KR20070091663A - 코리네폼 박테리아로부터의 ｐｒｏｂ 유전자의 돌연변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 γ-글루타밀 키나제를 코딩하는, 코리네폼 박테리아로부터의 proB 유전자의 돌연변이 변이체, 및 이러한 돌연변이를 함유하는 박테리아를 사용하는 L-프롤린의 발효성 제조 방법에 관한 것이다.

γ-글루타밀 키나제, 코리네폼 박테리아, proB 유전자, L-프롤린

Description

코리네폼 박테리아로부터의 ＰＲＯＢ 유전자의 돌연변이체{MUTANT OF THE PROB GENE FROM CORYNEFORM BACTERIA}

본 발명은 γ-글루타밀 키나제 활성이 있는 효소에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 아미노산 서열의 위치 149 또는 필적하는 위치에서 글리신 이외의 단백질성(proteinogenic) 아미노산을 갖는 상기 효소를 특징으로 한다.

γ-글루타밀 키나제 활성이 있는 효소는 L-프롤린의 발효성 제조에서 바람직하게 사용된다. 글루타메이트에서 출발하는 L-프롤린 생합성 경로는 하기 반응식 1에 나타낸다.

예를 들어, 코리네폼(coryneform) 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 발효시킴으로써 아미노산을 생산할 수 있 다는 것이 공지되어 있다. 이 생산 공정은 매우 중요하기 때문에, 이를 개선하려는 노력이 계속 이루어지고 있다. 절차적인 개선은 예를 들어, 교반 또는 산소 공급과 같은 발효 기술에 관련된 수단, 또는 예컨대 발효 동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태로의 워크업(working-up), 또는 미생물 자체의 고유의 성능 성질에 관한 것일 수 있다.

이러한 미생물의 성능 성질은 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선택의 방법을 적용함으로써 개선된다. 그 결과, 항-대사산물에 대해 내성이거나 조절에 중요한 대사산물에 대해 영양요구성이고, 아미노산을 생산하는 균주가 생성된다. 공지된 항-대사산물은 프롤린 유사체인 3,4-데히드로-DL-프롤린 (DHP)이다.

수년 동안, 개별적인 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 대한 효과를 연구함으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키기 위해 재조합 DNA 방법이 또한 사용되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 특히 EP-A-1108790에 기술되어 있고, 또한 등록 번호 NC_003450.2 및 BX927148.1 내지 BX927157.1 하에 국립 의학 라이브러리(National Library of Medicine, 미국 메릴랜드주, 베테스다)의 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 데이타베이스에 기탁되었다.

슬리터 등(Sleator et al.)은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) proB-Gen을 돌연변이시킴으로써, 프롤린 생합성에서의 과잉생산을 야기하는 가능성에 대해 보고하였다(Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 4560- 5). 상기 문헌에 특정되고 성공적인 것으로 언급된 돌연변이는, V121I, A144V 및 E146K 돌연변이를 갖는 γ-글루타밀 키나제를 코딩하는 proB 유전자와 관련된다. 또한, 이러한 돌연변이가 발생하는 영역은 다른 생물체에서 유리한 돌연변이용 표적 영역으로서 또한 확인된 영역에 매우 잘 상응한다는 사실이 언급된다.

따라서, 본 발명의 목적은 추가적으로 돌연변이되고, 적합한 경우에는 개선된, γ-글루타밀 키나제의 단백질 변이체를 이용가능하게 하는 것이고, 이는 L-프롤린의 발효성 제조를 위한 기술 공정에서 유리하게 사용될 수 있다.

자세하게 상술되지 않았지만, 종래 기술로부터 명백한 방식으로 비롯되는 이러한 목적 및 또다른 목적은, 청구항 1의 γ-글루타밀 키나제를 제시함으로써 달성된다. 청구항 2는 바람직한 이러한 종류의 효소에 초점을 맞춘다. 청구항 3 및 4는 각각 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이고, 청구항 5는 상기 언급된 뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합적으로 제조된 비히클에 초점을 맞춘다. 마지막으로, 청구항 6은 언급된 효소를 사용하는 본 발명에 따른 L-프롤린의 제조 방법에 관한 것이다.

아미노산 위치 149 또는 필적하는 위치에서 글리신 이외의 단백질성 아미노산을 갖는 γ-글루타밀 키나제 (proB 유전자의 산물)를 제공함으로써, 기재된 목적이, 중요함에도 불구하고, 특히 의외로 달성된다. 야생형 효소와 비교하여, 적합한 돌연변이가 있는 γ-글루타밀 키나제는 발효성 제조 공정에서 개선된 방식으로 L-프롤린을 생산하는 것을 돕는다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여, 생성물 농도 (부피 당 생성물), 생성물 수율 (소비된 탄소 공급원 당 형성된 생성물) 및 생성물 형성 (부피 및 시간 당 형성된 생성물)의 군으로부터 선택된 1가지 이상의 파라메터 또는 기타 공정 파라메터 및 이들의 조합과 관련하여 숙주 생물 또는 발효 공정의 성능을, 출발 균주 또는 어버이 균주 또는 상기 효소를 사용하는 발효 공정을 기초로, 적어도 0.5％, 적어도 1％, 적어도 1.5％ 또는 적어도 2％ 개선시키는 것이 가능하다.

Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys 또는 Phe로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-아미노산이 본 발명에 따라 정의되는 바와 같은 아미노산 위치 또는 필적하는 위치에 존재하는 γ-글루타밀 키나제를 제공하는 것이 바람직하다. (글리신을 포함하여, 언급된 아미노산들은 당업계에서 단백질성 아미노산으로 또한 지칭된다.) 상기 효소 내의 위치 149에서 글리신이 L-아스파르트산으로 치환 (G149D)되는 것이 매우 특히 바람직하다. 아미노산 369±40개, 바람직하게는 ±20개, 더욱 바람직하게는 ±10개, 더욱 특히 바람직하게는 ±5개 또는 ±3개 아미노산 길이인, 상기 상술된 바와 같은 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제가 가장 바람직하다. 아미노펩티다제(aminopeptidase)로 칭해지는, 숙주의 내인성 효소는 형성된 단백질로부터 N-말단 아미노산 메티오닌을 절단할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 단백질의 C 말단으로부터 1개 또는 2개 또는 3개 이하의 아미노산을 절단하는 것은 효소 활성을 사소하게만 손상시키는 것으로 또한 공지되어 있다. 그러나, 그에 결합된 특정 융합 단백질로 인해 효소의 길이가 증가할 수 있다 (하기 참조).

본 발명은 위치 149 또는 필적하는 위치에서 글리신이 또다른 아미노산, 특 히 임의의 바람직한 언급된 아미노산으로 치환된, 서열 2, 바람직하게는 서열 4의 아미노산 서열, 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 또한 포함한다. 따라서, 본 발명은 서열 2, 바람직하게는 서열 4와 비교하여 아미노산 수준에서 상기 언급된 정도의 동일성을 갖는 효소를 또한 포함한다. 이러한 효소들은 천연 공급원으로부터 또한 유래될 수 있다. 별법적으로, 이들은 당업자가 효소 활성을 유지되거나 또는 실질적으로 유지되는 것으로 예측할 수 있는 방식으로 재조합 DNA 기술에 의해 변형되었을 수 있다 (예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", 2nd edition 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, Ausubel et al. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY 2001] 참조). 따라서, 활성 부위에 존재하지 않고 "동일한 종류"의 아미노산으로의 치환이, 명백하게, 실질적으로 변화된 3차원 구조를 초래하지 않을 것으로 예상되는 아미노산이 "동일한 종류"의 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명에 따른 효소의 생물학적 또는 효소 기능에, 또는 효소 활성에 (실질적인) 영향을 미치지 않으면서, 예컨대 비-극성 측쇄를 갖는 특정 아미노산들 (동일한 종류의 아미노산들)이 치환될 수 있고, 예를 들어, 이소류신이 발린으로 치환될 수 있는 것으로 예상될 수 있다. 당업자는, 그의 지식을 기초로, 다른 유형의 아미노산의 치환에 대해서도 상응하는 결론에 도달할 수 있다 (예를 들어, 염기성 아미노산의 또다른 염기성 아미노산으로의 대체 또는 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산의 이러한 군으로부터의 또다른 아미노산으로의 대체).

서열 2, 바람직하게는 서열 4의 위치 145 내지 154, 또는 필적하는 위치, 더 욱 바람직하게는 위치 130 내지 169, 매우 특히 바람직하게는 위치 110 내지 189에 상응하는 아미노산 서열을 적어도 갖는 γ-글루타밀 키나제가 또한 바람직하고, γ-글루타밀 키나제 아미노산 서열의 길이는 상기 지시된 숫자에 상응할 수 있다.

또한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 효소는 1개 이상의 이종형 아미노산 절편을 추가적으로 포함하고, 이러한 폴리펩티드는 이에 의해 융합 단백질로 규명된다. 본 발명에 따른 융합 단백질의 이종형 성분의 예는, 본 발명에 따른 융합 단백질의 정제에서 사용될 수 있는 태그(tag) (예를 들어, His 태그 또는 Flag 태그)일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 이종형 성분은 별도의 효소 활성을 가질 수 있다. 이같은 경우에, 2개의 효소성 성분은 성분들의 기능성을 확실히 하기 위해 아미노산 6-10개 길이의 링커(linker), 예컨대 가요성 글리신 또는 글리신-세린 링커에 의해 연결되는 것이 바람직하다. 본원에서 사용된 용어 "이종형"은 한편으로는 융합 단백질의 성분들이 천연적으로는 공유 결합된 형태로 함께 발생하지 않는다는 것, 그리고 또다른 한편으로는 성분들이 상이한 종으로부터 유도된다는 것을 의미할 수 있다. 융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 일반적으로 제조된다 ([Sambrook et al., 상기 문헌] 참조).

추가적인 실시양태에서, 본 발명은 상기 상술된 바와 같은 본 발명에 따른 γ- 글루타밀 키나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (핵산 서열)에 관한 것이다. 따라서, 또한 본 발명은 효소 γ- 글루타밀 키나제를 코딩하는 복제가능한 뉴클레오티드 서열에 관한 것이고, 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 상응하는 아미노산 서열은 위치 149 또는 필적하는 위치에서 글리신 이외의 임의의 단백질성 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 γ-글루타밀 키나제를 코딩하고, 상응하는 코딩되는 아미노산 서열은 위치 149 또는 필적하는 위치에서 Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys 또는 Phe로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다. 위치 149 또는 필적하는 위치에서 L-아스파르트산을 갖는 γ-글루타밀 키나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 매우 특히 바람직하다.

또한, 본 발명은 위치 149 또는 필적하는 위치에서 본 발명에 따른 아미노산 치환을 갖는 γ-글루타밀 키나제를 코딩하는 복제가능한 핵산 서열에 관한 것으로, 이러한 서열들은

a) 서열 1, 바람직하게는 서열 3과 70％ 이상 동일하거나,

b) 369±40 개의 아미노산 길이인, 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제를 코딩하거나,

c) 적어도 위치 145 내지 154 또는 필적하는 위치에서 서열 2, 바람직하게는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제를 코딩하거나,

d) 적어도 위치 145 내지 154 또는 필적하는 위치에서 서열 2, 바람직하게는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제를 코딩하고, 엄격한 실험 조건 하에 서열 1 또는 서열 3에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하거나,

f) 본 발명에 따른 효소인 γ-글루타밀 키나제를 코딩하고, 염기 서열이 서 열 3에 나타낸 바와 같이 위치 446에서 아데닌을 포함하는, 복제가능한 뉴클레오티드 서열이다.

청구항의 범주는 길이가 아미노산 잔기 369±20개, 더욱 바람직하게는 ±10개, 가장 바람직하게는 ±5 또는 ±3개인 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제를 코딩하는 복제가능한 핵산 서열을 또한 포함한다.

또한, 본 발명은 서열 1, 바람직하게는 서열 3에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 뉴클레오티드 수준에서 이러한 서열과 70％ 이상 동일한 서열들을 또한 포함한다. 서열 3의 뉴클레오티드 서열과 70％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열의 예가 서열 5에 제시된다. 서열 6 은 서열 5에 의해 코딩되는, γ-글루타밀 키나제의 아미노산 서열을 나타낸다.

또한 본 발명은 서열 2, 바람직하게는 서열 4의 위치 130-169 또는 필적하는 위치, 더욱 특히 바람직하게는 위치 110 내지 189에 상응하는 아미노산 서열을 적어도 포함하는 것이 바람직한 γ-글루타밀 키나제를 코딩하고, 이는 엄격한 실험 조건 하에 서열 1 또는 서열 3에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는, 복제가능한 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 용어 "상보적"은 본 발명에 따른 핵산 분자의 전체 영역에 걸쳐 갭(gap) 없이 상보성이 미치는 것을 의미한다. 다시 말하면, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 서열의 전체 영역에 걸쳐, 즉, 묘사된 5' 말단에서 묘사된 3' 말단까지, 특히 코딩 영역(cds)에서 상보성이 100％에 미치는 것이 바람직하다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 상보성은 바람직하게는 효소 활성의 활성 부위를 코딩하지 않는 19개 이상, 바람직하게는 21개 이상의 연 속적인 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 미친다.

코리네폼 박테리아, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteri um glutamicum)으로부터 유래된 핵산 서열이 바람직하다. 종의 집단에 존재하는 유전자 또는 대립유전자(allele)의 핵산 서열 또한, 당업계에서 내인성 유전자 또는 대립유전자로 지칭된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 (rec) 비히클에 관한 것이다. 적절한 비히클은 이러한 목적을 위해 당업자에 의해 고려되는 임의의 비히클, 특히 벡터 및 숙주 생물이다.

이와 관련하여 언급될 수 있는 숙주 생물의 예는 효모, 예컨대 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polyinorpha), 피치아(Pichia) 종, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 원핵생물 예컨대 대장균(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네폼 박테리아, 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 진핵생물, 예컨대 포유류 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포이다. 이러한 생물들은, 적합한 경우에 본 발명의 수단 이전에 이미, 세포 또는 그 주변의 발효 배지 내에 L-프롤린을 축적한다. 따라서, 이러한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 숙주는 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 본 발명에 따른 벡터 (하기 참조)로 형질전환 또는 형질감염되었거나, 이들을 접합(conjugation)에 의해 제공하는 재조합 세포이다(용어 "형질전환", "형질감염(transfection)" 및 "접합(conjugation)"은 본 발명에 따라 동의어로 사용됨). 형질전환 및 형질감염은 각각 공지된 방법에 따라, 예를 들어 인산칼슘 공침전, 리포 펙션(lipofection), 전기천공, 입자 충격(bombardment) 또는 바이러스 감염에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 재조합 핵산을 염색체 내에 통합된 형태로, 또는 염색체 외부에 함유할 수 있다. 다시 말하면, 형질감염/형질전환은 안정적이거나 또는 일시적인 것일 수 있다. 클로닝 방법은 당업자에게 주지되어 있다([Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]). 재조합 제조 및 돌연변이유발 방법을 위해 대장균 균주를 사용할 수 있고, 특히 하기의 것들이 포함된다: 대장균 XL1 블루(Blue), NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP10, HB101, BL21 코돈 플러스, BL21 (DE3) 코돈 플러스, BL21, BL21 (DE3), MM294. 숙주 생물 내로 본 발명에 따른 핵산을 갖는 유전자 구축물을 클로닝하는데 특히 사용되는 플라스미드 또한 당업자에게 공지되어 있다 (PCT/EP03/07148 참조; 하기 참조). 특히 언급될 수 있는 코리네박테리움 속의 숙주는, 당업계에 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종이다. 코리네박테리움 속의 공지된 야생형 균주는 하기와 같다:

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC1303

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870

코리네박테리움 에피지엔스(Corynebacterium effiziens) DSM 44549

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965

코리네박테리움 써모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020.

이러한 군의 박테리아의 균주의 분류학적인 분류에 관한 정보는 특히 [Kampfer and Kroppenstedt, Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)] 및 US-A-5,250,434에서 확인할 수 있다. 수년 동안 ([Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260 (1991)]), 종명(種名)이 "브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)", "브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)" 및 "브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)"인 코리네폼 박테리아는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종으로 분류되었다. 종명이 "코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)"인 코리네폼 박테리아 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종에 속한다.

코리네폼 박테리아의 L-프롤린-생산 균주의 예는 하기의 균주들이고, 이들은 모두 US 4,224,409 및 US 4,444,885에 기술되어 있다:

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) NRRL B-11421,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) NRRL B-11422,

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) NRRL B-11423,

마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) NRRL B-11424,

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21157,

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21158,

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21159,

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21355,

코리네박테리움 아세토필룸(Corynebacterium acetophilum) FERM-P 4045,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) FERM-P 4962,

아르트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus) FERM-P 4963, 및

마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) FERM-P 4964.

본 발명에 따른 벡터에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 적절한 숙주 세포 내에서 전사될 수 있도록, 그리고 적합한 경우에 번역될 수 있도록 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 발현 제어 서열은 일반적으로 프로모터를 포함하고, 적합한 경우에는 오퍼레이터 또는 인핸서와 같은 조절 서열을 추가로 포함한다. 번역 개시 서열이 존재하는 것도 또한 가능하다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 대한 적절한 발현 제어 서열은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조). 본 발명에 따른 재조합 벡터는, 복제 원점(origin of replication) 및 선별 마커 유전자와 같은 일반적인 요소를 또한 추가로 포함할 수 있다. 적절한 재조합 벡터의 예는 플라스미드, 코스미드, 파지, 또는 바이러스이다 (예를 들어, [Sambrook et al., 상기문헌] 참조).

적절한 플라스미드는 원칙적으로 당업자가 이러한 목적으로 이용가능한 임의의 플라스미드이다. 이같은 플라스미드는 예를 들어, 스터디어(Studier) 및 공동 연구가들의 논문 ([Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89]) 또는 노바젠(Novagen), 프로메가(Promega), 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 클론테크(Clontech) 또는 기브코 BRL(Gibco BRL)의 브로셔에서 확인할 수 있다. 추가적인 바람직한 플라스미드 및 벡터는 [Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford]; [Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham]; [Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7]; [Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에서 확인할 수 있다.

매우 특히 바람직한 방식으로 숙주 생물 내로 계획된 핵산 서열을 갖는 유전자 구축물을 클로닝하는데 사용될 수 있는 플라스미드는 하기의 것들이거나 또는 하기의 것들을 기초로 한다: pUC18/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pCR (Invitrogen), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK- 233-3 (Stratagene) 또는 pET (Novagen). 또다른 바람직한 플라스미드는 pBR322 (DSM3879), pACYCl84 (DSM4439) 및 pSC101 (DSM6202)이고, 이들은 모두 <DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Brunswick, Germany)>로부터 수득할 수 있다. 바람직한 프로모터의 예는 T7 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, trp 프로모터, rha 프로모터 및 ara 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제 또는 이를 코딩하는 핵산은 코리네폼 박테리아, 바람직하게는 코리네박테리움 속, 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 종에서 과발현된다.

과발현은 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제의 세포내 농도 또는 활성의 증가를 의미한다.

과발현 수단은 상응하는 단백질의 활성 또는 농도를, 출발 미생물 내의 단백질의 활성 또는 농도를 기초로 적어도 10％, 25％, 50％, 75％, 100％, 150％, 200％, 300％, 400％ 또는 500％에서 최대 1000％ 또는 2000％까지 증가시킨다.

과발현은 본 발명에 따른 유전자 또는 대립유전자의 카피수를 1개 이상 증가시킴으로써 또는 구조 유전자의 상류에 위치한 리보좀-결합 부위 또는 프로모터 영역 및 조절 영역을 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 구조 유전자의 상류에 혼입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 또한, 유도성 프로모터는 발효성 L-프롤린 제조 동안 발현을 증가시키는 것을 가능하게 한다. mRNA 수명을 연장시 키는 수단 또한 발현을 개선시킨다. 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성이 또한 증폭된다. 유전자 또는 유전자 구축물은 상이한 카피 수로 플라스미드 내에 또는 삽입 및 증폭된 형태로 염색체 내에 존재할 수 있다. 별법적으로, 배지 조성 및 배양 공정을 변화시킴으로써 당해 유전자가 또한 과발현될 수 있다.

코리네폼 박테리아 내에서 복제되는 플라스미드가 본 발명에 따른 proB 대립유전자의 카피 수를 증가시키는데 유용하다. 수많은 공지된 플라스미드 벡터, 예컨대, pZ1 ([Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]), pEKEx1 ([Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)]) 또는 pHS2-1 ([Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)])이 잠재(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기초로 한다. 예를 들어, pCG4 (US-A 4,489,160), 또는 pNG2 ([Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)]) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891)과 같은 또다른 플라스미드 벡터가 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 플라스미드 벡터에 대한 개관은 [Tauch et al., Journal of Biotechnology 104(1-3), 27-40 (2003)]에서 확인할 수 있다.

hom-thrB-오페론의 중복 및 증폭의 관점에서 [Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 예를 들어 기술된 염색체 유전자 증폭 방법을 적용함으로써, 카피 수를 증가시키는 것이 또한 가능하다. 이러한 방법은 숙주(전형적으로 대장균) 내에서 복제될 수 있지만 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터 내로, 완전한 유전자 또는 대립유전자를 클로닝하는 것을 수반한다. 적절한 벡터의 예는 pSUP301 ([Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)]), pK18mob 또는 pKl9mob ([Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO ([Shuman, Journal of Biological Chemistry 269:32678-84 (1994)]; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Netherlands; [Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)]), pEM1 ([Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173:4510-4516 (1991)]) 또는 pBGS9 ([Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)])이다. 이어서, 증폭될 유전자 또는 대립유전자를 함유하는 플라스미드 벡터가 접합 또는 형질전환에 의해 원하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 전달된다. 접합 방법은 [Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 예를 들어 기술되어 있다. 형질전환 방법은, 예를 들어, [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], [Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)] 및 [Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어 있다. "교차(cross over)" 이벤트에 의한 동종 재조합 후, 생성된 균주는 당해 유전자 또는 대립유전자의 2개 이상의 카피를 함유한다. 카피 수를 적어도 1개, 2개 또는 3개 증가시키기 위하여, WO 03/014330에 기술된 바와 같은 직렬-증폭 방법, 또는 WO 03/040373에 기술된 바와 같은 원하는 위치에서의 삽입에 의한 증폭 방법을 사용하는 것이 또한 특히 가능하다.

종래 기술에 기술된 돌연변이유발 방법이 위치 149에서의 아미노산 치환을 특징으로 하는, γ-글루타밀 키나제 (예를 들어, 서열 2)에서의 본 발명에 따른 아미노산 치환 및 본 발명에 따른 또다른 proB 돌연변이를 생성시키는데 사용된다. 적절한 돌연변이유발 방법은 당업자가 이러한 목적으로 이용가능한 임의의 방법이다.

돌연변이유발성 물질, 예컨대 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG) 또는 자외선을 사용하는 전통적인 생체내 돌연변이유발 방법이 돌연변이유발에 사용될 수 있다. 이어서, 적합한 경우에, 돌연변이된 세포를 약 0.5 - 1 g/ℓ, 약 1 - 2 g/ℓ 또는 약 2 - 3 g/ℓ 농도의 3,4-데히드로-DL-프롤린을 함유하는 최소 한천에 가할 수 있다. 적합한 경우의 클로닝 프로세스 후, 개별적인 돌연변이체들을 단리하고, proB 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.

히드록실아민 ([Miller, J. H. : A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992]) 또는 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드 ([T. A. Brown: Gentechnologie fur Einsteiger [genetic engineering for beginners], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993]; [Knippers, "Molekulare Genetik" [molecular genetics], 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995]; [Winnacker, "Gene und Klone" [genes and clones], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990]; [Hagemann, "Allgemeine Genetik" [general genetics], Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany, 1986]) 또는 매뉴얼 [Newton and Graham, PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에 기술된 바와 같은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 시험관내 방법을 돌연변이유발에 또한 사용할 수 있다. 특히, 포화 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 시험관내 재조합 방법 및 부위-지정 돌연변이 유발이 포함된다 ([Eigen, M. and Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967-978]; [Chen, K. and Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073-1077]; [Horwitz, M. and Loeb, L. (1986), Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405-7409]; [Dube, D. and L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 28, 5703-5707]; [Stemmer, P.C. (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389-391] 및 [Stemmer, P.C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747-10751]). 시험관내 방법의 사용에는 야생형 균주로부터 단리된 전체 DNA로부터 출발하여 종래 기술에 기술된 proB 유전자를 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 증폭시키는 것, 상기 유전자를 적합한 경우에 적절한 플라스미드 벡터 내로 클로닝하는 것, 및 이어서 DNA를 돌연변이유발 프로세스에 적용시키는 것이 수반된다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 DNA 서열을 증폭시키는 것에 대한 설명은 당 업자가 특히 매뉴얼 [Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 [Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 확인할 수 있다. 동일한 방식으로, [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989]의 주지된 매뉴얼에 예를 들어 기술된 바와 같은 시험관내 돌연변이유발 방법을 또한 사용할 수 있다. 상응하는 방법은, 예를 들어, [Papworth et al., Strategies 9(3), 3-4 (1996)]에 기술된 "QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene (La Jolla, USA))와 같은 "키트"의 형태로 또한 시판된다. 이어서 적절한 proB 돌연변이체를 선별하여 하기 기술된 방법에 의해 연구한다.

L-프롤린의 제조를 위해, 과발현 또는 증폭되었을 수 있거나 또는 과발현 또는 증폭되지 않았을 수 있는 본 발명에 따른 γ-글루타밀 키나제를 사용하는 것에 더하여, 상기 키나제 이외에, 프롤린 생합성의 1가지 이상의 효소를 동시에 증폭시키는 것, 특히 과발현시키는 것이 유리할 수 있다. 내인성 유전자를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

"내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오티드 서열"은 종의 집단 내에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열 및 대립유전자를 의미한다.

이러한 문맥에서, 용어 "증폭"은 예를 들어, 유전자 또는 유전자들의 카피 수를 증가시키는 것, 강력한 프로모터를 사용하는 것, 또는 높은 활성을 갖는 상응하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하는 것, 그리고 적합한 경우 이러한 수단들을 조합하는 것에 의한, 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 미생물 내의 1가지 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성 또는 농도의 증가를 기술한다.

증폭, 특히 과발현 수단은 상응하는 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도를 야생형 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물 내의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 일반적으로 적어도 10％, 25％, 50％, 75％, 100％, 150％, 200％, 300％, 400％ 또는 500％에서 최대 1000％ 또는 2000％까지 증가시킨다.

L-프롤린 제조를 위해, 본 발명에 따른 proB 유전자의 변이체를 사용하는 것에 더하여, 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 1가지 이상의 유전자를 증폭, 특히 과발현시키는 것이 따라서 가능하다:

글루타메이트 탈수소효소 (EC 1.4.1.4)를 코딩하는 gdh 유전자,

γ-글루타밀-포스페이트 환원효소 (EC 1.2.1.41)를 코딩하는 proA 유전자,

피롤린-5-카르복실레이트 환원효소 (EC 1.5.1.2)를 코딩하는 proC 유전자, 및

오르니틴 시클로데아미나제 (EC 4.3.1.12)를 코딩하는 ocd 유전자.

L-프롤린의 제조를 위해, proB 유전자의 본 발명에 따른 돌연변이체를 사용하는 것에 더하여, 동시에 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 1가지 이상의 내인성 유전자의 발현을 약화, 특히 감소시키는 것이 추가로 유리할 수 있다:

트레오닌 데아미나제 (EC 4.2.1.16)를 코딩하는 ilvA 유전자,

프롤린 탈수소효소/피롤린-5-카르복실레이트 탈수소효소 (EC 1.5.99.8)를 코딩하는 putA 유전자,

2-케토글루타레이트 탈수소효소 (EC 1.2.4.2)를 코딩하는 sucA 유전자,

디히드로리포아미드 숙시닐트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.61)를 코딩하는 sucB 유전자, 및

아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.11)를 코딩하는 argD 유전자.

이와 관련하여, 용어 "약화(attenuation)"는, 예를 들어, 약한 프로모터를 사용하는 것 또는 낮은 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하는 것 또는 상응하는 유전자 또는 효소 또는 단백질을 불활성화시키는 것, 그리고 적합한 경우 이러한 수단들을 조합하는 것에 의한 미생물 내의 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 1가지 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성 또는 농도의 감소 또는 제거를 기술한다.

약화는 유전자의 발현 또는 효소 단백질의 촉매적 또는 조절 성질을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다. 적합한 경우 양쪽 수단이 조합될 수 있다.

적절한 배양 공정에 의해 또는 유전자 발현의 신호 구조의 유전자 변형 (돌연변이)에 의해 유전자 발현이 감소될 수 있다. 유전자 발현의 신호 구조의 예는 억제인자 유전자, 활성인자 유전자, 오퍼레이터, 프로모터, 약화인자(attenuator) 리보솜-결합 부위, 개시 코돈 및 종결인자이다. 이에 대한 정보는 당업자가, 예를 들어, 특허 출원 WO 96/15246, [Boyd and Murphy, Journal of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988)], [Voskuil and Chambliss, Nucleic Acids Research 26: 3584-3590 (1998)], [Patek et al., Microbiology 142: 1297-309 (1996)], [Patek et al., Journal of Biotechnology 104: 311-323 (2003)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서, 예를 들어, [Knippers, "Molekulare Genetik", 6^th edition, Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995] 또는 [Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990]에서 확인할 수 있다.

유전자 발현의 특이적 제어의 예는 계량된 양의 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가함으로써 유도될 수 있는 프로모터, 예컨대, trc 프로모터 또는 tac 프로모터의 제어 하에 놓인 약화될 유전자의 클로닝이다. 여기에서 유용한 벡터는, 예를 들어, 대장균 발현 벡터 pXK99E (WO0226787; 부다페스트 조약에 따라 2001년 7월 31일에 <Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Germany)>에 DH5α/pXK99E 내에 DSM14440으로서 기탁됨) 또는 pVWEx2 ([Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Julich, Juel-3397, ISSN 0994-2952, Julich, Germany (1997)])이고, 이들은 클로닝 유전자가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 IPTG-의존적인 방식으로 발현되도록 한다.

이러한 방법은, 예를 들어, 벡터 pXK99EdeaD를 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 내로 통합시키는 것에 의한 deaD 유전자의 조절된 발현을 위해 특허 WO02/26787에서, 그리고, 벡터 pK18mobglyA'을 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 통합시키는 것에 의한 glyA 유전자의 조절된 발현을 위해 [Simic et al., Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)]에서 사용되었다.

유전자 발현을 특이적으로 감소시키는 또다른 방법은 표적 세포 내로 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 더 긴 안티센스 RNA 합성을 위한 벡터를 도입하는 것을 수반하는 안티센스 기술이다. 이때, 안티센스 RNA는 특정 mRNA의 상보적인 절편에 결합하여 이의 안정성을 감소시키거나 번역성을 차단할 수 있다. 이의 예는 당업자가 [Srivastava et al., Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10):4366 - 4371]에서 확인할 수 있다.

효소 단백질의 촉매적 성질에서의 변화 또는 감소를 초래하는 돌연변이는 종래 기술로부터 공지되어 있다; 언급될 수 있는 예는 [Qiu and Goodman., Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)], [Sugimoto et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61:1760-1762 (1997)] 및 [Mockel., Ph. D. thesis, Berichte des ForsChungszentrums Julich, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Germany (1994)]의 연구이다. 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서, 예를 들어 [Hagemann, "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany, 1986]에서 개관을 확인할 수 있다.

고려되는 돌연변이는 전이, 전위, 삽입 및 결실이다. 효소 활성에 대한 아미노산 치환의 효과에 따라, 미스센스(missense) 돌연변이 또는 논센스(nonsense) 돌연변이가 언급된다. 논센스 돌연변이는 1개 이상의 정지 코돈이 유전자의 코딩 영역 내에 위치하게 하고, 따라서 번역이 조숙하게 종결된다. 유전자 내의 1개 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실은 프레임(frame) 이동 돌연변이에 이르고, 그 결과 부정확한 아미노산이 혼입되거나 번역이 조숙하게 종결된다. 1개 이상의 코돈의 결실은 전형적으로 효소 활성의 전체적인 손실에 이른다. 이같은 돌연변이를 생성시키는 것에 대한 설명은 종래 기술에 속하고, 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서 예컨대 [Knippers, "Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995], [Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990] 또는 [Hagemann, "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]에서 확인할 수 있다.

약화를 달성하기 위한 수단을 사용한 결과, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질의 활성 또는 농도 또는 출발 미생물 내의 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75％, 0 내지 50％, 0 내지 25％, 0 내지 10％, 0 내지 5％ 또는 0 내지 1％로 일반적으로 저하된다.

본 발명에 따라 제조된 미생물 또한 본 발명의 주제이고, L-프롤린의 제조를 위한 목적으로 회분식(batch) 공정 또는 유가식(fed-batch) 공정 또는 반복 유가식 공정으로 연속적으로 또는 비연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법의 개관은 교과서 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 교과서 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 특정 균주의 요구사항을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물을 배양하기 위한 배지에 대한 기술(記述)은 매뉴얼 ["Manual of Methods for General Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 제공된다.

사용된 탄소 공급원은 당 및 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 오일, 지방산, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀산, 알콜, 예를 들어, 글리세롤 및 에탄올, 당 알콜, 예를 들어, 리비톨 또는 만니톨, 및 유기 산, 예를 들어, 아세트산일 수 있다. 이러한 물질들은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용된 질소 공급원은 유기 질소-함유 화합물 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 요소, 또는 무기 화합물 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄일 수 있다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용된 인 공급원은 인산, 인산2수소칼륨 또는 인산수소2칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염일 수 있다. 배양 배지는 성장에 필요한 금속의 염, 예를 들어 황산마그네슘 또는 황산철을 추가로 함유하여야 한다. 마지막으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 상기 언급된 물질들에 더하여 사용될 수 있다. 이에 더하여, 적절한 전구 물질이 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 첨가 물질들 은 1회만 첨가되는 혼합물의 형태로 배양물에 첨가될 수 있거나, 또는 배양 동안 적절한 방식으로 공급될 수 있다.

염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아, 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 배양물의 pH를 제어하기 위해 적절한 방식으로 사용할 수 있다. 포말 형성을 제어하기 위해, 포말억제제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 예를 들어, 선별적으로 작용할 수 있는 적절한 물질, 예컨대 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해, 예를 들어, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물 예컨대 공기가 배양물 내로 통과될 수 있다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 최대량의 L-프롤린이 형성될 때까지 또는 수율 또는 생산성이 원하는 최적 수준에 도달할 때까지 지속된다. 이러한 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간 이내에 달성된다.

L-프롤린을 결정하는 방법은 종래 기술에 개시되어 있다. [Spackman et al., Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190]에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌히드린(ninhydrin) 유도체화 및 적합한 파장에서의 검출에 의해 분석할 수 있다

따라서, 본 발명의 또다른 실시양태는

a) 1가지 이상의 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 발현 또는 과발현하는 숙주 생물을 발효시키는 단계, 및

b) 적합하다면 발효 브로쓰(broth)로부터의 성분들 및/또는 바이오매스(biomass)와 함께, L-프롤린을 단리 또는 수집하는 단계

에 의한 L-프롤린의 제조 방법이다.

하기의 단계들을 포함하는, L-프롤린의 제조 방법을 사용하는 것이 바람직하다:

a) 1가지 이상의 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 발현 또는 과발현하는 코리네폼 박테리아를 발효시키는 단계,

b) 발효 브로쓰 또는 코리네폼 박테리아 세포 내의 L-프롤린을 농축시키는 단계,

c) 발효 브로쓰로부터 L-프롤린을 단리 또는 수집하는 단계로,

d) 적합하다면, 발효 브로쓰로부터의 성분들 및/또는 바이오매스 (> 0 중량％ 내지 <100 중량％의 바이오매스, 바람직하게는 10 내지 80 중량％, 더욱 바람직하게는 20-60 중량％)와 함께, L-프롤린을 단리 또는 수집하는 단계.

이러한 방식으로 제조된 L-프롤린을 당업자에 의해 결정되는 바와 같이 수집 및 단리할 수 있고, 적합한 경우에는 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 L-프롤린의 발효성 제조에 사용된다.

본 발명에 따르면 용어 "필적하는 위치"는, 출발 서열의 고려되는 위치에서 서열 비교 프로그램 (BLAST, [Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-10])을 사용하여 출발 서열을 비교 서열과 비교함으로써, 비교되는 위치와 ±5개 이하, 더욱 바람직하게는 ±4개 이하, 더더욱 바람직하게는 ±3개 이하, 더욱 더 바람직 하게는 ±2개 이하, 가장 바람직하게는 ±1개 이하, 특히 0개의 위치만큼 상이한 비교 서열 내의 아미노산 위치를 제공하는 위치를 의미한다.

혼성화에 관한 설명은 당업자가 특히 매뉴얼 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization", Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)] 및 [Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260 (1991)]에서 확인할 수 있다. 혼성화는 엄격한 조건 하에, 즉 프로브, 예를 들어 서열 3에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 및 표적 서열, 즉 프로브로 처리되는 폴리뉴클레오티드가 70％ 이상 동일한 하이브리드만이 형성되는 조건 하에 수행된다. 세정 단계를 포함하여 혼성화의 엄격도는 완충제 조성, 온도 및 염 농도의 변화에 영향을 받거나 결정될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 혼성화 반응은 일반적으로 세정 단계와 비교하여 비교적 낮은 엄격도에서 수행된다 ([Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996]).

예를 들어, 약 50℃ - 68℃의 온도에서 5× SSC 완충제에 상응하는 완충제가 혼성화 반응에서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 프로브는 프로브의 서열과 70％ 미만으로 동일한 폴리뉴클레오티드에 또한 혼성화할 수 있다. 이같은 하이브리드는 덜 안정적이고, 엄격한 조건 하에서의 세정에 의해 제거된다. 이는, 예를 들어, 온도를 약 50℃ - 68℃, 약 52℃ - 68℃, 약 54℃ - 68℃, 약 56℃ - 68℃, 약 58℃ - 68℃, 약 60℃ - 68℃, 약 62℃ - 68℃, 약 64℃ - 68℃, 약 66℃ - 68℃로 설정하면서 농도를 2× SSC로 저하시키고, 적합한 경우에 이어서 0.5× SSC 로 저하시킴으로써 달성될 수 있다 ([The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995]). 약 62℃ - 68℃, 특히 바람직하게는 약 64℃ - 68℃ 또는 약 66℃ - 68℃의 온도에서 세정 단계를 수행하는 것이 바람직하다. 적한한 경우에, 염 농도를 0.2× SSC 또는 0.1× SSC에 상응하는 농도로 저하시키는 것이 가능하다. 50℃에서 68℃로 약 1 - 2℃의 단계로 혼성화 온도를 점진적으로 증가시킴으로써, 사용된 프로브의 서열과 70％ 이상 또는 80％ 이상 또는 90％ 내지 95％ 이상 또는 96％ 내지 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 단편을 단리할 수 있다. 혼성화에 관한 추가적인 설명은 "키트"의 형태로 시판된다 (예를 들어, Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany)의 DIG Easy Hyb, 카탈로그# 1603558).

본 발명에 따르면, 청구된 폴리펩티드 (아미노산 서열) 및 핵산 서열은 이같은 서열의 작용 또는 목적이 유지되는 한, 임의의 이러한 서열에 대한 상동성 (아미노산 수준) 및 동일성 (핵산 수준, 자연적인 축퇴성 제외)이 각각 70％ 초과, 바람직하게는 80％ 초과, 더욱 바람직하게는 85％ 초과 (핵산 서열에 대해) 또는 90％ 초과 (폴리펩티드에 대해), 바람직하게는 91％, 92％, 93％ 또는 94％ 초과, 더욱 바람직하게는 95％ 또는 96％ 초과, 특히 바람직하게는 97％, 98％ 또는 99％ 초과 (양쪽 서열 유형에 대해)인 서열들을 또한 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "상동성" (또는 동일성)은 식 H (％) = [1 - V/X] × 100 (식중 H는 상동성이고, X는 비교 서열의 핵염기/아미노산의 전체 갯수이고, V는 비교 서열을 기초로 하는, 고려되는 서열의 상이한 핵염기/아미노산의 갯수이다)에 의해 정의될 수 있다. 어떠한 경우에도, 용어 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에는 유전자 코드의 축퇴성 에 따라 가능한 것으로 보이는 모든 서열이 포함된다.

서열 번호에 의해 본 명세서에서 지시된 아미노산 서열에 대한 백분율 동일성은 종래 기술에 공지된 방법을 사용하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 적절한 프로그램은 BLASTP이다 ([Altschul et al., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 (17) :3389-3402]). 본 발명에 따른 핵산 서열은 DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 핵산 서열이 DNA 분자 또는 mRNA 분자인 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, DNA 분자는 또한 게놈 DNA 분자 또는 단리된 DNA 분자일 수 있다. 본 발명에는 DNA 분자가 PNA 분자, 또는 DNA 분자의 또다른 유도체인 실시양태가 또한 포함된다.

DSMZ 번호에 의해 지시된 본 명세서에서 언급된 미생물들은 <Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 4, Brunswick (Germany)>에서 수득할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Degussa AG <120> Mutant of the proB gene from coryneform bacteria <130> 040071 AM <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1110 <212> DNA <213> coryneform bacterium <220> <221> CDS <222> (1)..(1107) <220> <221> misc_feature <222> (445)..(447) <223> Xaa all proteinogenic amino acids other than glycine <400> 1 atg cgt gag cgc atc tcc aac gct aag cga gtg gtg gtg aaa att ggt 48 Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly 1 5 10 15 tcg tcc tca ttg act aac gat gag gac gga cac acc gtc gat ccc aac 96 Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Glu Asp Gly His Thr Val Asp Pro Asn 20 25 30 cgc atc aac act att gtc aat gcc ttg caa gca cgc atg gaa gct ggc 144 Arg Ile Asn Thr Ile Val Asn Ala Leu Gln Ala Arg Met Glu Ala Gly 35 40 45 tcg gac ctc atc gtt gtg tcc tct ggc gca gtg gcc gcg gga atg gcc 192 Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala 50 55 60 ccg ctt gga ttg agc acc cgg ccc acg gaa ttg gca gtc aag cag gct 240 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Arg Pro Thr Glu Leu Ala Val Lys Gln Ala 65 70 75 80 gca gca gca gtg ggg caa gtt cac ctc atg cac cag tgg gga cgt tct 288 Ala Ala Ala Val Gly Gln Val His Leu Met His Gln Trp Gly Arg Ser 85 90 95 ttt gcc cgg tat ggt cgc ccc atc ggc cag gtg ctt ctt acc gca gct 336 Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Pro Ile Gly Gln Val Leu Leu Thr Ala Ala 100 105 110 gat gca gga aag cgt gat cgt gcg agg aat gcg cag cgt acc atc gac 384 Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp 115 120 125 aag ctg cgc att ttg ggc gcg gtt cct atc gtc aat gaa aat gac acc 432 Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr 130 135 140 gtg gca acc acc nnn gtg aat ttt ggt gac aac gac cga ctt gct gca 480 Val Ala Thr Thr Xaa Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala 145 150 155 160 att gtg gcg cac ctg gtg tcg gct gat gct ttg gtg ctg ctc agt gac 528 Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp 165 170 175 gtg gat gga ctt ttt gat aaa aac cct act gat ccc acc gcg aag ttt 576 Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe 180 185 190 att tcc gag gtt cgt gac ggc aat gat ttg aaa ggt gtc att gcc ggc 624 Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly 195 200 205 gac ggc gga aaa gtg ggc acc ggt ggc atg gca tca aag gtg tct gct 672 Asp Gly Gly Lys Val Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Val Ser Ala 210 215 220 gca cgt ttg gct tcc cga agt ggc gtg cct gtg ctg ttg acc tct gcg 720 Ala Arg Leu Ala Ser Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Leu Thr Ser Ala 225 230 235 240 gca aac att ggc cca gca ctg gaa gac gcc cag gtg ggc act gta ttc 768 Ala Asn Ile Gly Pro Ala Leu Glu Asp Ala Gln Val Gly Thr Val Phe 245 250 255 cac ccc aag gac aac cgc ctc tcc gcg tgg aag ttc tgg gct ttg tat 816 His Pro Lys Asp Asn Arg Leu Ser Ala Trp Lys Phe Trp Ala Leu Tyr 260 265 270 gcc gca gat act gca gga aag atc cga ctc gat gac ggc gcg gtg gaa 864 Ala Ala Asp Thr Ala Gly Lys Ile Arg Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu 275 280 285 gca gtg acc tcc ggt ggt aaa tct ttg ctg gct gtg ggc att act gaa 912 Ala Val Thr Ser Gly Gly Lys Ser Leu Leu Ala Val Gly Ile Thr Glu 290 295 300 atc att ggt gat ttc cag cag ggt gag atc gtg gag atc ttg gga cct 960 Ile Ile Gly Asp Phe Gln Gln Gly Glu Ile Val Glu Ile Leu Gly Pro 305 310 315 320 gcc ggc caa atc atc ggg cga ggc gag gtg tcc tac gat tct gat acc 1008 Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr 325 330 335 ttg caa tca atg gtt ggt atg caa acg cag gac ctt cca gat ggc atg 1056 Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met 340 345 350 cag cgc ccg gta gtg cat gca gat tat ctg tcc aac tac gcc agc cgc 1104 Gln Arg Pro Val Val His Ala Asp Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Arg 355 360 365 gcg taa 1110 Ala <210> 2 <211> 369 <212> PRT <213> coryneform bacterium <220> <221> misc_feature <222> (149)..(149) <223> The 'Xaa' at location 149 stands for Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, or Phe. <400> 2 Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Glu Asp Gly His Thr Val Asp Pro Asn 20 25 30 Arg Ile Asn Thr Ile Val Asn Ala Leu Gln Ala Arg Met Glu Ala Gly 35 40 45 Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala 50 55 60 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Arg Pro Thr Glu Leu Ala Val Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Val Gly Gln Val His Leu Met His Gln Trp Gly Arg Ser 85 90 95 Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Pro Ile Gly Gln Val Leu Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp 115 120 125 Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr 130 135 140 Val Ala Thr Thr Xaa Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala 145 150 155 160 Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp 165 170 175 Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe 180 185 190 Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly 195 200 205 Asp Gly Gly Lys Val Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Val Ser Ala 210 215 220 Ala Arg Leu Ala Ser Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Leu Thr Ser Ala 225 230 235 240 Ala Asn Ile Gly Pro Ala Leu Glu Asp Ala Gln Val Gly Thr Val Phe 245 250 255 His Pro Lys Asp Asn Arg Leu Ser Ala Trp Lys Phe Trp Ala Leu Tyr 260 265 270 Ala Ala Asp Thr Ala Gly Lys Ile Arg Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu 275 280 285 Ala Val Thr Ser Gly Gly Lys Ser Leu Leu Ala Val Gly Ile Thr Glu 290 295 300 Ile Ile Gly Asp Phe Gln Gln Gly Glu Ile Val Glu Ile Leu Gly Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr 325 330 335 Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met 340 345 350 Gln Arg Pro Val Val His Ala Asp Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Arg 355 360 365 Ala <210> 3 <211> 1110 <212> DNA <213> coryneform bacterium <220> <221> CDS <222> (1)..(1107) <220> <221> mutation <222> (446)..(446) <223> adenine <400> 3 atg cgt gag cgc atc tcc aac gct aag cga gtg gtg gtg aaa att ggt 48 Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly 1 5 10 15 tcg tcc tca ttg act aac gat gag gac gga cac acc gtc gat ccc aac 96 Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Glu Asp Gly His Thr Val Asp Pro Asn 20 25 30 cgc atc aac act att gtc aat gcc ttg caa gca cgc atg gaa gct ggc 144 Arg Ile Asn Thr Ile Val Asn Ala Leu Gln Ala Arg Met Glu Ala Gly 35 40 45 tcg gac ctc atc gtt gtg tcc tct ggc gca gtg gcc gcg gga atg gcc 192 Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala 50 55 60 ccg ctt gga ttg agc acc cgg ccc acg gaa ttg gca gtc aag cag gct 240 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Arg Pro Thr Glu Leu Ala Val Lys Gln Ala 65 70 75 80 gca gca gca gtg ggg caa gtt cac ctc atg cac cag tgg gga cgt tct 288 Ala Ala Ala Val Gly Gln Val His Leu Met His Gln Trp Gly Arg Ser 85 90 95 ttt gcc cgg tat ggt cgc ccc atc ggc cag gtg ctt ctt acc gca gct 336 Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Pro Ile Gly Gln Val Leu Leu Thr Ala Ala 100 105 110 gat gca gga aag cgt gat cgt gcg agg aat gcg cag cgt acc atc gac 384 Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp 115 120 125 aag ctg cgc att ttg ggc gcg gtt cct atc gtc aat gaa aat gac acc 432 Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr 130 135 140 gtg gca acc acc gat gtg aat ttt ggt gac aac gac cga ctt gct gca 480 Val Ala Thr Thr Asp Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala 145 150 155 160 att gtg gcg cac ctg gtg tcg gct gat gct ttg gtg ctg ctc agt gac 528 Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp 165 170 175 gtg gat gga ctt ttt gat aaa aac cct act gat ccc acc gcg aag ttt 576 Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe 180 185 190 att tcc gag gtt cgt gac ggc aat gat ttg aaa ggt gtc att gcc ggc 624 Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly 195 200 205 gac ggc gga aaa gtg ggc acc ggt ggc atg gca tca aag gtg tct gct 672 Asp Gly Gly Lys Val Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Val Ser Ala 210 215 220 gca cgt ttg gct tcc cga agt ggc gtg cct gtg ctg ttg acc tct gcg 720 Ala Arg Leu Ala Ser Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Leu Thr Ser Ala 225 230 235 240 gca aac att ggc cca gca ctg gaa gac gcc cag gtg ggc act gta ttc 768 Ala Asn Ile Gly Pro Ala Leu Glu Asp Ala Gln Val Gly Thr Val Phe 245 250 255 cac ccc aag gac aac cgc ctc tcc gcg tgg aag ttc tgg gct ttg tat 816 His Pro Lys Asp Asn Arg Leu Ser Ala Trp Lys Phe Trp Ala Leu Tyr 260 265 270 gcc gca gat act gca gga aag atc cga ctc gat gac ggc gcg gtg gaa 864 Ala Ala Asp Thr Ala Gly Lys Ile Arg Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu 275 280 285 gca gtg acc tcc ggt ggt aaa tct ttg ctg gct gtg ggc att act gaa 912 Ala Val Thr Ser Gly Gly Lys Ser Leu Leu Ala Val Gly Ile Thr Glu 290 295 300 atc att ggt gat ttc cag cag ggt gag atc gtg gag atc ttg gga cct 960 Ile Ile Gly Asp Phe Gln Gln Gly Glu Ile Val Glu Ile Leu Gly Pro 305 310 315 320 gcc ggc caa atc atc ggg cga ggc gag gtg tcc tac gat tct gat acc 1008 Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr 325 330 335 ttg caa tca atg gtt ggt atg caa acg cag gac ctt cca gat ggc atg 1056 Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met 340 345 350 cag cgc ccg gta gtg cat gca gat tat ctg tcc aac tac gcc agc cgc 1104 Gln Arg Pro Val Val His Ala Asp Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Arg 355 360 365 gcg taa 1110 Ala <210> 4 <211> 369 <212> PRT <213> coryneform bacterium <400> 4 Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Glu Asp Gly His Thr Val Asp Pro Asn 20 25 30 Arg Ile Asn Thr Ile Val Asn Ala Leu Gln Ala Arg Met Glu Ala Gly 35 40 45 Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala 50 55 60 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Arg Pro Thr Glu Leu Ala Val Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Val Gly Gln Val His Leu Met His Gln Trp Gly Arg Ser 85 90 95 Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Pro Ile Gly Gln Val Leu Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp 115 120 125 Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr 130 135 140 Val Ala Thr Thr Asp Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala 145 150 155 160 Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp 165 170 175 Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe 180 185 190 Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly 195 200 205 Asp Gly Gly Lys Val Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Val Ser Ala 210 215 220 Ala Arg Leu Ala Ser Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Leu Thr Ser Ala 225 230 235 240 Ala Asn Ile Gly Pro Ala Leu Glu Asp Ala Gln Val Gly Thr Val Phe 245 250 255 His Pro Lys Asp Asn Arg Leu Ser Ala Trp Lys Phe Trp Ala Leu Tyr 260 265 270 Ala Ala Asp Thr Ala Gly Lys Ile Arg Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu 275 280 285 Ala Val Thr Ser Gly Gly Lys Ser Leu Leu Ala Val Gly Ile Thr Glu 290 295 300 Ile Ile Gly Asp Phe Gln Gln Gly Glu Ile Val Glu Ile Leu Gly Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr 325 330 335 Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met 340 345 350 Gln Arg Pro Val Val His Ala Asp Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Arg 355 360 365 Ala <210> 5 <211> 1110 <212> DNA <213> coryneform bacterium <220> <221> CDS <222> (1)..(1107) <220> <221> mutation <222> (446)..(446) <223> adenine <400> 5 atg cgt gaa cgc atc tcc aac gct aag cga gtg gtg gtg aaa att ggt 48 Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly 1 5 10 15 tcg tcc tca ttg act aac gat gag gac gga cac acc gtc gat ccc aac 96 Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Glu Asp Gly His Thr Val Asp Pro Asn 20 25 30 cgc atc aac act att gtc aat gcc ttg caa gca cgc atg gaa gct ggc 144 Arg Ile Asn Thr Ile Val Asn Ala Leu Gln Ala Arg Met Glu Ala Gly 35 40 45 tcg gac ctc atc gtt gtg tcc tct ggc gca gtg gcc gcg gga atg gcc 192 Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala 50 55 60 ccg ctt gga ttg agc acc cgg ccc acg gaa ttg gca gtc aag cag gct 240 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Arg Pro Thr Glu Leu Ala Val Lys Gln Ala 65 70 75 80 gca gca gca gtg ggg caa gtt cac ctc atg cac cag tgg gga cgt tct 288 Ala Ala Ala Val Gly Gln Val His Leu Met His Gln Trp Gly Arg Ser 85 90 95 ttt gcc cgg tat ggt cgc ccc atc ggc cag gtg ctt ctt acc gca gct 336 Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Pro Ile Gly Gln Val Leu Leu Thr Ala Ala 100 105 110 gat gca gga aag cgt gat cgt gcg agg aat gcg cag cgt acc atc gac 384 Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp 115 120 125 aag ctg cgc att ttg ggc gcg gtt cct atc gtc aat gaa aat gac acc 432 Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr 130 135 140 gtg gca acc acc gat gtg aat ttt ggt gac aac gac cga ctt gct gca 480 Val Ala Thr Thr Asp Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala 145 150 155 160 att gtg gcg cac ctg gtg tcg gct gac gct ttg gtg ctg ctc agt gac 528 Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp 165 170 175 gtg gat gga ctt ttt gat aag aac cct act gat ccc acc gcg aag ttt 576 Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe 180 185 190 att tcc gag gtt cgt gac ggc aat gat ttg aaa ggt gtc att gcc ggc 624 Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly 195 200 205 gac ggc gga aaa gtg ggc acc ggc ggc atg gca tca aag gtg tct gct 672 Asp Gly Gly Lys Val Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Val Ser Ala 210 215 220 gca cgt ttg gct tcc cga agt ggc gtg cct gtg ctg ttg acc tct gcg 720 Ala Arg Leu Ala Ser Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Leu Thr Ser Ala 225 230 235 240 gca aac att ggc cca gca ctg gaa gac gcc cag gtg ggc act gta ttc 768 Ala Asn Ile Gly Pro Ala Leu Glu Asp Ala Gln Val Gly Thr Val Phe 245 250 255 cac ccc aag gac aac cgc ctc tcc gcg tgg aag ttc tgg gct ttg tat 816 His Pro Lys Asp Asn Arg Leu Ser Ala Trp Lys Phe Trp Ala Leu Tyr 260 265 270 gcc gca gat act gca gga aag atc cga ctt gat gat ggc gcg gtg gaa 864 Ala Ala Asp Thr Ala Gly Lys Ile Arg Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu 275 280 285 gca gtg acc tcc ggt ggt aaa tct ttg ctg gct gtg ggc att act gag 912 Ala Val Thr Ser Gly Gly Lys Ser Leu Leu Ala Val Gly Ile Thr Glu 290 295 300 atc att ggt gat ttc caa cag ggt gag atc gtg gag atc ttg gga cct 960 Ile Ile Gly Asp Phe Gln Gln Gly Glu Ile Val Glu Ile Leu Gly Pro 305 310 315 320 gcc ggc caa atc atc ggg cga ggc gag gtg tcc tac gat tct gat acc 1008 Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr 325 330 335 ttg caa tca atg gtt ggc atg caa acg cag gac ctt cca gat ggc atg 1056 Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met 340 345 350 cag cgc ccg gta gtg cat gca gat tat ctg tcc aac tac gcc agc cgc 1104 Gln Arg Pro Val Val His Ala Asp Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Arg 355 360 365 gcg taa 1110 Ala <210> 6 <211> 369 <212> PRT <213> coryneform bacterium <400> 6 Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Glu Asp Gly His Thr Val Asp Pro Asn 20 25 30 Arg Ile Asn Thr Ile Val Asn Ala Leu Gln Ala Arg Met Glu Ala Gly 35 40 45 Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala 50 55 60 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Arg Pro Thr Glu Leu Ala Val Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Val Gly Gln Val His Leu Met His Gln Trp Gly Arg Ser 85 90 95 Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Pro Ile Gly Gln Val Leu Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp 115 120 125 Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr 130 135 140 Val Ala Thr Thr Asp Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala 145 150 155 160 Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp 165 170 175 Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe 180 185 190 Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly 195 200 205 Asp Gly Gly Lys Val Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Val Ser Ala 210 215 220 Ala Arg Leu Ala Ser Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Leu Thr Ser Ala 225 230 235 240 Ala Asn Ile Gly Pro Ala Leu Glu Asp Ala Gln Val Gly Thr Val Phe 245 250 255 His Pro Lys Asp Asn Arg Leu Ser Ala Trp Lys Phe Trp Ala Leu Tyr 260 265 270 Ala Ala Asp Thr Ala Gly Lys Ile Arg Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu 275 280 285 Ala Val Thr Ser Gly Gly Lys Ser Leu Leu Ala Val Gly Ile Thr Glu 290 295 300 Ile Ile Gly Asp Phe Gln Gln Gly Glu Ile Val Glu Ile Leu Gly Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr 325 330 335 Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met 340 345 350 Gln Arg Pro Val Val His Ala Asp Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Arg 355 360 365 Ala Degussa Aktiengesellschaft 60311 Frankfurt

Claims (6)

1. 위치 149 또는 필적하는 위치에서 글리신 이외의 단백질성 아미노산을 갖는 γ-글루타밀 키나제.
2. 제1항에 있어서, Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys 또 Phe로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산이 제1항에 정의된 아미노산 위치 또는 필적하는 위치에 존재하는 γ-글루타밀 키나제.
3. 제1항 또는 제2항의 γ-글루타밀 키나제를 코딩하는 핵산 서열.
4. 제3항에 있어서,

   a) 서열 1과 70％ 이상 동일하거나,

   b) 369 ± 40 개의 아미노산 길이인 제1항 또는 제2항의 γ-글루타밀 키나제를 코딩하거나,

   c) 적어도 위치 145 내지 154 또는 필적하는 위치에서 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 제1항 또는 제2항의 γ-글루타밀 키나제를 코딩하거나,

   d) 적어도 위치 145 내지 154 또는 필적하는 위치에서 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 제1항 또는 제2항의 γ-글루타밀 키나제를 코딩하고, 엄격한 실험 조건 하에 서열 1 또는 서열 3에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
5. 제3항 또는 제4항의 뉴클레오티드 서열을 갖는 Rec 비히클(vehicle).
6. a) 제3항 또는 제4항의 뉴클레오티드 서열을 발현 또는 과발현하는 숙주 생물을 발효시키는 단계, 및

   b) 적합하다면 발효 브로쓰(broth)로부터의 성분들 및/또는 바이오매스(biomass)와 함께, L-프롤린을 단리 또는 수집하는 단계

   에 의한 L-프롤린의 제조 방법.