecola” pertencem da mesma forma à espécie Corynebacterium glutamicum.

[024] Exemplos de cepas de bactéria corineforme produtoras de L-prolina são as cepas: Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11421, Brevibacterium flavum NRRL B-11422, Corynebacterium glutamicum NRRL B-11423, Microbacterium ammoniaphilum NRRL B-11424, Corynebacterium glutamicum ATCC 21157, Corynebacterium glutamicum ATCC 21158, Corynebacterium glutamicum ATCC 21159, Corynebacterium glutamicum ATCC 21355, Corynebacterium acetophilum FERM-P 4045, Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 4962, Arthrobacter citreus FERM-P 4963, e Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4964,

[025] Todas as quais são descritas em US 4.224.409 e US 4.444.885.

[026] Nos vetores de acordo com a invenção, as seqüências de ácido nucléico de acordo com a invenção são preferivelmente opera- velmente ligadas a uma seqüência de controle de expressão para ser capaz de ser transcrita e, onde apropriado, traduzida em uma célula hospedeira adequada. Seqüências de controle de expressão geralmente compreendem um promotor e, onde apropriado, seqüências regulató- rias adicionais tais como operadores ou intensificadores. Também é ainda possível que seqüências de iniciação de tradução estejam presentes. Seqüências de controle de expressão adequadas para células hospedeiras procarióticas e eucarióticas são bem-conhecidas do versado na técnica (vide por exemplo, Sambrook et al., loc. cit.). O vetor re- combinante de acordo com a invenção pode ainda incluir elementos comuns tais como origem de replicação e um gene marcador de seleção. Exemplos de vetores recombinantes adequados são plasmídeos, cosmídeos, fagos, ou vírus (vide, por exemplo, Sambrook et al., supra). Plasmídeos adequados são em princípio quaisquer modalidades disponíveis para esse fim para o versado na técnica. Tais plasmídeos podem ser encontrados, por exemplo, no artigo por Studier e colaboradores (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990). Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol . 185 , 61-89) ou nas brochuras por Novagen, Pro- mega, New England Biolabs , Clontech ou Gibco BRL. Plasmídeos e vetores adicionalmente preferidos podem ser encontrados em Glover, D. M. (1985), DNA cloning : a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez , R. L. and Denhardt, D. T. (eds) (1988), Vec-tors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, But-terworth, Stoneham; Goeddel , D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol . 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

[027] Plasmídeos que podem ser usados para clonagem dos construtos de gene que tem as seqüências de ácido nucléico contempladas no organismo hospedeiro de uma maneira muito particularmente preferida são ou são baseadas em: pUCl8/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pCR (Invitrogen), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK- 233-3 (Stratagene) ou pET (Novagen). Outros plasmídeos preferidos são pBR322 (DSM3879), pACYCl84 (DSM4439) e pSC101 (DSM6202), todos os quais podem ser obtidos a partir de

[028] DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Brunswick, Alemanha. Exemplos de promotores preferidos são o promotor T7, promotor lac, promotor tac, promotor trp, promotor rha e promotor ara.

[029] Preferivelmente, as Y-glutamil quinases de acordo com a invenção ou os ácidos nucléicos que as codificam estão superexpressas em bactéria corineforme, preferivelmente do gênero Corynebacterium, particularmente preferivelmente da espécie Corynebacterium glutamicum.

[030] Superexpressão significa um aumento na concentração intracelular ou atividade das Y-glutamil quinases de acordo com a invenção.

[031] A superexpressão mede aumento da atividade ou concentração da proteína correspondente geralmente por pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, com base na atividade ou concentração da proteína no microorganismo inicial.

[032] Superexpressão pode ser alcançada pelo aumento do número de cópias dos genes ou alelos de acordo com a invenção por pelo menos uma (1) cópia ou pela mutação da região promotora e região regulatória ou do sítio de ligação de ribossomo que está localizado a montante do gene estrutural. Cassetes de expressão incorporados a montante do gene estrutural agem da mesma forma. Além disso, promotores induzíveis tornam possível aumentar a expressão durante produção fermentativa de L-prolina. Medidas da extensão do tempo de vida do RNAm melhoram igualmente a expressão. A atividade enzimá- tica é ainda mais amplificada pelo impedimento da degradação da pro-teína enzima. Os genes ou construtos gênicos podem estar presentes tanto em plasmídeos com diferentes números de cópias ou no cromossomo de uma forma integrada e amplificada. Alternativamente, os genes em questão podem ainda ser superexpressos pela alteração da composição do meio e processo de cultivo.

[033] Plasmídeos que são replicados em bactéria corineforme são úteis para aumentar o número de cópias dos alelos de proB de acordo com a invenção. Vários vetores plasmidiais conhecidos tais como, por exemplo, pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Mi-crobiology (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) ou pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) são baseados nos plasmídeos crípticos pHMl519, pBLl ou pGAl. Outros vetores plasmidiais tais como, por exemplo, aqueles a base de pCG4 (US-A 4, 489, 160), ou pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) ou pAGl (US-A 5, 158, 891) podem ser usados da mesma forma. Um resumo sobre vetores plasmidiais de Corynebacterium glutamicum pode ser encontrado em Tauch et al., (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40 (2003).

[034] É ainda possível aumentar o numero de cópias pela aplicação do método de amplificação gênica cromossômica que foi descrito, por exemplo, por Reinscheid et al., (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) no contexto de duplicação e amplificação do operon-hom- thrB. Esse método envolve clonar o gene completo ou alelo em um vetor plasmidial que pode ser replicado em um hospedeiro (tipicamente E. coli) mas não em C. glutamicum. Exemplos de vetores adequados são pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784791 (1983)), pK18mob ou pKl9mob (Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1- TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994); US-A 5, 487, 993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMl (Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516 (1991)) ou pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)). O vetor plasmidial contendo o gene ou alelo a ser amplificado é subsequentemente transferido por meio de conjugação ou transformação para a cepa de C. glutamicum desejada. O método de conjugação é descrito em Schafer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756759 (1994)), por exemplo. Métodos de transformação são descritos em Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) e Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)), por exemplo. Após recombinação homóloga por meio de um evento de passagem, a cepa resultante contém pelo menos duas cópias do gene ou alelo em questão. A fim de aumentar o número de cópias por pelo menos 1, 2 ou 3, é em particular também possível usar o método de amplificação "uma colada na outra" como descrito em WO 03 /014330 ou o método de amplificação por meio de integração em uma localização desejada, como descrito em WO 03 /040373.

[035] Métodos de mutagênese descritos na técnica anterior são usados para gerar a substituição de aminoácidos de acordo com a invenção em Y-glutamil quinases

[036] (por exemplo SEQ ID NO: 2) e outras mutações de proB de acordo com a invenção, caracterizadas por uma substituição de amino- ácidos na posição 149. Métodos mutagênese adequados são quaisquer métodos disponíveis para esse fim para o versado na técnica.

[037] Métodos de mutagênese in vivo clássica usando substâncias mutagênicas tais como, por exemplo, N-metil-N’-nitro-N- nitroso- guanidina (MNNG) ou luz ultravioleta podem ser usados para mutagê- nese. As células mutagenizadas são, onde apropriado, subseqüente- mente aplicadas a um ágar mínimo contendo 3,4-desidro-DL-prolina em concentrações de aprox. 0,5 - 1 g/1, aprox. 1 - 2 g/1 ou aprox. 2 - 3 g/1. Mutantes individuais são isolados e a seqüência de nucleotídeo do gene ou alelo proB é determinada, onde apropriado após um processo de clonagem prévio.

[038] É ainda possível usar para a mutagênese métodos in vitro tais como, por exemplo, tratamento com hidroxilamina (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Labo-  ratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) ou oligonucleotídeos mutagê- nicos (T. A. Brown: Gentechnologie fur Einsteiger [engenharia genética para iniciantes], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993; livro texto por Knippers (,,Molekulare Genetik” [genética molecular ], 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995); Winnacker (,,Gene und Klone” [genes e clones], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990); Hagemann (,,Allgemeine Genetik” [genética geral], Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1986)) ou a reação em cadeia da polimerase (PCR) como descrita no manual por Newton e Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). Eles incluem, em particular, mutagênese de saturação, mutagênese randômica, métodos de recombinação in vitro e mutagê- nese direcionada ao sítio (Eigen, M. and Gardiner, W. (1984), Evoluti-onary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967-978; Chen, K. and Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073-1077; Horwitz, M. and Loeb, L. (1986), Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405-7409; Dube, D. and L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 28, 5703-5707; Stemmer, P. C. (1994), Rapid evolution of a protein in vi tro by DNA shuffling, Nature 370, 389-391 e Stemmer, P. C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747-10751). O uso de métodos in vitro envolve amplificação do gene pró-B descrito na técnica anterior com o auxílio da reação em cadeia de polimerase, começando a partir de DNA total isolado a partir de uma cepa selvagem, clonagem do dito gene, onde apropriado, em vetores plasmidiais adequados e então submetendo o DNA ao proces- so de mutagênese. Instruções sobre a amplificação de seqüências de DNA com o auxílio da reação em cadeia da polimerase podem ser encontradas pelo versado na técnica, entre outros lugares, no manual por Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) e em Newton and Graham: PCR (Spektrum Akade- mischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). Da mesma forma também é possível usar métodos de mutagênese in vitro, como descrito, por exemplo, no bem-conhecido manual por Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989). Métodos cor-respondentes também são disponíveis comercialmente na forma de “kits” tais como, por exemplo, o “QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit” de Stratagene (La Jolla, USA), descrito por Papworth et al., (Strategies 9 (3), 3-4 (1996)). Mutantes de proB adequados são sub- seqüentemente selecionados e investigados pelos métodos descritos acima.

[039] Para a produção de L-prolina, pode ser vantajoso, além de usar as Y—glutamil quinases de acordo com a invenção, que podem não ter sido superexpressas ou amplificadas, amplificar, em particular superexpressar, além das ditas quinases, ao mesmo tempo uma ou mais enzimas de biossíntese de prolina. Preferência é geralmente dada a usar genes endógenos.

[040] “Genes endógenos” ou “seqüências de nucleotídeos endógenas” significam os genes ou seqüências de nucleotídeos e alelos presentes na população de uma espécie.

[041] Nesse contexto, o termo “amplificação” descreve o aumento na atividade intracelular ou concentração de uma ou mais enzimas em um microorganismo, que são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo, aumentar o número de cópias do gene ou genes, usando um promotor forte ou usando um gene ou alelo que codifica uma en- zima ou proteína correspondente com alta atividade e, onde apropriado, combinar essas medidas.

[042] A amplificação, em particular superexpressão, mede aumento da atividade ou concentração da enzima ou proteína correspondente geralmente por pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, com base naquela da proteína selvagem ou na atividade ou concentração da proteína no microorganismo inicial.

[043] Para produzir L-prolina é então possível, além de usar a variante do gene proB de acordo com a invenção, amplificar, em particular superexpressar, um ou mais dos genes selecionados a partir do grupo que consiste em • o gene gdh que codifica para glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.4), • o gene proA que codifica para Y-glutamil-fosfato redutase (EC 1.2.1.41), • o gene proC gene que codifica para pirrolina-5- carboxilato redutase (EC 1.5.1.2), e • o gene ocd gene que codifica para ornitina ciclodesami- nase (EC 4.3.1.12).

[044] Para a produção de L-prolina pode ser ainda mais vantajoso, além de usar mutantes de acordo com a invenção do gene pro-B, ao mesmo tempo atenuar, em particular reduzir a expressão de, um ou mais dos genes endógenos selecionados a partir do grupo que consiste em • o gene ilvA que codifica para treonina desaminase (EC 4.2.1.16), • o gene putA que codifica para prolina desidroge- nase/pirrolina-5-carboxilato desidrogenase (EC 1.5.99.8), • o gene sucA que codifica para 2-cetoglutarato desidro- genase (EC 1.2.4.2), • o gene sucB que codifica para diidrolipoamida succinil- transferase (EC 2.3.1.61), e • o gene argD que codifica para acetilornitina aminotransferase (EC 2.6.1.11).

[045] Em relação a isso, o termo “atenuação” descreve a redução ou eliminação da atividade intracelular ou concentração de uma ou mais enzimas ou proteínas que são codificadas pelo DNA correspondente em um microorganismo, por exemplo, pelo uso de um promotor fraco ou uso de um gene ou alelo que codifica uma enzima correspondente com baixa atividade ou inativar o gene ou proteína ou enzima correspondente e, onde apropriado, combinar essas medidas.

[046] Atenuação pode ser alcançada pela redução ou eliminação tanto da expressão dos genes ou das propriedades catalíticas ou regu- latórias das proteínas enzimas. Ambas as medidas podem ser combinadas, onde apropriado.

[047] Expressão gênica pode ser reduzida por um processo de cultivo apropriado ou por modificação genética (mutação) das estruturas de sinal de expressão gênica. Exemplos de estruturas de sinal de expressão gênica são genes repressores, genes ativadores, operadores, promotores, atenuadores, sítios de ligação de ribossomos, o có- don inicial e terminadores. Informação sobre isso pode ser encontrada pelo perito, por exemplo, no pedido de patente WO 96/15246, em Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988)), em Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3584-3590 (1998), em Patek et al., (Microbiology 142: 1297-309 (1996) e Journal of Bio-technology 104: 311-323 (2003)) e em livros-texto conhecidos de genética e biologia molecular tais como, por exemplo o livro texto por Knippers (,,Molekulare Genetik”, 6a edição, Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995) ou aquele por Winnacker (,,Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990). Um exemplo de regulação específica da expressão gênica é a clonagem do gene a ser atenuado para ficar sob o controle de um promoter induzível pela adição de quantidades medidas de IPTG (isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeo), tal como, por exemplo, o promotor trc ou o promoter tac. Vetores úteis aqui são, por exemplo, o vetor de expressão de Escherichia coli pXK99E (WO0226787; depositado de acordo com o o Tratado de Budapeste em 31 de julho de 2001, em DH5alpha/pXK99E como DSM14440 com o Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha)) ou pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemanha (1997)), que permitem que o gene clonado seja expresso de uma forma dependente de IPTG em Corynebacterium glutamicum.

[048] Esse método foi empregado, por exemplo na patente WO02 /26787 para expressão regulada do gene deaD pela integração do vetor pXK99EdeaD no genoma de Corynebacterium glutamicum, e por Simic et al., (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para expressão regulada do gene glyA pela integração do vetor pKl8mobglyA' em Corynebacterium glutamicum.

[049] Outro método de reduzir especificamente a expressão gê- nica é a técnica antisenso que envolve introduzir nas células alvo pequenos oligoribonucletídeos ou oligodesoxirribonucletídeos ou vetores para sintetizar RNA antisenso mais longo. Lá, o RNA antisenso pode se ligar a seções complementares de mRNAs específicos e reduzir sua estabilidade ou bloquear a traduzibilidade. Um exemplo disso pode ser encontrado pelo versado na técnica em Srivastava et al., (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 - 4371).

[050] Mutações que resultam em uma mudança ou redução nas propriedades catalíticas de proteínas enzimáticas são conhecidas na técnica anterior; exemplos que podem ser mencionados são os estudos por Qiu e Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al., (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) e Mockel (Ph. D. thesis, Berichte des ForsChungszen- trums Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemanha (1994)). Resumos podem ser encontrados em livros texto conhecidos de genética e biologia molecular, por exemplo aquele por Hagemann (Allgemeine Ge- netik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1986).

[051] Mutações que são levadas em consideração são transições, transversões, inserções e deleções. Dependendo do efeito da substituição de aminoácido sobre a atividade da enzima, é feita referência a mutações missense ou mutações nonsense. Uma mutação nonsense leva a pelo menos um códon de parada estando localizado na região codificante do gene e conseqüentemente a tradução sendo terminada prematuramente. Inserções ou deleções de pelo menos um par de base em um gene leva a mutações estruturais como um resultado de que aminoácidos incorretos são incorporados ou a tradução é terminada prematuramente. Deleções de um ou mais códons levam tipicamente a uma perda total de atividade enzimática. Instruções para gerar tais mutações pertencem a arte anterior e podem ser encontradas em livros texto conhecidos de genética e biologia molecular tais como o livro texto por Knippers (“Molekulare Genetik”, 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), aquele por Winnacker (“Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou aquele por Hagemann (“Allgemeine Genetik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

[052] Como um resultado de usar medidas para alcançar atenuação, a atividade ou concentração da proteína resultante é geralmente diminuída de 0 a 75%, de 0 a 50%, de 0 a 25%, de 0 a 10%, de 0 a 5% ou de 0 a 1%, da atividade ou concentração da proteína selvagem ou da atividade ou concentração da proteína no microorganismo inicial.

[053] Os microorganismos preparados de acordo com a invenção, que são da mesma forma um assunto da presente invenção, podem ser cultivados continuamente ou descontinuamente, em um processo batelada ou processo batelada-alimentada ou um processo ba- telada-alimentada repetida, para o fim de produzir L-prolina. Um resumo de métodos de cultivo conhecidos é descrito no livro texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

[054] O meio de cultura a ser usado deve satisfazer adequadamente as necessidades das cepas em particular. Descrições do meio para cultivar vários microorganismos são dados no manual “Manual of Methods for General Bacteriology” publicado pela American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).

[055] A fonte de carbono empregada pode ser açúcares e carboidratos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, molasses, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim, óleo de coco, ácidos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoléico, alcoóis, tais como por exemplo, glicerol e eta- nol, alcoóis de açúcares, tais como, por exemplo, ribitol ou manitol e ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou como misturas.

[056] A fonte de nitrogênio empregada pode ser compostos orgânicos que contem nitrogênio tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de malte, líquido de infusão de milho, farinha de soja e uréia, ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como misturas.

[057] A fonte de fósforo empregada pode ser ácido fosfórico, fosfato de diidrogênio de potássio ou fosfato de hidrogênio dipotásico ou os sais que contém sódio correspondentes. O meio de cultura deve ainda conter sais de metais, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para crescimento. Finalmente, substâncias de crescimento essenciais tais como aminoácidos e vitaminas podem ser usadas além das substâncias acima mencionadas. Além disso, precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. As substâncias mencionadas podem ser adicionadas ao meio de cultura na forma de mistura de uma só vez ou adicionadas de uma maneira adequada durante a cultura.

[058] Compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônio ou amônia aquosa, ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico são empregados de uma maneira adequada para controlar o pH da cultura. Também é possível usar an- tiespumantes tais como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácido graxo, para controlar formação de espuma. Substâncias adequadas que agem seletivamente, tais como antibióticos, por exemplo, podem ser adicionadas ao meio a fim de manter a estabilidade de plasmídeos. A fim de manter condições aeróbicas, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio tais como ar, por exemplo, são passadas na cultura. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C, e preferivelmente de 25°C a 40°C. A cultura é continuada até que um máximo de L-prolina tenha se formado ou até que o rendimento ou produtividade tenha atingido um nível ótimo desejado. Esse objetivo é normalmente alcançado dentro de 10 horas a 160 horas.

[059] Métodos para determinar L-prolina são divulgados na técnica anterior. A análise pode, por exemplo ocorrer por meio de cromato- grafia de troca de ânions, seguida por derivatização de ninhidrin e detecção em um comprimento de onda apropriado, como descrito em Spackman et al., (Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190).

[060] Conseqüentemente outra modalidade da presente invenção constitui um processo para produzir L-prolina por a) fermentar organismos hospedeiros que expressam ou superexpressam pelo menos uma das seqüências de nucleotídeos de acordo com a invenção e b) isolar ou coletar L-prolina, onde apropriado com componentes do caldo de fermentação e/ou a biomassa. Preferência é dada para empregar um processo para produzir L- prolina, que compreende as seguintes etapas: a) fermentar bactéria corineforme que expressa ou supe- rexpressa pelo menos uma das seqüências de nucleotídeos de acordo com a invenção, b) concentrar L-prolina no caldo de fermentação ou nas células da bactéria corineforme, c) isolar ou coletar L-prolina do caldo de fermentação, onde apropriado d) com componentes do caldo de fermentação e/ou a biomassa (de > 0 a <100% por peso de biomassa, preferivelmente de 10 a 80% por peso, mais preferivelmente 20-60% por peso).

[061] A L-prolina produzida dessa forma pode ser coletada e isolada e, onde apropriado, purificada, como determinado pelo versado na técnica.

[062] O processo de acordo com a invenção é usado para produção fermentativa de L-prolina.

[063] O termo “posição comparável” significa de acordo com a invenção uma posição que, pela comparação da seqüência inicial com a seqüência comparativa com aplicação de um programa de compara- ção de seqüência (BLAST, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 40310) na posição contemplada da seqüência inicial, fornece uma posição de aminoácido na seqüência comparativa que difere da posição a ser comparada por não mais do que +-5, mais preferivelmente +-4, ainda preferivelmente +-3, ainda mais preferivelmente +-2, o mais preferivelmente +-1, e especialmente zero, posições.

[064] Instruções com relação a hibridização podem ser encontradas pelo versado na técnica entre outros lugares, no manual “The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl et al., (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255- 260 (1991)). A hibridização é realizada sob condições severas, isto é apenas híbridos nos quais a investigação, por exemplo a seqüência de nucleotídeo complementar a SEQ ID NO: 3, e a seqüência alvo, isto é os polinucleotídeos tratados com a sonda, são pelo menos 70% idênticos, são formados. A estrin- gência da hibridização, incluindo aquela das etapas de lavagem, é conhecida como sendo influenciada ou determinada pela variação da composição do tampão, da temperatura e da concentração de sal. A reação de hibridização é geralmente realizada em severidade relativamente baixa em comparação com as etapas de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

[065] Por exemplo um tampão correspondendo a tampão SSC 5X em uma temperatura de aprox. 50°C - 68°C pode ser usado para a reação de hibridização. Nesse caso, sondas também podem hibridizar com polinucleotídeos que são menos do que 70% idênticos à seqüên- cia da investigação. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições estringentes. Isso pode ser alcançado, por exemplo, pela diminuição da concentração de sal para SSC 2x, e onde apropriado, subseqüentemente para SSC 0,5x (The DIG System User ' s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha, 1995), com a temperatura sendo ajustada para aprox. 50°C - 68°C, aprox. 52 °C - 68 °C, aprox. 54 °C - 68 °C, aprox. 56 °C - 68 °C, aprox. 58 °C - 68 °C, aprox. 60 °C - 68 °C, aprox. 62 °C C - 68 °C, aprox. 64 °C - 68 °C, aprox. 66 °C - 68 °C. Preferência é dada para realizar as etapas de lavagem em temperaturas de aprox. 62 °C - 68 °C, particularmente preferivelmente aprox. 64 °C - 68 °C ou aprox. 66 °C - 68 °C. É possível, onde apropriado, diminuir a concentração de sal para uma concentração correspondente a SSC 0,2x ou SSC 0,1x. Pelo aumento gradual da temperatura de hibridização nas etapas de aprox. 1 - 2 °C de 50 °C a 68 °C, é possível isolar fragmentos de polinucleotí- deos que tem pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% a 95% ou pelo menos 96% a 98% ou pelo menos 99% de identi-dade com a seqüência da sonda empregada. Instruções adicionais com relação a hibridização são comercialmente disponíveis na forma de “kits” (por exemplo DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, No. de Catálogo 1603558).

[066] De acordo com a invenção, os polinucleotídeos reivindicados (seqüências de aminoácidos) e as seqüências de ácido nucléico também compreendem aquelas seqüências que tem uma homologia (ao nível de aminoácido) e, respectivamente, identidade (ao nível do ácido nucléico, excluindo degeneração natural) de mais do que 70%, preferivelmente 80%, mais preferivelmente 85% (com relação a se- qüência de ácido nucléico) ou 90% (também com relação a polipeptí- deos), preferivelmente mais do que 91%, 92%, 93% ou 94%, mais preferivelmente mais do que 95% ou 96% e particularmente preferivelmente mais do que 97%, 98% ou 99% (com relação a ambos os tipos de seqüências) a quaisquer dessas seqüências, contanto que a ação ou propósito de tal seqüência seja mantido. O termo “homologia” (ou identidade), como aqui usado, pode ser definido pela equação H (%) = [1 - V/X] x 100, onde H é homologia, X é o número total de nucleoba- ses/aminoácidos da seqüência comparativa e V é o número de nu- cleobases /aminoácidos diferentes da seqüência a ser considerada, com base na seqüência comparativa. Em qualquer caso, o termo se- qüências de ácido nucléico que codificam para polipeptídeos inclui quaisquer seqüências que parecem possíveis de acordo com a degeneração do código genético.

[067] A porcentagem de identidade às seqüências de aminoáci- dos indicadas na presente especificação pelos números de SEQ ID pode ser facilmente determinada pelo versado na técnica usando métodos conhecidos na técnica anterior. Um programa adequado que pode ser empregado de acordo com a invenção é BLASTP (Altschul et al., 1997. Gapped BLAST e PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402.). A seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA. Preferência é dada para a seqüência de ácido nucléico sendo uma molécula de DNA ou uma mo-lécula de RNA. De acordo com a invenção, a molécula de DNA pode ainda ser uma molécula de DNA genômico ou isolada. A invenção ainda abrange modalidades nas quais a molécula de DNA é uma molécula de PNA ou outro derivado de uma molécula de DNA.

[068] Os microorganismos mencionados nesse pedido, que estão indicados por um número DSMZ, podem ser obtidos de Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 4, Brunswick (Alemanha).

Claims (18)

1. Polinucleotídeos, caracterizados pelo fato de que consistem em uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam polipeptídeos que apresentam sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, em que o códon na posição 149 é GAT ou GAC, em que o polipeptídeo apresenta atividade y-glutamil quinase.

2. Polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizados pelo fato de que consistem na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3.

3. Polinucleotídeos, caracterizados pelo fato de que consistem na sequência de nucleotídeos entre as posições 432 a 462 da SEQ ID NO: 1 ou 3, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos.

4. Polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 3, ca-racterizados pelo fato de que consistem na sequência de nucleotídeos entre as posições 330 a 567 da SEQ ID NO: 1 ou 3, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um po- linucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Polipeptídeos, caracterizados pelo fato de que apresentam sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo possui atividade y-Glutamil quinase, em que na posição 149 da sequência de aminoácidos, a glicina é substituída pelo ácido L- aspártico.

7. Polipeptídeos, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que consistem na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4.

8. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de que é transformado com o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou o vetor como definido na reivindicação 5, em que o hospedeiro é escolhido a partir do grupo que compreende leveduras, E. coli, B. subtilis, bactérias corineformes.

9. Hospedeiro, de acordo com a reivindicação 8, caracteri-zado pelo fato de que o referido polinucleotídeo está contido no cro-mossomo.

10. Hospedeio de acordo com a reivindicação 8, caracteriza-do pelo fato de que os polinucleotídeos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 são superexpressos.

11. Hospedeiro, de acordo com a reivindicação 10, caracte-rizado pelo fato de que a superexpressão é alcançada aumentando o número de cópias dos referidos polinucleotídeos.

12. Hospedeiro, de acordo com a reivindicação 11, caracteri-zado pelo fato de que o referido hospedeiro é uma bactéria corineforma.

13. Hospedeiro, de acordo com a reivindicação 10, carac-terizado pelo fato de que o referido hospedeiro é Corynebacterium glutamicum.

14. Processo para produzir L-prolina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fermentar organismos hospedeiros que expressam ou supe- rexpressam as sequências de nucleotídeos, como definidas em qualquer uma das reivindicações 8 a 13, b) enriquecer o meio ou as bactérias com o referido L- aminoácido, e c) isolar ou coletar L-prolina, onde apropriado, com compo-nentes do caldo de fermentação e/ou da biomassa.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracteri-zado pelo fato de que o hospedeiro é fermentado compreendendo um ou mais genes superexpressos escolhidos a partir do grupo que compreende: a) o gene gdh que codifica a glutamato desidrogenase b) o gene proA que codifica a y-glutamil-fosfato redutase c) o gene proC que codifica a pirolina-5-carboxilato redutase e d) o gene ocd que codifica a ornitina ciclodeaminase.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o procarionte/hospedeiro é fermentado compreendendo um ou mais genes atenuados escolhidos a partir do grupo que compreende: a) o gene ilvA que codifica a treonina desaminase b) o gene putA da desidrogenase de pralina/prolina-5- carboxilato desidrogenase c) o gene sucA que codifica a 2-cetoglutarato desidrogenase d) o gene sucB que codifica a di-hidrolipoamida succinil- transferase, e e) o gene argD que codifica a acetilornitina aminotransferase

17. Processo, de acordo com as reivindicações 14 a 16, ca-racterizado pelo fato de que as bactérias corineform são fermentadas.

18. Processo de acordo com as reivindicações 14 a 16, ca-racterizado pelo fato de que E. coli é fermentada.