CN110777174A - 发酵生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用具有分泌L‑赖氨酸的能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种的细菌发酵生产L‑赖氨酸的新方法，在所述细菌的染色体中含有编码具有水解酶活性的多肽的多核苷酸的变体。

Description

发酵生产L-赖氨酸的方法
L-赖氨酸用于人类医学、制药工业、食品工业，以及特别是用于动物营养。
L-赖氨酸是通过谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种的菌株的发酵产生的。由于重大的经济重要性，正在不断进行改善生产方法的工作。改善可以涉及发酵技术，例如搅拌和供应氧气，或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度，或涉及通过例如对发酵液进行干燥和造粒或离子交换色谱将发酵液加工成合适的产品形式，或者可以涉及微生物本身固有的性能特性。
用于改善这些微生物的性能特性的方法是诱变、选择和筛选突变体的那些方法。以这种方式获得的菌株对于抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷的，并产生L-赖氨酸。熟知的抗代谢物是L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(参见例如Tosaka et al.:Agricultural and Biological Chemistry 42(4),745-752,(1978))。
多年来，重组DNA技术的方法同样用于改善谷氨酸棒杆菌物种的产L-赖氨酸菌株，通过修饰(即增强或减弱)单个L-赖氨酸生物合成中涉及的基因并研究对L-赖氨酸生产的影响进行。
对可能导致发酵过程中生产力下降的谷氨酸棒杆菌细胞裂解的控制的研究仍然不足。已知细胞壁水解酶是降解细菌细胞壁的酶，并且存在于具有含肽聚糖的细胞壁的所有微生物中(Rice KC&Bayles KW,Microbiology and Molecular Biology Reviews 2008,72:85-109)。尽管已经在各种细菌中进行了对这种细胞壁水解酶的研究，但是它们精确的控制机制仍然是未知的。
已经分别公开了各种细菌或谷氨酸棒杆菌物种的菌株的染色体的核苷酸序列，以及它们的分析。该信息可在公共可访问的数据库获得，并可用于菌株开发目的。一个这样的数据库是NCBI(National Center for Biotechnology Information，U.S.NationalLibrary of Medicine 8600Rockville Pike，Bethesda MD，20894USA)的GenBank数据库。
在针对生物体的经测序的染色体注释过程期间，由信息的提供者将经鉴定的结构例如基因或编码序列与称为locus_tag的唯一标识符一起提供给数据库。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))描述并在EP1108790中描述。该信息可在NCBI以登录号NC_003450获得。在以登录号NC_003450公开的染色体序列中，locus_tag NCgl1480标识以密码子ttg开始的编码细胞壁相关水解酶的核苷酸序列。所编码多肽的氨基酸序列长604个氨基酸，可在标识符NP_600753下获得。在EP1108790A2中，编码序列公开于序列7064(参见GenBank登录号AX127148)。
Kalinowski等人独立地描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析(Journal of Biotechnology 104(1-3)，5-25(2003))。该信息可在NCBI以登录号NC_006958获得。Locus_tag CGTRNA_RS07715标识编码水解酶并以密码子ttg开始的核苷酸序列。old_locus_tag名称cg1735也在本领域中使用。多肽的氨基酸序列长604个氨基酸，可在标识符WP_011014435下获得。
locus_tag NCgl1480和CGTRNA_RS07715的核苷酸序列是相同的。
Marchard等人(Journal of Bacteriology 194(3),587-597(2012)将NCgl1480描述为一组推定的真菌膜(mycomembrane)蛋白的成员，更具体地,为推定的细胞壁相关水解酶，其带有用于细胞膜易位的一般分泌途径的信号序列。
EP3318637A1描述了各种细胞壁水解酶的失活及其对L-赖氨酸产生的影响。该文献进一步公开了通过缺失NCgl1480的核苷酸序列使NCgl1480的核苷酸序列编码的细胞壁水解酶失活，增强了L-赖氨酸的产生。EP3318637A1还提出了用突变基因置换染色体上的编码酶的基因，从而可以降低酶活性的方法。然而，该文献没有教导这种突变基因。因此，存在提供这样的(一个或多个)突变的变体的需要。
有关谷氨酸棒杆菌中转录信号的信息(例如old_locus_tag cg1735识别的基因的启动子的-10区或转录起始位点(TSS))可以在Pfeifer-Sancar等人(BMC Genomics 14：888(2013))、Albersmeier等人(Journal of Biotechnology257(2017)99-109)或Menz等人(BMC Genomics 2013,14:714)的文章中找到。
Yukawa等人描述了谷氨酸棒杆菌R染色体的核苷酸序列及其分析(Microbiology153(4):1042-1058(2007))。它可在NCBI以登录号AP009044获得。Locus_tag cgR_1596标识编码假设的蛋白质并以密码子gtg开始的核苷酸序列。多肽的氨基酸序列长610个氨基酸，可以在标识符BAF54588下获得。
谷氨酸棒杆菌R染色体的核苷酸序列及其分析也可以登录号NC_009342获得。在名称cgR_1596下，多肽的预测功能以水解酶给出。
由登录号AP009044的locus_tag cgR_1596标识的多肽是由NCgl1480标识的多肽的同源对应物。氨基酸序列比对显示，除了其他差异之外，当与由NCgl1480标识的多肽相比时，由locus_tag cgR_1596标识的多肽在N末端显示26个额外的氨基酸(参见表1)。
表1:根据登录号NC_003450由locus_tag NCgl1480标识的多肽的N末端与根据登录号AP009044由locus_tag cgR_1596标识的多肽的N末端的氨基酸序列比对。
Figure BDA0002141597560000031
Tsuge等人(Journal of Bacteriology 190(24),8204-8214,2008)研究了cgR_1596的缺失对谷氨酸棒杆菌R中细胞分离的影响。Tsuge等人进一步指出，CgR_1596含有在细胞壁水解酶中保守的氨基酸序列结构域和49个氨基酸的信号肽。
本发明的目标是提供通过谷氨酸棒杆菌物种的细菌发酵生产L-赖氨酸的新措施。
为了实现上述目标，本发明提供使用具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌物种的细菌发酵生产L-赖氨酸的新方法，所述谷氨酸棒杆菌在其染色体中含有编码SEQ ID NO:2所示的多肽的多核苷酸的变体，其中在多肽的氨基酸序列中，位置90处的氨基酸是异亮氨酸，位置159处的氨基酸是精氨酸，位置449处的氨基酸是天冬氨酸，且位置454处的氨基酸是苯丙氨酸。所述多肽变体的氨基酸序列也示于序列表的SEQ ID NO:4。
本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)提供一种具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌物种的细菌，在其染色体中含有编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
b)在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，以及
c)在所述培养基中积累L-赖氨酸以形成含有L-赖氨酸的发酵液。
发现与未修饰的细菌相比，根据本发明的方法提供的修饰的细菌在合适的发酵条件下，就选自产物浓度(例如每体积产生的L-赖氨酸的量)、产物产率和产物形成速率的一个或多个参数而言，以增加的方式将L-赖氨酸分泌到合适的培养基中。
明显的是，更高的产物浓度有利于产品制备，例如纯化和分离。增加的产物产率减少了所需的原料量。增加的产物形成速率减少了发酵运行所需的时间，从而增加了给定发酵罐的可用性。
因此，根据本发明的方法有助于制备L-赖氨酸或含L-赖氨酸产物的技术和经济方面的改善。
序列表中的SEQ ID NO:2显示了由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032编码的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列与NCgl1480中所示的氨基酸序列之间的差异是SEQID NO:2的N末端的26个额外氨基酸的序列。除了将NCgl1480中的起始密码子ttg翻译为甲硫氨酸密码子之外，SEQ ID NO:2位置27至630的氨基酸序列与NCgl1480呈现的氨基酸相同。序列表的SEQ ID NO:4显示了在根据本发明的方法中使用的SEQ ID NO:2的变体的氨基酸序列。两个氨基酸序列之间的差异如下：SEQ ID NO:2的位置90处的氨基酸是缬氨酸，而SEQ ID NO:4中是异亮氨酸。SEQ ID NO:2的位置159处的氨基酸是甘氨酸，而SEQ ID NO:4中的是精氨酸。SEQ ID NO:2的位置449处的氨基酸是甘氨酸，而SEQ ID NO:4中的氨是天冬氨酸。SEQ ID NO:2的位置454处的氨基酸是丝氨酸，而SEQ ID NO:4中的是苯丙氨酸。
因此，使用氨基酸的单字母缩写代码，该变体的特征在于以下各个氨基酸取代或氨基酸交换：以SEQ ID NO:2为参考，V90I、G159R、G449D和S454F。
使用NCgl1480下给出的信息，所述氨基酸取代或氨基酸交换的位置分别指定为：V64I、G133R、G423D和S428F。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码SEQID NO:4所示多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的位置923至2812的核苷酸序列。
在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码SEQ ID NO:4所示多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的位置923至2815的核苷酸序列。
在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码SEQ ID NO:4所示多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的位置585至2815的核苷酸序列。
在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码SEQ ID NO:4所示多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的位置565至2815的核苷酸序列。
按照本领域的描述，SEQ ID NO:4所示的多肽或其加工的衍生物(例如切除信号肽后)是真菌膜蛋白，并分别具有细胞壁相关水解酶、细胞壁水解酶或水解酶的功能或活性。
在另一实施方案中，除了编码SEQ ID NO:4所示多肽的多核苷酸外，本发明的方法提供的细菌还包含编码由NCgl2986标识的多肽的多核苷酸，其中氨基酸序列的位置265处的氨基酸脯氨酸被不同的氨基酸取代，优选被亮氨酸取代。
由NCgl2986标识的多肽的氨基酸序列也显示在序列表的SEQ ID NO:8中。编码所述多肽的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:7中。
在本领域中，由NCgl2986标识的多肽的功能被描述为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶。
本文提及的术语L-赖氨酸，特别是在产物形成的情况下，还包含它们的离子形式和盐，例如L-赖氨酸单盐酸盐或L-赖氨酸硫酸盐。
为了实施本发明，使用物种谷氨酸棒杆菌的细菌。棒状杆菌属(Corynebacterium)和该属包含的物种谷氨酸棒杆菌的描述可以在K.A.Bernard and G.Funke在Bergey'sManual of Systematics of Archaea and Bacteria(Bergey's Manual Trust,2012)中的文章“Corynebacterium”中找到。
用于本发明的方法的合适的细菌是谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株，例如从菌株ATCC13032等通过一或多个步骤的菌株开发获得的并如本发明所描述进行修饰的L-赖氨酸分泌菌株。
菌株ATCC13032(也可以DSM20300获得)是谷氨酸棒杆菌物种的分类类型菌株。基于DNA-DNA杂交的这组细菌的分类学研究由Liebl等人完成(International Journal ofSystematic Bacteriology 41(2)，255-260,1991)。Yang和Yang(BMC Genomics 18(1)：940,2017)提供了基于基因组序列分析的谷氨酸棒杆菌物种的各种菌株的比较分析。
在过去几十年中，从菌株例如ATCC13032等开始，在本领域中获得了多种棒状杆菌属(Corynebacterium)(特别是谷氨酸棒杆菌物种)的L-赖氨酸分泌菌株。它们是菌株开发程序获得的结果，尤其是使用方法如经典诱变、抗代谢物抗性的选择以及通过遗传工程方法对L-赖氨酸的生物合成途径的基因进行扩增和启动子修饰获得。总结可以在L.Eggeling和M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)或H.Yukawa和M.Inui(Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnology,Springer Verlag,2013)或A.Yokota和M.Ikeda(Amino Acid Fermentation,Springer Verlag,2017)中找到。
谷氨酸棒杆菌物种的L-赖氨酸分泌菌株在本领域中是广泛已知的，并且可以如本发明所描述的进行修饰。例如Blombach等人(Applied and Environmental Microbiology75(2),419-427,2009)描述了菌株DM1933，其根据布达佩斯条约以保藏号DSM25442保藏。菌株DM1933是通过几个步骤的菌株开发从ATCC13032获得的。此外，可以使用根据布达佩斯条约以DSM32514保藏的分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株DM2031。菌株DM2031是DM1933进一步开发的衍生物，其具有增强的L-赖氨酸分泌能力。其他分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株在例如WO2008033001A1和EP0841395A1中描述。
谷氨酸棒杆菌物种的L-赖氨酸分泌菌株通常含有编码反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸。反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽变体是指当与野生形式的酶(其包含在野生菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中)比较时，分别对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如各自10mM)或L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mM S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)的抑制较不敏感或脱敏的天冬氨酸激酶。天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。编码反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽变体的谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的描述例如在US5688671、US6844176和US6893848中给出。总结列表尤其可以在WO2009141330中找到。本领域中用于编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号是lysC。在基因编码反馈抗性的多肽变体的情况下，本领域通常使用符号如lysCfbr，其中fbr表示反馈抗性。
因此，如本发明所描述的修饰的物种谷氨酸棒杆菌的所述L-赖氨酸分泌菌株优选含有至少(≥)一个拷贝的编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的多核苷酸。
SEQ ID NO:5显示了菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:6显示了所编码多肽的氨基酸序列。本领域已知(US6893848)，用Ile交换SEQ ID NO:6的位置311处的氨基酸Thr赋予酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制的反馈抗性。
因此，优选所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在位置311处含有异亮氨酸的SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
通过给以胸腺嘧啶(t)交换SEQ ID NO:5的位置932处的核碱基胞嘧啶(c)(在密码子的第二位置处的c→t取代)，可以实现所述氨基酸交换。这样，苏氨酸的密码子acc被改变为异亮氨酸的密码子atc。
本领域进一步已知，用atg交换天冬氨酸激酶多肽的编码序列的起始密码子gtg增强所述多肽的表达(例如EP2796555A2)。
因此，优选编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的序列以起始密码子atg开始。
关于谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株育种的总结尤其可以在L.Eggeling和M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)，V.F.Wendisch(Amino Acid Biosynthesis–Pathways,Regulation and Metabolic Engineering,Springer Verlag,2007)，H.Yukawa和M.Inui(Corynebacterium glutamicum Biology andBiotechnolgy，Springer Verlag，2013)，以及Eggeling和Bott(Applied Microbiologyand Biotechnology 99(9),3387-3394,2015)中找到。
术语DSM表示位于德国不伦瑞克(Braunschweig,Germany)的保藏单位德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen)。术语ATCC表示位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯(Manasass,Virginia,US)的保藏单位美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
关于存在于活的物体例如细菌如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌(Escherichia coli)中的多核苷酸和多肽的生物化学和化学结构的细节，尤其可以在例如Berg等人的教科书“Biochemie”(Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg,Berlin,Germany,2003；ISBN3-8274-1303-6)中找到。
对于多核苷酸和多肽的序列分析，例如序列比对，可以使用Clustal W程序(Larkin等人：Clustal W and Clustal X version 2.0.In:Bioinformatics 23,2947-2948(2007))或公共或商业上可得的软件如CLC Genomics Workbench(Qiagen，Hilden，Germany)或由European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI，Hinxton，UK)提供的程序MUSCLE。对于遗传编码密码子的翻译，使用由NCBI提供的表11。
谷氨酸棒杆菌，特别是菌株ATCC13032和在菌株开发程序期间由其获得的L-赖氨酸分泌菌株，在它们的染色体中含有(特别是一个)编码具有细胞壁相关水解酶(在本文中也称为细胞壁水解酶)活性并且包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的基因。编码序列显示于SEQ ID NO:1的位置923至2812。编码序列可含有不改变多肽的氨基酸序列的沉默突变。该情况在本领域也称为遗传密码的简并性。关于Pfeifer-Sancar等人发表的old_locus_tag cg_1735的基因启动子的信息，显示在SEQ ID NO:1(和SEQ ID NO:3)中。
在本发明的工作期间，发现与未修饰细菌相比，通过在SEQ ID NO:2所示的所编码的多肽的氨基酸序列中，将位置90处的氨基酸缬氨酸交换成异亮氨酸，将位置159处的氨基酸甘氨酸交换成精氨酸，将位置449处的氨基酸甘氨酸交换成天冬氨酸，并将位置454处的氨基酸丝氨酸交换成苯丙氨酸来修饰谷氨酸棒杆菌物种的L-赖氨酸分泌细菌，提高了它们在发酵过程中分泌L-赖氨酸的能力。
在本发明的工作期间，发现通过用不同的氨基酸(优选亮氨酸)取代SEQ ID NO:8所示多肽的氨基酸序列的位置265处的氨基酸脯氨酸，额外修饰在SEQ ID NO:2的位置90、159、449和454处含有所述氨基酸取代的所述细菌，进一步提高了所述细菌分泌L-赖氨酸的能力。
此外，除了上述氨基酸取代之外，还可以用苯丙氨酸取代SEQ ID NO:2的位置590处的氨基酸丝氨酸。更进一步，明显的是，在SEQ ID NO:2的所指明的位置尝试其他氨基酸取代，并研究对合适的谷氨酸棒杆菌菌株的L-赖氨酸分泌的影响。
在本发明的工作期间，使用SignalP软件(DTU Bioinformatics,Department ofBio and Health Informatics,Lyngby,Denmark)分析SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的信号肽切割位点的存在和位置。该研究的结果是，位置49和50之间的氨基酸序列被鉴定为切割位点，因此SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的位置1至49的氨基酸序列被鉴定为膜转移的信号肽。明显的是，如此处理的多肽中氨基酸取代的位置相应地改变。
本领域技术人员知道如何在谷氨酸棒杆菌中实现所述(一个或多个)修饰的许多诱变方法。
根据本发明的突变细菌可以使用诱变物质(例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍或紫外光)通过对谷氨酸棒杆菌菌株的细胞群进行的经典体内诱变来获得。
可以使用选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的引物通过PCR扩增(一个或多个)诱变位点的核苷酸序列。通过对PCR产物测序，鉴定出所需的突变体。关于该方法的细节尤其可以在US7754446中找到。实时PCR与FRET杂交探针组合也可用于突变检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。Cyril D S Mamotte(The Clinical Biochemist Reviews 27,63-75(2006))综述了使用该方法鉴定单核苷酸取代。关于该方法的进一步总结可以在JocelynE.Krebs,Elliott S.Goldstein and Stephan T.Kilpatrick的教科书Lewin's Genes XII(Jones and Bartlett Publishers，US，2018)或本领域其他地方找到。
另一种突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是Schwarzer和Pühler描述的(Bio/Technology 9,84-87(1991))，并由
Figure BDA0002141597560000091
等人进一步阐述(Gene145,69-73(1994))的基因置换方法。
Peters-Wendisch等人(Microbiology 144,915-927(1998))使用基因置换方法失活谷氨酸棒杆菌编码丙酮酸羧化酶的pyc基因。在US7585650中，将该方法应用于zwf基因以实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的氨基酸序列的位置321处的氨基酸交换。在US7754446中，将该方法应用于rel基因以实现GTP-焦磷酸激酶多肽的氨基酸序列的位置38处的氨基酸交换。
在基因置换方法中，通过包含所讨论的基因的核苷酸序列或其含有突变的部分的分离的多核苷酸提供突变，例如分别缺失、插入或取代至少一个核碱基或者一个或多个核碱基。
在本发明的背景中，所讨论的基因的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:1位置923至2812所示的核苷酸序列，其在位置氨基酸序列位置90处编码缬氨酸，在位置159处编码甘氨酸，在位置449处编码甘氨酸，且在位置454处编码丝氨酸(参见SEQ ID NO:2)。
在本发明的背景中，突变的优选形式包含以下核碱基取代：
-在编码SEQ ID NO:2的位置90处的氨基酸缬氨酸的密码子gtc(显示于SEQ IDNO:1的位置1190至1192)中，核碱基鸟嘌呤被腺嘌呤取代，得到编码位置90处的异亮氨酸的密码子atc(显示于SEQ ID NO:3的位置1190至1192)(SEQ ID NO:1的位置1190处的g→a取代)，
-在编码SEQ ID NO:2的位置159处的氨基酸甘氨酸的密码子ggg(显示于SEQ IDNO:1的位置1397至1399)中，SEQ ID NO:1的位置1397处的核碱基鸟嘌呤被腺嘌呤取代，得到编码位置159处的精氨酸的密码子agg(显示于SEQ ID NO:3的位置1397至1399)(SEQ IDNO:1的位置1397处的g→a取代)，
-在编码SEQ ID NO:2的位置449处的氨基酸甘氨酸的密码子ggt(显示于SEQ IDNO:1的位置2267至2269)中，SEQ ID NO:1的位置2268处的核碱基鸟嘌呤被腺嘌呤取代，得到编码位置449处的天冬氨酸的密码子gat(显示于SEQ ID NO:3的位置2267至2269)(SEQID NO:1的位置2268处的g→a取代)，和
-在编码SEQ ID NO:2的位置454处的氨基酸丝氨酸的密码子tcc(显示于SEQ IDNO:1的位置2282至2284)中，SEQ ID NO:1的位置2283处的核碱基胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，得到编码位置454处的苯丙氨酸的密码子ttc(显示于SEQ ID NO:3的位置2282至2284)(SEQID NO:1的位置2283处的c→t取代)。
包含所述核碱基取代的突变的结果是，获得SEQ ID NO:3位置923至2812所示的改变的编码序列，其在氨基酸序列位置90处编码异亮氨酸，在位置159处编码精氨酸，在位置446处编码天冬氨酸，且在位置454处编码苯丙氨酸(也参见SEQ ID NO:4)。
遗传密码的简并性在本领域中是熟知的。已知：
-异亮氨酸的密码子是ata、att和atc，
-精氨酸的密码子是cgt、cgc、cga和cgg，
-天冬氨酸的密码子是gat和gac，以及
-苯丙氨酸的密码子是ttt和ttc。
因此，本领域技术人员知道如何应用其他核碱基取代以获得SEQ ID NO:2的位置90、159、449和454处的氨基酸交换。
在通常术语中，所讨论的基因的突变的核苷酸序列或其含有突变的部分包含i)突变位点5'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为5'-侧翼序列或上游序列，ii)突变位点3'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为3'-侧翼序列或下游序列，和iii)i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。
同源重组所需的所述5'-侧翼序列和3'-侧翼序列通常具有至少200bp、至少400bp、至少600bp或至少800bp的长度。最大长度通常为1000bp、1500bp或2000bp。
在本发明的情况中，突变包含SEQ ID NO:1分布在位置1190至2283之间的编码序列的四个密码子中的核碱基取代。因此，如果需要具有至少400bp长度的侧翼序列，则突变的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3位置790至2683。如果需要具有至少600bp长度的侧翼序列，则突变的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3位置590至2883。如果需要具有至少800bp长度的侧翼序列，则突变的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3位置390至3083。如果需要具有至少1000bp长度的侧翼序列，则突变的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3位置190至3283。
将提供的突变的核苷酸序列克隆到不能在谷氨酸棒杆菌中自主复制的质粒载体(例如
Figure BDA0002141597560000111
等人(Gene 145,69-73(1994)所描述的pK18mobsacB)中。随后通过使用电穿孔的转化或接合将包含所述突变的核苷酸序列的所述质粒载体转移到所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。在两个同源重组事件(包含由质粒载体与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列提供的5'-侧翼序列内的重组事件，和由质粒载体与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列提供的3'-侧翼序列内的重组事件，其中一个产生所述质粒载体的整合，一个产生所述质粒载体的切除)之后，该突变掺入谷氨酸棒杆菌染色体中。因此，包含在所述所需菌株的染色体中的所讨论基因的核苷酸序列被突变的核苷酸序列置换。然后确认所需菌株中突变的存在，例如，通过如上所述的核苷酸序列分析或使用FRET的实时PCR。
同源重组事件也可称为交换(crossing over)。
优选本发明的方法提供的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株在合适的条件下在合适的培养基中具有分泌≥0.25g/l，优选≥0.5g/l，特别优选≥1.0g/l，非常特别优选≥2.0g/l的L-赖氨酸的能力。
在根据本发明的发酵方法中，根据本发明修饰并具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌在合适的条件下在合适的培养基中培养。由于分泌所述L-赖氨酸的所述能力，L-赖氨酸的浓度在发酵方法过程中在培养基中增加并积累，从而生产L-赖氨酸。
发酵方法可以是不连续方法如分批方法或补料分批方法，或连续方法。关于发酵方法的一般性质的总结可在H.Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik，SpektrumAkademischer Verlag，2011)，C.Ratledge和B.Kristiansen的教科书(BasicBiotechnology，Cambridge University Press，2006)或在V.C.Hass和R.
Figure BDA0002141597560000121
的教科书(Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag,2011)中找到。
用于通过发酵方法生产L-赖氨酸的合适培养基含有碳源、氮源、磷源、无机离子和其他所需的有机化合物。
合适的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖以及相应的原料如淀粉水解产物、糖蜜或高果糖玉米糖浆。
可以使用有机含氮化合物如蛋白胨、肉提取物、大豆水解产物或尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨气或氨水作为氮源。
可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。
无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其它微量元素等，以硫酸、磷酸或盐酸的盐提供。
其他有机化合物是指必需的生长因子如维生素，例如硫胺素或生物素，或L-氨基酸例如L-高丝氨酸。
培养基组分可以以单批的形式加入培养物中，或在培养过程中以合适的方式补料。
在发酵方法过程中，培养物的pH可以以合适的方式通过使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。通常将pH的值调节至6.0至8.5，优选6.5至8.0。为了控制发泡，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，例如抗生素。发酵方法优选在需氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。在适当的情况下，在升高的压力(例如在0.03-0.2MPa的升高的压力)进行发酵方法。培养物温度通常为25℃至40℃，优选30℃至37℃。在不连续方法中，继续培养直至形成足以回收的L-赖氨酸的量。然后完成培养。这个目标通常在10小时到160小时内完成。在连续方法中，更长的培养时间是可能的。
合适的培养基和培养条件的实例尤其可以在L.Egegeling和M.Bott(Handbook ofCorynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)的文章和专利文献US5770409、US5990350、US 5275940、US5763230和US6025169中找到。
因此，发酵方法产生含有所需L-赖氨酸的发酵液。
然后将含有L-赖氨酸的产物从发酵液中以液体或固体形式回收或制备。
“发酵液”是指培养基，在其中培养本发明所述的谷氨酸棒杆菌一定时间并在某些条件下培养。
当发酵方法完成时，所得的发酵液因此包含：
a)本发明的谷氨酸棒杆菌的生物质(细胞团)，所述生物质是由于所述谷氨酸棒杆菌的细胞的繁殖而产生的，
b)在发酵方法过程中积累的所需的L-赖氨酸，
c)在发酵方法过程中积累的有机副产物，和
d)在发酵方法中所使用的培养基未被消耗的组分。
有机副产物包括在发酵方法过程中可由本发明的谷氨酸棒杆菌形成的除了产生L-赖氨酸外的化合物。
从培养容器或发酵罐中移出发酵液，在适当时收集，并用于提供液体或固体形式的含有L-赖氨酸的产物。表述“回收含L-赖氨酸的产物”也用于此。在最简单的情况下，已从发酵罐中移出的含L-赖氨酸的发酵液本身构成回收的产物。
本领域可获得关于措施a)、b)、c)和d)的大量技术指导。
除去水(措施a))尤其可以通过蒸发(例如使用降膜蒸发器)、通过反渗透或纳滤来实现。由此获得的浓缩物可以通过喷雾干燥或喷雾造粒进一步处理。同样可以使用喷雾干燥或喷雾造粒直接干燥发酵液。
因此，根据本发明的方法包括从所述发酵液中提取或基本上消除水。特别地，从发酵液中提取至少40％(w/w)、优选至少90％(w/w)、更优选至少95％(w/w)的水。
除去生物质(措施b))尤其可以通过离心、过滤或倾析或其组合来实现。
除去有机副产物(措施c))或除去培养基的残余组分(措施d)尤其可以通过色谱(例如离子交换色谱)、用活性炭处理或结晶来实现。如果培养基的有机副产物或残余组分以固体存在于发酵液中，则可通过措施b)除去它们。
因此，根据本发明的L-赖氨酸产物的制备包含纯化步骤，优选选自离子交换色谱、用活性炭处理或结晶。
因此可获得例如含有L-赖氨酸×HCl的产物，优选含有≥80％L-赖氨酸×HCl，特别优选≥90％L-赖氨酸×HCl或≥95％L-赖氨酸×HCl。
关于分离、纯化和造粒方法的一般说明尤其可以在R.Ghosh的书“Principles ofBioseperation Engineering”(World Scientific Publishing，2006)，F.J.Dechow的书“Seperation and Purification Techniques in Biotechnology”(Noyes Publications,1989)，Shaeiwitz等人的文章“Bioseparation”(Ullmann's Encyclopedia of IndustrialChemistry，Wiley-VCH，2012)和P.Serno等人的书“Granulieren”(Editio Cantor Verlag，2007)中找到。
L-赖氨酸产物的下游加工方案可以在R.Kelle等人的文章“L-lysineProduction”(L.Eggeling and M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRCPress,2005))中找到。US5279744教导了通过离子交换色谱制备纯化的L-赖氨酸产物。US5431933教导了干燥L-氨基酸产物(例如L-赖氨酸产物)的制备，其含有发酵液的大部分成分。
因此，实现了L-赖氨酸的浓缩或纯化，并提供了具有所需含量的所述L-赖氨酸的产物。
可以通过利用离子交换色谱，优选阳离子交换色谱分离L-赖氨酸，随后使用茚三酮进行柱后衍生来进行L-赖氨酸的分析以测定其在发酵过程中的一个或多个时间的浓度，如Spackman等人所述(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生。关于离子交换色谱的概述文章可以在Pickering(LC.GC(Magazine of Chromatographic Science 7(6)：484-487(1989))中找到。同样可以进行柱前衍生，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，并可以通过反相色谱法(RP)(优选以高效液相色谱法(HPLC)的形式)分馏所得的氨基酸衍生物。这种类型的方法描述于例如Lindroth等人(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))的文章。通过光度测定(吸收，荧光)进行检测。关于氨基酸分析的综述尤其可以在Lottspeich和Zorbas的教科书“Bioanalytik”(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany 1998)中找到。
实验部分
A)材料和方法
本文简要描述了所用的分子生物学试剂盒、引物和化学品以及所应用方法的一些细节。
1.抗生素和化学品
a.卡那霉素：来自Sigma Aldrich的卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)的卡那霉素溶液(St.Louis，USA，目录号K0254)。
b.萘啶酮酸：来自Sigma Aldrich的萘啶酮酸钠盐(St.Louis，USA，目录号N4382)。
c如果没有另外说明，则所有化学品均是购自Merck(Darmstadt，Germany)，SigmaAldrich(St.Louis，USA)或Carl-Roth(Karlsruhe，Germany)的分析纯。
2.培养
如果没有另外说明，则所有培养/温育程序如下进行：
a.来自Merck的LB培养液(MILLER)(Darmstadt,Germany；目录号110285)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/有3个挡板(baffle)的100ml Erlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养摇床中以37℃和200rpm温育。
b.来自Merck的LB琼脂(MILLER)(Darmstadt,Germany目录号110283)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。将琼脂平板于37℃在来自VWR(Radnor，USA)的INCU-小型培养箱中温育。
c.来自Merck的脑心浸液培养液(BHI)(Darmstadt,Germany；目录号110493)用于在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养摇床中以33℃和200rpm温育。
d.来自Merck的脑心琼脂(BHI-琼脂)(Darmstadt,Germany；目录号113825)用于在琼脂平板上培养谷氨酸棒杆菌菌株。将琼脂平板于33℃在具有
Figure BDA0002141597560000162
温度控制器(Hanau，Germany)的来自Heraeus Instruments的培养箱中温育。
3.测定光密度
a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，Germany)的BioPhotometer在600nm测定摇瓶培养物中细菌悬浮液的光密度(OD600)。
b.使用来自Tecan Group AG(
Figure BDA0002141597560000163
Switzerland)的GENiosTM酶标仪在660nm测定Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24孔板)中产生的细菌悬浮液的光密度(OD660)。
4.离心
a.用于体积多达2ml的反应管的台式离心机
使用Eppendorf 5417R离心机，使用1ml或2ml反应管(例如Eppendorf
Figure BDA0002141597560000164
3810X)使最大体积为2ml的细菌悬浮液沉淀(13,000rpm离心5分钟)。
b.用于体积多达50ml的管的台式离心机
使用Eppendorf 5810R离心机，使用15ml或50ml离心管(例如FalconTM50ml锥形离心管)，以4000rpm离心10分钟，使最大体积为50ml的细菌悬浮液沉淀。
5.聚合酶链反应(PCR)
在Sanger测序之前，使用具有校正(高保真)聚合酶的PCR扩增所需的DNA区段。
a.根据制造商的说明书使用来自New England BioLabs Inc.的高保真DNA聚合酶试剂盒(NEB Phusion Kit)(Ipswich,USA；目录号M0530)对所选DNA区域进行模板校正扩增(见表2)。
表2：使用来自NEB Inc.的高保真DNA聚合酶试剂盒进行PCR的热循环条件
Figure BDA0002141597560000171
b.引物
使用的寡核苷酸由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，Germany)使用McBride和Caruthers描述的亚磷酰胺方法(Tetrahedron Lett.24,245-248,1983)合成。
c.模板
使用从谷氨酸棒杆菌液体培养物分离的质粒DNA或分离的总DNA的适当稀释溶液，或菌落中含有的总DNA(菌落PCR)作为PCR模板。对于所述菌落PCR，通过用牙签挑取来自琼脂平板上的菌落的细胞材料并将细胞材料直接放入PCR反应管中来制备模板。将细胞材料在来自SEVERIN
Figure BDA0002141597560000174
GmbH(Sundern，Germany)的微波炉型号Mikrowave&Grill用800W加热10秒，然后将PCR试剂加入到PCR反应管中的模板中。
d.PCR循环仪
PCR在来自Eppendorf AG(Hamburg，Germany)的PCR循环仪类型Mastercycler或Mastercycler nexus gradient中进行。
6.使用FRET检测突变
给定突变(例如核碱基交换)的存在通过实时PCR联用FRET杂交探针检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。使用来自Roche
Figure BDA0002141597560000175
的Lightcycler作为实时PCR仪器(见下文)。
这种方法被例如M.J.Lay和C.T.Wittwer(Clinical Chemistry 42(12),2262-2267(1997))用于因子V Leiden的基因型分型。Cyril DS Mamotte(The ClinicalBiochemist Reviews 27,63-75(2006))综述了使用这种方法进行单核苷酸取代的基因型分型。关于这种方法的总结可以在Jocelyn E.Krebs，Elliott S.Goldstein和StephanT.Kilpatrick的教科书Lewin's Genes XII(Jones and Bartlett Publishers，US，2018)，W.Edward Highsmith的Molecular Diagnostics,12Tests that changed everything(Humana Press，Springer，New York，2014)或本领域其他地方找到。
FRET杂交供体探针用荧光染料荧光素标记，受体探针用荧光染料LC-Red640标记。实质上，检测方法包括三个步骤：菌落PCR，探针杂交和随后的解链曲线分析。该方法在此简称为实时PCR。
a.引物和探针
使用的寡核苷酸由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，Germany)合成。
b.模板
使用菌落中含有的总DNA作为PCR模板。它是通过用牙签从琼脂平板上的菌落挑取细胞材料并将细胞材料直接放入PCR反应管中来制备的。将细胞材料在来自SEVERIN
Figure BDA0002141597560000182
GmbH(Sundern，Germany)的微波炉型号Mikrowave&Grill中用800W加热10秒，然后将PCR试剂加入到PCR反应管中的模板中。
e.反应混合物
来自Qiagen的Type-Fast SNP探针PCR试剂盒(Type-it Kit)(Hilden，Germany，目录号206045)用于实时检测突变。因此，将2.5μl的Qiagen Fast SNP Puffer(2x)与0.5μl的每种LC-PCR-引物[10μM]和0.5μl的每种以1：500稀释的受体和供体探针[100pmol/μl]混合获得实时PCR的mastermix。表3：使用Light(步骤1-3)和解链曲线分析(步骤4-6)进行PCR的热循环条件。
Figure BDA0002141597560000181
Figure BDA0002141597560000191
f.PCR循环仪
反应在Light
Figure BDA0002141597560000192
2.0仪器中进行，并用Roche Diagnostics(Rotkreuz，Switzerland)的Light
Figure BDA0002141597560000193
软件4.1分析。
7.大肠杆菌的化学转化
大肠杆菌K-12菌株S17-1用作从大肠杆菌到谷氨酸棒杆菌结合转移基于pK18mobsacB的质粒的供体。Simon,R.等人描述了菌株S17-1(Bio/Technology 1,784-794,1983)。它可从美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC47055获得。
化学感受态大肠杆菌S17-1细胞如下制备：用100μl菌株S17-1的细菌悬浮液接种10ml LB培养基(10ml液体培养基/有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)的预培养物，并将培养物在37℃和250rpm温育过夜约18小时。用300μl预培养物接种主培养物(有3个挡板的250ml Erlenmeyer烧瓶中含有的70ml LB)，并在37℃温育至OD600为0.5-0.8。将培养物以4℃和4000rpm离心6分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于20ml无菌冰冷的50mM CaCl2溶液中并在冰上温育30分钟。在另一次离心步骤后，将沉淀重悬于5ml冰冷的50mM CaCl2溶液中并将悬浮液在冰上温育30分钟。然后将细胞悬浮液用85％(v/v)无菌冰冷甘油调节至终浓度为20％甘油(v/v)。将悬浮液分成50μl等分试样并储存在-80℃。
为了转化S17-1细胞，使用根据Tang等人的方案(Nucleic Acids Res.22(14),2857-2858,1994)，热休克45秒。
8.谷氨酸棒杆菌的接合
Figure BDA0002141597560000195
等人描述的pK18mobsacB质粒系统(Gene 145,69-73,1994)用于将所需的DNA片段整合到谷氨酸棒杆菌的染色体中。
Figure BDA0002141597560000194
等人的修饰的接合方法(Journal ofBacteriology 172,1663-1666,1990)用于将各个质粒转移到所需的谷氨酸棒杆菌受体菌株中。
谷氨酸棒杆菌菌株的液体培养在BHI培养基中于33℃进行。热休克在48.5℃进行9分钟。通过将接合批次铺板在EM8琼脂(表4)上来选择转移接合子(transconjugant)，所述EM8琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将EM8琼脂平板在33℃温育72小时。
表4：EM8琼脂的组成
组分 浓度(g/l)
葡萄糖(无菌过滤) 23
CSL(玉米浆；Roquette；固体含量48±2％w/w) 30
豆粕蛋白胨(Merck,Germany) 40
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8
尿素 3
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 4
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.5
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.01
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.001
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.01
泛酸钙,D(+) 0.01
硫胺素 0.001
肌醇 0.1
烟酸 0.001
生物素(无菌过滤) 0.005
CaCO<sub>3</sub>(单独高压灭菌) 1.6
Agar-Agar(Merck,Germany) 14
使用无菌牙签将转移接合子转移到BHI琼脂上，该琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将琼脂平板在33℃温育20小时。然后将以这种方式产生的各个转移接合子的培养物在33℃于有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中含有的10ml BHI培养基中进一步繁殖24小时。从适当稀释的液体培养物中取出等分试样并在补充有10％蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将琼脂平板在33℃温育48小时。然后检查在含蔗糖琼脂平板上生长的菌落的表型卡那霉素敏感性。为此，使用牙签从菌落中移出细胞材料并将其转移到含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上，以及转移到含有10％蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃温育60小时。利用实时PCR，检查证明对卡那霉素敏感并对蔗糖具有抗性的克隆中所需DNA片段的整合。
9.测定核苷酸序列
使用Sanger等人的双脱氧链终止法(Proceedings of the National Academy ofSciences USA 74,5463-5467,1977)，通过循环测序，由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，Germany)在Applied
Figure BDA0002141597560000211
(Carlsbad，CA，USA)3730xl DNA分析仪上测定DNA分子的核苷酸序列。使用来自Scientific&Educational Software(Denver，USA)的Clonemanager Professional9软件用于可视化和评估序列。
10.大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油原液
为了大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的长时间储存，制备甘油原液。将选择的大肠杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养。将选择的谷氨酸棒杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的2倍浓缩BHI培养基中培养。用50mg/l卡那霉素补充含质粒的大肠杆菌菌株的培养物。用25mg/l卡那霉素补充含质粒的谷氨酸棒杆菌菌株的培养物。将培养基装在有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用取自菌落的一环细胞接种，且培养物在大肠杆菌的情况下在37℃和200rpm温育约18小时，在谷氨酸棒杆菌的情况下在33℃和200rpm温育约18小时。在所述温育期后，向培养物中加入1.2ml 85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含甘油的细胞悬浮液等分成2ml部分，并储存在-80℃。
11.根据Wouter Duetz(WDS)的培养系统
根据Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升级培养系统用于研究构建的谷氨酸棒杆菌菌株的性能。为此目的，使用来自EnzyScreen BV的24深孔微孔板(24孔WDS板)(Heemstede,Netherlands；目录号CR1424)，其填充有2.5mL培养基。
菌株的预培养在10ml的2倍浓缩BHI培养基中进行。将培养基装在有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用100μl甘油原液培养物接种，并将培养物在33℃和200rpm温育24小时。
在所述温育期后，测定预培养物的光密度OD600。
通过用预培养物的等分试样接种24孔WDS板的含2.5ml培养基的孔使得光密度OD600为0.1来制作主培养物。
使用如Keilhauer等人描述的CGXII培养基(J.Bacteriol.1993Sep；175(17)：5595-5603)的主培养培养基。为方便起见，CGXII培养基的组成如表5所示。
表5：Keilhauer的CGXII培养基的组成。
组分 浓度(g/l)
MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸) 42
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 20
尿素 5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.25
CaCl<sub>2</sub> 0.01
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.01
MnSO<sub>4</sub>H<sub>2</sub>O 0.01
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.001
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.0002
NiCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O 0.00002
生物素(无菌过滤) 0.0002
原儿茶酸(无菌过滤) 0.03
碳源(无菌过滤) 根据需要
用NaOH调节pH至7
将这些主培养物在来自Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HTMultitron标准培养摇床中于33℃和300rpm温育约45小时，直至葡萄糖完全消耗。
用来自LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany)的血糖仪OneTouch
Figure BDA0002141597560000221
分析悬浮液中的葡萄糖浓度。
培养后，将培养物悬浮液转移到深孔微孔板中。适当稀释一部分培养物悬浮液以测量OD600。将培养物的另一部分离心，并分析上清液中的L-氨基酸，特别是L-赖氨酸和残余葡萄糖的浓度。
12.氨基酸分析仪
使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，Germany)的SYKAM S433氨基酸分析仪，通过离子交换色谱测定培养物上清液中的L-赖氨酸和其他L-氨基酸(例如L-缬氨酸)的浓度。使用来自SYKAM的具有球形聚苯乙烯基阳离子交换剂的柱(Peek LCA N04/Na，尺寸150×4.6mm)作为固定相。取决于L-氨基酸，使用用于洗脱的缓冲液A和B的混合物进行等度(isocratic)运行以进行分离，或使用所述缓冲液通过梯度洗脱进行分离。使用20l含有263g柠檬酸三钠、120g柠檬酸、1100ml甲醇，100ml 37％HCl和2ml辛酸的水性溶液(最终pH 3.5)作为缓冲液A。使用20l含有392g柠檬酸三钠、100g硼酸和2ml辛酸的水溶液(最终pH 10.2)作为缓冲液B。通过柱后衍生用茚三酮使游离氨基酸着色，并在570nm处用光度法检测。
13.用连续流动系统(CFS)测定葡萄糖
使用来自SKALAR analytic GmbH(Erkelenz，Germany)的SANplus多通道连续流动分析仪测定上清液中葡萄糖的浓度。通过NADH形成用偶联酶测定(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶)检测葡萄糖。
B)实验结果
实施例1
谷氨酸棒杆菌菌株DM1933的NCgl1480*基因的序列
名称NCgl1480*中的“*”表示根据本发明，与在locus_tag NCgl1480下给出的信息相比，NCgl1480*的编码序列在5'末端包含编码26个额外氨基酸的序列(参见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。
菌株DM1933是Blombach等人描述的L-赖氨酸生产者(Applied andEnvironmental Microbiology 75(2),419-427,2009)。它根据布达佩斯条约在DSMZ以保藏号DSM25442保藏。
通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.，San Diego，CA，US)测定菌株DM1933的染色体的核苷酸序列。参见例如Benjak et al.(2015)Whole-Genome Sequencingfor Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly.In:Parish T.,Roberts D.(eds)Mycobacteria Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol 1285.HumanaPress,NY,US)和Bennet,S.(Pharmacogenomics 5(4),433-438,2004)。
发现菌株DM1933的NCgl1480*编码序列的核苷酸序列(包括其上游和下游的核苷酸序列)与SEQ ID NO:1中所示的ATCC13032的核苷酸序列相同。
DM1933在其染色体中含有编码反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体。所述反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽具有序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中氨基酸序列位置311处的氨基酸苏氨酸(Thr)被异亮氨酸(Ile)置换。在US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”用于表示所述交换。Blombach等人使用缩写“lysC(T311I)”。
实施例2
构建质粒pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut
构建质粒pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut以使导致氨基酸交换V90I、G159R、G449D和S454F的突变掺入菌株DM1933染色体的核苷酸序列中。该质粒基于
Figure BDA0002141597560000241
等人描述的可移动(mobilizable)载体pK18mobsacB(Gene 145,69-73,1994)。对于pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut的构建，由GeneArt(Thermo Fisher Scientific(Waltham，USA))合成SEQID NO:11所示的NCgl1480*_Mut序列并将其亚克隆到pK18mobsacB中。
为了组装质粒pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut，将两种多核苷酸，即用SbfI切割的载体pK18mobsacB和用SbfI切割的多核苷酸NCgl1480*_Mut连接，并使用连接混合物来转化合适的大肠杆菌菌株(Geneart；Thermo Fisher Scientific(Waltham，USA))。
从转化体中分离质粒pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut的DNA。
实施例3
菌株DM1933_NCgl1480*_Mut的构建
使用实施例2中获得的质粒pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut，将导致氨基酸交换V90I、G159R、G449D和S454F(参见SEQ ID NO:3的核苷酸位置1190、1397、2268和2283)的突变掺入L-赖氨酸生产者DM1933的染色体中。
用pK18mobsacB_NCgl1480*_Mut的质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1的化学感受态细胞。使用
Figure BDA0002141597560000242
等人(Journal of Bacteriology 172,1663-1666,1990)描述于材料和方法中的修饰的接合方法用于接合转移到菌株DM1933中，并且由于它们的蔗糖抗性和卡那霉素敏感性表型用于选择转移接合子克隆。
使用Type-it Kit通过两个单独的实时PCR分析转移接合子克隆，以检测导致氨基酸交换V90I和S454F的突变。为了检测导致氨基酸交换V90I的突变，使用用于PCR扩增的引物LC-NCgl1480_1和LC-NCgl1480_2以及用作解链曲线分析的受体探针的NCgl1480_90_C和供体探针的NCgl1480_90_A(表6)。为了检测导致氨基酸交换S454F的突变，使用用于PCR扩增的引物LC-NCgl1480_3和LC-NCgl1480_4以及用作解链曲线分析的受体探针的NCgl1480_454_C和供体探针的NCgl1480_454_A(表6)。
表6:实时PCR使用的引物和探针列表
1用LC-Red640在5’-端标记并在3’-端磷酸化的受体探针
2用荧光素在3’-端标记的供体探针
如此表征的转移接合子克隆之一称为DM1933_NCgl1480*_Mut。
通过Sanger测序分析含有突变核苷酸序列的菌株DM1933_NCg1480*_Mut的染色体区域的核苷酸序列。
为此目的，产生跨越突变位点的PCR扩增物。使用引物LC-NCgl1480_1和LC-NCgl1480_4(参见表6)和NEB Phusion Kit进行菌落PCR，延伸时间为45秒(表2，步骤4)。然后使用相同的引物(LC-NCgl1480_1和LC-NCg1480_4)对获得的扩增物进行测序。
在这种情况中使用的引物和探针的核苷酸序列(参见表6)也显示在序列表的SEQID NO:12至19中。
获得的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:20中。结果显示菌株DM1933_NCg1480*_Mut在其染色体中分别含有所有所需的突变或所需的突变核苷酸序列，产生氨基酸交换V90I、G159R、G449D和S454F。
制备转移接合子克隆的甘油原液培养物并用作进一步研究的起始材料。
实施例4
通过菌株DM1933_NCgl1480*_Mut生产L-赖氨酸
使用根据Wouter Duetz的培养系统，通过分批培养分析菌株DM1933(参考)和实施例3中获得的DM1933_NCgl1480*_Mut从葡萄糖生产L-赖氨酸的能力。
使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的培养基CGXII。将培养物温育45小时直至完全消耗葡萄糖，如通过使用血糖仪的葡萄糖分析所确认的，并测定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果如表7所示。
表7：菌株DM1933_NCgl1480*_Mut的L-赖氨酸生产。
Figure BDA0002141597560000261
1以L-赖氨酸×HCl
该实验显示，与亲本菌株DM1933相比，菌株DM1933_NCgl1480*_Mut中L-赖氨酸的生产增加。
序列表
<110> 赢创德固赛有限公司
<120> 发酵生产L-赖氨酸的方法
<130> file: 2018P00198EP
<140> EP18185087.6
<141> 2018-07-24
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3815
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(411)
<223> 3'-sequence of the cds of NCgl1481
<220>
<221> misc_feature
<222> (412)..(413)
<223> taa stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (565)..(565)
<223> nucleobase cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (585)..(585)
<223> nucleobase guanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (632)..(637)
<223> taatgt motif according to Pfeifer-Sancar et al.
<220>
<221> misc_feature
<222> (644)..(644)
<223> transcriptional start site according to Pfeifer-Sancar et al.
<220>
<221> CDS
<222> (923)..(2812)
<223> coding sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1001)..(2812)
<223> coding sequence according to NCgl1480
<220>
<221> misc_feature
<222> (1190)..(1192)
<223> gtc codon for valine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1397)..(1399)
<223> ggg codon for glycine
<220>
<221> misc_feature
<222> (2267)..(2269)
<223> ggt codon for glycine
<220>
<221> misc_feature
<222> (2282)..(2284)
<223> tcc codon for serine
<220>
<221> misc_feature
<222> (2813)..(2815)
<223> tag stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (2889)..(3815)
<223> 5'-sequence of the cds of NCgl1479
<400> 1
tttccgactt tggaaaaaga ccttattaat gttgtgacag atgcaaagga atcagatttt 60
ggatctttag gggtcgtgat tcttgatgaa actccagtga tgacttccaa cctgagggat 120
attgcgcagg agctgttgat tcaaacggat ctggacaccg ttgtggtgcg ggctccaatg 180
tcggctgcgg tggtgagtga tgttcattcg agggcggcgc ttgagtcagg gcagcatgat 240
ttgcttggga ccactgatta cgtgctggga acggagcttt tggtacagga tgtaacggaa 300
tcgacggtgg ggaatattga ttggggtcaa ttgctgattt gggggttggt tgctttggca 360
atcgccgtgg ttgttgcggg tgcgtctgtg cgtcgaaaag caatatcttt ataagtaaag 420
ttctaaagct ttacttatag cactttcggt aggtgtcgag aaaattccca aattgcggaa 480
aattcacata ctttgtgcca caaagtgata aacatcacaa aatttcatga ctcagccatt 540
catgcaggcc agaacatgca aaaccttgca cgctctggcc ttttgttatg taactgttgt 600
gaaagatgta tcaaaagtta ccaaggtgac ttaatgttca gatatcgact catgggttgt 660
tttccaaaac ttgaatcaat ttgagtaaca gtagttatca agcgttaaac cttgaaactt 720
ccactctttt tactgatggg catttgggca aacggggaag cttgctggag atgcaataaa 780
tcggtgaatg gttggtgcaa tgaagaggag agtggcccat agtttccgct acggaacgcg 840
gagtctttac gtttcaattc ttggcaagta tctagcgtca aggcttgata tgtgaaggga 900
ttcggattga acaggagaac at gtg gcc aat cta gat tca gtt cgc cct ggg 952
Met Ala Asn Leu Asp Ser Val Arg Pro Gly
1 5 10
gtg cgg gca gct ctt cga cgt acc cat acc cag gta aaa ggt gtc acg 1000
Val Arg Ala Ala Leu Arg Arg Thr His Thr Gln Val Lys Gly Val Thr
15 20 25
ttg acc agg gcg ttg att gcg ctt gca gta agc gga gct ttg ctt agt 1048
Leu Thr Arg Ala Leu Ile Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser
30 35 40
tcc atg act ccg gcg gtg gcg cag cca cag aat ccg gat gac gca gcc 1096
Ser Met Thr Pro Ala Val Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala
45 50 55
att gca cag gca gag gaa aat gtt tcg gcg ggc gat ggg gaa gtc gcc 1144
Ile Ala Gln Ala Glu Glu Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala
60 65 70
cgc ctg gca gga tct ttg tcc agc act gac gcg gaa att aac cgc gtc 1192
Arg Leu Ala Gly Ser Leu Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Val
75 80 85 90
gag ctg gaa atg ggt gct ctg cgt gaa gaa gtg aac aag tcc ctc gtg 1240
Glu Leu Glu Met Gly Ala Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val
95 100 105
gat ttg cat gat gcg cag gca atc gcc gag cag gcc cgc caa gat gca 1288
Asp Leu His Asp Ala Gln Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala
110 115 120
ctt gca gcc aag aag gat ctc gat gat tct caa gcg cag atc gaa gca 1336
Leu Ala Ala Lys Lys Asp Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala
125 130 135
gcc caa gag cgc ctt gat gag att tca cgt gca gcg tat cgc caa aac 1384
Ala Gln Glu Arg Leu Asp Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn
140 145 150
gga acc tcc aag ggg ctt tca ggc atc tcg ggc aat gga aat tct gaa 1432
Gly Thr Ser Lys Gly Leu Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu
155 160 165 170
gat gcg cta gat cgt cag act tac ctg cga acc agt gcg gaa aag cag 1480
Asp Ala Leu Asp Arg Gln Thr Tyr Leu Arg Thr Ser Ala Glu Lys Gln
175 180 185
cag gca gct gtt gaa gag ctt gat cgc ctc cgt acg gaa aac gcc aac 1528
Gln Ala Ala Val Glu Glu Leu Asp Arg Leu Arg Thr Glu Asn Ala Asn
190 195 200
aag gaa tcg gtg ttg cgc cag gcc cgc atc gtt gct gag cag cgt gag 1576
Lys Glu Ser Val Leu Arg Gln Ala Arg Ile Val Ala Glu Gln Arg Glu
205 210 215
gcg gaa gcc gtc gaa aag caa gtc cag acc gag gct gca att gcc gca 1624
Ala Glu Ala Val Glu Lys Gln Val Gln Thr Glu Ala Ala Ile Ala Ala
220 225 230
aac agc gag cag ctc aat gtc ttg act aac aat cgc agt acc ttg gtt 1672
Asn Ser Glu Gln Leu Asn Val Leu Thr Asn Asn Arg Ser Thr Leu Val
235 240 245 250
gcc cag cgt gat ggg gct gag cgc aac ttg gcc atc gct cgt gcg cag 1720
Ala Gln Arg Asp Gly Ala Glu Arg Asn Leu Ala Ile Ala Arg Ala Gln
255 260 265
gcg gat aat ctg caa ggt cag cgt gct gag tac gag gaa ttc cag cag 1768
Ala Asp Asn Leu Gln Gly Gln Arg Ala Glu Tyr Glu Glu Phe Gln Gln
270 275 280
gca gag cag gct cgc atc cag gcg gaa gcg gaa gct cag gct gct gcg 1816
Ala Glu Gln Ala Arg Ile Gln Ala Glu Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala
285 290 295
gag gag aag cgt cgt gcc gat gag gct gct gca cag gca gcc gct gaa 1864
Glu Glu Lys Arg Arg Ala Asp Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Glu
300 305 310
gct caa gaa gct gcc cag caa gct cag gcg gcg gag gaa gcc caa gcc 1912
Ala Gln Glu Ala Ala Gln Gln Ala Gln Ala Ala Glu Glu Ala Gln Ala
315 320 325 330
gcg caa gca gct gag aca gca caa gcc caa gcc gcg caa gct gcg gaa 1960
Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu
335 340 345
acc caa gct gca caa gcc gcg caa gct cag gca gaa gcg aat gat cgt 2008
Thr Gln Ala Ala Gln Ala Ala Gln Ala Gln Ala Glu Ala Asn Asp Arg
350 355 360
gcc gcc gcg caa cag cgt gct gca gag gct caa gca gca gcg gaa cag 2056
Ala Ala Ala Gln Gln Arg Ala Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln
365 370 375
gcg caa cgt gag gct gac gct cag gcg gcc aac gat gcc caa gct cag 2104
Ala Gln Arg Glu Ala Asp Ala Gln Ala Ala Asn Asp Ala Gln Ala Gln
380 385 390
gca ctg cgt gaa cag gcg ctc acc gca gcc tcc atc gct gcg gct gct 2152
Ala Leu Arg Glu Gln Ala Leu Thr Ala Ala Ser Ile Ala Ala Ala Ala
395 400 405 410
cta att gcg gcg agc cag tcc agc cat gcc act act caa aat cct tac 2200
Leu Ile Ala Ala Ser Gln Ser Ser His Ala Thr Thr Gln Asn Pro Tyr
415 420 425
cca act gat gaa gac gcg gat ccg acc gat att gcg gac atc caa ggc 2248
Pro Thr Asp Glu Asp Ala Asp Pro Thr Asp Ile Ala Asp Ile Gln Gly
430 435 440
cca acg cag cca ggt acg ggt gag tct gga gat tcc cag agc aac tcc 2296
Pro Thr Gln Pro Gly Thr Gly Glu Ser Gly Asp Ser Gln Ser Asn Ser
445 450 455
agc gac aac gat tcc aca ggc aac gat tcc aca ggc tct gac tct tca 2344
Ser Asp Asn Asp Ser Thr Gly Asn Asp Ser Thr Gly Ser Asp Ser Ser
460 465 470
gat tca gat tcc tcc ggc aac gat tct tca gag gtt att tcc ggc gat 2392
Asp Ser Asp Ser Ser Gly Asn Asp Ser Ser Glu Val Ile Ser Gly Asp
475 480 485 490
cgt tcc gct cag att gag act gtg att gcg cgc gcc atg agc cag ttg 2440
Arg Ser Ala Gln Ile Glu Thr Val Ile Ala Arg Ala Met Ser Gln Leu
495 500 505
ggt gtg cag tac gca tgg ggt ggc ggt aac gct aat ggc cca act ctg 2488
Gly Val Gln Tyr Ala Trp Gly Gly Gly Asn Ala Asn Gly Pro Thr Leu
510 515 520
ggt atc cgt gac ggt ggc gtg gcg gac tct tac ggc gat tac aac aag 2536
Gly Ile Arg Asp Gly Gly Val Ala Asp Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Lys
525 530 535
gtt ggc ttc gac tgc tct gga ctg acc ttg tat gcg ttt gcg ggt gtg 2584
Val Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu Thr Leu Tyr Ala Phe Ala Gly Val
540 545 550
gga att tca ctt cct cac tac acg ggc tac cag tac cag cac ggc acc 2632
Gly Ile Ser Leu Pro His Tyr Thr Gly Tyr Gln Tyr Gln His Gly Thr
555 560 565 570
aag gtg tcg cct tct gag atg caa cgt ggc gat ctg atc ttc tat ggt 2680
Lys Val Ser Pro Ser Glu Met Gln Arg Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly
575 580 585
ccg gga gcg tct cag cac gtg gca att tac ctc ggt gat ggt cag atg 2728
Pro Gly Ala Ser Gln His Val Ala Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Gln Met
590 595 600
att gag gct ccg aat tcg ggt tct gtc gtg aag att tct cct gtt cgc 2776
Ile Glu Ala Pro Asn Ser Gly Ser Val Val Lys Ile Ser Pro Val Arg
605 610 615
tgg agc gga atg acc gag agc gtg gta cgc ctc att tagtttcctc 2822
Trp Ser Gly Met Thr Glu Ser Val Val Arg Leu Ile
620 625 630
ctatgaatct tgatgtggtt catgcgtttt tatgcaatat caaccaaaag ttggtacgat 2882
cctcatatga atgaacgcac atcggatgca tttgacgccc tccttgtgct ctccttcggt 2942
ggtcccgaag ggcacgagga ggttcgtccg tttttggaga atgtcactca cggaaggggg 3002
attccgccgg aacgtctaga tgaagtggcg gttcattacc accacttcgg tggtatcagc 3062
cccatcaatg cgctgaacag ggaaattatc gccaatgtgg aaaaagaatt ggcgtctcgc 3122
gatcacaagc tgcctgttta ttttggtaac cgcaactgga agccgtttga taatgaggcc 3182
gctgaacaaa tggctgatga cggcgtgaaa aacgcgctgg tgttggcaac ttccgcttgg 3242
ggtggctact ccggttgtcg gcagtaccag gaagatattc agggcatgat caagcacctg 3302
gagtctcagg ggcagtcgat cacgttcacc aagctgcgtc agttctacga tcaccctcgt 3362
tttgtctcca ccatggctca attggttcag gattcctacg cgaagcttcc cgatgagctg 3422
cgagatgagg cgcgtctggt cttcaccgcg cactccattc cactgactgc ggacaatgct 3482
gcgggaaccc ctgaggatgg ctccttgtat tccacacagg tcaaggaagc gtcagcactg 3542
attgctgagg ctgttggtgt gtcagatttt gatgtggtgt ggcagtcccg ctcgggtagc 3602
ccgcacactc cgtggctgga gcctgacatc gtggatcacg cagtggagct caacgagaag 3662
ggtcaaaaag cgctcgttgt ctgccctgta ggctttattt ctgatcatat ggaagtcatt 3722
tgggatcttg attccgagct gatggaagaa gccgagaagc gcaacatggt ggtcgagcgt 3782
gtcgctaccg ttggccccac cgatgaattc gca 3815
<210> 2
<211> 630
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<400> 2
Met Ala Asn Leu Asp Ser Val Arg Pro Gly Val Arg Ala Ala Leu Arg
1 5 10 15
Arg Thr His Thr Gln Val Lys Gly Val Thr Leu Thr Arg Ala Leu Ile
20 25 30
Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser Ser Met Thr Pro Ala Val
35 40 45
Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala Ile Ala Gln Ala Glu Glu
50 55 60
Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala Arg Leu Ala Gly Ser Leu
65 70 75 80
Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Val Glu Leu Glu Met Gly Ala
85 90 95
Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val Asp Leu His Asp Ala Gln
100 105 110
Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala Leu Ala Ala Lys Lys Asp
115 120 125
Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala Ala Gln Glu Arg Leu Asp
130 135 140
Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn Gly Thr Ser Lys Gly Leu
145 150 155 160
Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu Asp Ala Leu Asp Arg Gln
165 170 175
Thr Tyr Leu Arg Thr Ser Ala Glu Lys Gln Gln Ala Ala Val Glu Glu
180 185 190
Leu Asp Arg Leu Arg Thr Glu Asn Ala Asn Lys Glu Ser Val Leu Arg
195 200 205
Gln Ala Arg Ile Val Ala Glu Gln Arg Glu Ala Glu Ala Val Glu Lys
210 215 220
Gln Val Gln Thr Glu Ala Ala Ile Ala Ala Asn Ser Glu Gln Leu Asn
225 230 235 240
Val Leu Thr Asn Asn Arg Ser Thr Leu Val Ala Gln Arg Asp Gly Ala
245 250 255
Glu Arg Asn Leu Ala Ile Ala Arg Ala Gln Ala Asp Asn Leu Gln Gly
260 265 270
Gln Arg Ala Glu Tyr Glu Glu Phe Gln Gln Ala Glu Gln Ala Arg Ile
275 280 285
Gln Ala Glu Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Lys Arg Arg Ala
290 295 300
Asp Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Glu Ala Gln Glu Ala Ala Gln
305 310 315 320
Gln Ala Gln Ala Ala Glu Glu Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr
325 330 335
Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Gln Ala Ala Gln Ala
340 345 350
Ala Gln Ala Gln Ala Glu Ala Asn Asp Arg Ala Ala Ala Gln Gln Arg
355 360 365
Ala Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Gln Arg Glu Ala Asp
370 375 380
Ala Gln Ala Ala Asn Asp Ala Gln Ala Gln Ala Leu Arg Glu Gln Ala
385 390 395 400
Leu Thr Ala Ala Ser Ile Ala Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ala Ser Gln
405 410 415
Ser Ser His Ala Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Pro Thr Asp Glu Asp Ala
420 425 430
Asp Pro Thr Asp Ile Ala Asp Ile Gln Gly Pro Thr Gln Pro Gly Thr
435 440 445
Gly Glu Ser Gly Asp Ser Gln Ser Asn Ser Ser Asp Asn Asp Ser Thr
450 455 460
Gly Asn Asp Ser Thr Gly Ser Asp Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ser Gly
465 470 475 480
Asn Asp Ser Ser Glu Val Ile Ser Gly Asp Arg Ser Ala Gln Ile Glu
485 490 495
Thr Val Ile Ala Arg Ala Met Ser Gln Leu Gly Val Gln Tyr Ala Trp
500 505 510
Gly Gly Gly Asn Ala Asn Gly Pro Thr Leu Gly Ile Arg Asp Gly Gly
515 520 525
Val Ala Asp Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Lys Val Gly Phe Asp Cys Ser
530 535 540
Gly Leu Thr Leu Tyr Ala Phe Ala Gly Val Gly Ile Ser Leu Pro His
545 550 555 560
Tyr Thr Gly Tyr Gln Tyr Gln His Gly Thr Lys Val Ser Pro Ser Glu
565 570 575
Met Gln Arg Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gln His
580 585 590
Val Ala Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Gln Met Ile Glu Ala Pro Asn Ser
595 600 605
Gly Ser Val Val Lys Ile Ser Pro Val Arg Trp Ser Gly Met Thr Glu
610 615 620
Ser Val Val Arg Leu Ile
625 630
<210> 3
<211> 3815
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(411)
<223> 3'-sequence of the cds of NCgl1481
<220>
<221> misc_feature
<222> (412)..(414)
<223> taa stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (565)..(565)
<223> nucleobase thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (585)..(585)
<223> nucleobase guanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (632)..(637)
<223> taatgt motif according to Pfeifer-Sancar et al.
<220>
<221> misc_feature
<222> (644)..(644)
<223> transcriptional start site according to Pfeifer-Sancar et al.
<220>
<221> CDS
<222> (923)..(2812)
<223> coding sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1001)..(2812)
<223> coding sequence of a variant of NCgl1480
<220>
<221> misc_feature
<222> (1190)..(1192)
<223> atc codon for isoleucine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1397)..(1399)
<223> agg codon for arginine
<220>
<221> misc_feature
<222> (2267)..(2269)
<223> gat codon for aspartic acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (2282)..(2284)
<223> ttc codon for phenylalanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (2813)..(2815)
<223> tag stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (2889)..(3815)
<223> 5'-sequence of the cds of NCgl1479
<400> 3
tttccgactt tggaaaaaga ccttattaat gttgtgacag atgcaaagga atcagatttt 60
ggatctttag gggtcgtgat tcttgatgaa actccagtga tgacttccaa cctgagggat 120
attgcgcagg agctgttgat tcaaacggat ctggacaccg ttgtggtgcg ggctccaatg 180
tcggctgcgg tggtgagtga tgttcattcg agggcggcgc ttgagtcagg gcagcatgat 240
ttgcttggga ccactgatta cgtgctggga acggagcttt tggtacagga tgtaacggaa 300
tcgacggtgg ggaatattga ttggggtcaa ttgctgattt gggggttggt tgctttggca 360
atcgccgtgg ttgttgcggg tgcgtctgtg cgtcgaaaag caatatcttt ataagtaaag 420
ttctaaagct ttacttatag cactttcggt aggtgtcgag aaaattccca aattgcggaa 480
aattcacata ctttgtgcca caaagtgata aacatcacaa aatttcatga ctcagccatt 540
catgcaggcc agaacatgca aaactttgca cgctctggcc ttttgttatg taactgttgt 600
gaaagatgta tcaaaagtta ccaaggtgac ttaatgttca gatatcgact catgggttgt 660
tttccaaaac ttgaatcaat ttgagtaaca gtagttatca agcgttaaac cttgaaactt 720
ccactctttt tactgatggg catttgggca aacggggaag cttgctggag atgcaataaa 780
tcggtgaatg gttggtgcaa tgaagaggag agtggcccat agtttccgct acggaacgcg 840
gagtctttac gtttcaattc ttggcaagta tctagcgtca aggcttgata tgtgaaggga 900
ttcggattga acaggagaac at gtg gcc aat cta gat tca gtt cgc cct ggg 952
Met Ala Asn Leu Asp Ser Val Arg Pro Gly
1 5 10
gtg cgg gca gct ctt cga cgt acc cat acc cag gta aaa ggt gtc acg 1000
Val Arg Ala Ala Leu Arg Arg Thr His Thr Gln Val Lys Gly Val Thr
15 20 25
ttg acc agg gcg ttg att gcg ctt gca gta agc gga gct ttg ctt agt 1048
Leu Thr Arg Ala Leu Ile Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser
30 35 40
tcc atg act ccg gcg gtg gcg cag cca cag aat ccg gat gac gca gcc 1096
Ser Met Thr Pro Ala Val Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala
45 50 55
att gca cag gca gag gaa aat gtt tcg gcg ggc gat ggg gaa gtc gcc 1144
Ile Ala Gln Ala Glu Glu Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala
60 65 70
cgc ctg gca gga tct ttg tcc agc act gac gcg gaa att aac cgc atc 1192
Arg Leu Ala Gly Ser Leu Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Ile
75 80 85 90
gag ctg gaa atg ggt gct ctg cgt gaa gaa gtg aac aag tcc ctc gtg 1240
Glu Leu Glu Met Gly Ala Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val
95 100 105
gat ttg cat gat gcg cag gca atc gcc gag cag gcc cgc caa gat gca 1288
Asp Leu His Asp Ala Gln Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala
110 115 120
ctt gca gcc aag aag gat ctc gat gat tct caa gcg cag atc gaa gca 1336
Leu Ala Ala Lys Lys Asp Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala
125 130 135
gcc caa gag cgc ctt gat gag att tca cgt gca gcg tat cgc caa aac 1384
Ala Gln Glu Arg Leu Asp Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn
140 145 150
gga acc tcc aag agg ctt tca ggc atc tcg ggc aat gga aat tct gaa 1432
Gly Thr Ser Lys Arg Leu Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu
155 160 165 170
gat gcg cta gat cgt cag act tac ctg cga acc agt gcg gaa aag cag 1480
Asp Ala Leu Asp Arg Gln Thr Tyr Leu Arg Thr Ser Ala Glu Lys Gln
175 180 185
cag gca gct gtt gaa gag ctt gat cgc ctc cgt acg gaa aac gcc aac 1528
Gln Ala Ala Val Glu Glu Leu Asp Arg Leu Arg Thr Glu Asn Ala Asn
190 195 200
aag gaa tcg gtg ttg cgc cag gcc cgc atc gtt gct gag cag cgt gag 1576
Lys Glu Ser Val Leu Arg Gln Ala Arg Ile Val Ala Glu Gln Arg Glu
205 210 215
gcg gaa gcc gtc gaa aag caa gtc cag acc gag gct gca att gcc gca 1624
Ala Glu Ala Val Glu Lys Gln Val Gln Thr Glu Ala Ala Ile Ala Ala
220 225 230
aac agc gag cag ctc aat gtc ttg act aac aat cgc agt acc ttg gtt 1672
Asn Ser Glu Gln Leu Asn Val Leu Thr Asn Asn Arg Ser Thr Leu Val
235 240 245 250
gcc cag cgt gat ggg gct gag cgc aac ttg gcc atc gct cgt gcg cag 1720
Ala Gln Arg Asp Gly Ala Glu Arg Asn Leu Ala Ile Ala Arg Ala Gln
255 260 265
gcg gat aat ctg caa ggt cag cgt gct gag tac gag gaa ttc cag cag 1768
Ala Asp Asn Leu Gln Gly Gln Arg Ala Glu Tyr Glu Glu Phe Gln Gln
270 275 280
gca gag cag gct cgc atc cag gcg gaa gcg gaa gct cag gct gct gcg 1816
Ala Glu Gln Ala Arg Ile Gln Ala Glu Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala
285 290 295
gag gag aag cgt cgt gcc gat gag gct gct gca cag gca gcc gct gaa 1864
Glu Glu Lys Arg Arg Ala Asp Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Glu
300 305 310
gct caa gaa gct gcc cag caa gct cag gcg gcg gag gaa gcc caa gcc 1912
Ala Gln Glu Ala Ala Gln Gln Ala Gln Ala Ala Glu Glu Ala Gln Ala
315 320 325 330
gcg caa gca gct gag aca gca caa gcc caa gcc gcg caa gct gcg gaa 1960
Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu
335 340 345
acc caa gct gca caa gcc gcg caa gct cag gca gaa gcg aat gat cgt 2008
Thr Gln Ala Ala Gln Ala Ala Gln Ala Gln Ala Glu Ala Asn Asp Arg
350 355 360
gcc gcc gcg caa cag cgt gct gca gag gct caa gca gca gcg gaa cag 2056
Ala Ala Ala Gln Gln Arg Ala Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln
365 370 375
gcg caa cgt gag gct gac gct cag gcg gcc aac gat gcc caa gct cag 2104
Ala Gln Arg Glu Ala Asp Ala Gln Ala Ala Asn Asp Ala Gln Ala Gln
380 385 390
gca ctg cgt gaa cag gcg ctc acc gca gcc tcc atc gct gcg gct gct 2152
Ala Leu Arg Glu Gln Ala Leu Thr Ala Ala Ser Ile Ala Ala Ala Ala
395 400 405 410
cta att gcg gcg agc cag tcc agc cat gcc act act caa aat cct tac 2200
Leu Ile Ala Ala Ser Gln Ser Ser His Ala Thr Thr Gln Asn Pro Tyr
415 420 425
cca act gat gaa gac gcg gat ccg acc gat att gcg gac atc caa ggc 2248
Pro Thr Asp Glu Asp Ala Asp Pro Thr Asp Ile Ala Asp Ile Gln Gly
430 435 440
cca acg cag cca ggt acg gat gag tct gga gat ttc cag agc aac tcc 2296
Pro Thr Gln Pro Gly Thr Asp Glu Ser Gly Asp Phe Gln Ser Asn Ser
445 450 455
agc gac aac gat tcc aca ggc aac gat tcc aca ggc tct gac tct tca 2344
Ser Asp Asn Asp Ser Thr Gly Asn Asp Ser Thr Gly Ser Asp Ser Ser
460 465 470
gat tca gat tcc tcc ggc aac gat tct tca gag gtt att tcc ggc gat 2392
Asp Ser Asp Ser Ser Gly Asn Asp Ser Ser Glu Val Ile Ser Gly Asp
475 480 485 490
cgt tcc gct cag att gag act gtg att gcg cgc gcc atg agc cag ttg 2440
Arg Ser Ala Gln Ile Glu Thr Val Ile Ala Arg Ala Met Ser Gln Leu
495 500 505
ggt gtg cag tac gca tgg ggt ggc ggt aac gct aat ggc cca act ctg 2488
Gly Val Gln Tyr Ala Trp Gly Gly Gly Asn Ala Asn Gly Pro Thr Leu
510 515 520
ggt atc cgt gac ggt ggc gtg gcg gac tct tac ggc gat tac aac aag 2536
Gly Ile Arg Asp Gly Gly Val Ala Asp Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Lys
525 530 535
gtt ggc ttc gac tgc tct gga ctg acc ttg tat gcg ttt gcg ggt gtg 2584
Val Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu Thr Leu Tyr Ala Phe Ala Gly Val
540 545 550
gga att tca ctt cct cac tac acg ggc tac cag tac cag cac ggc acc 2632
Gly Ile Ser Leu Pro His Tyr Thr Gly Tyr Gln Tyr Gln His Gly Thr
555 560 565 570
aag gtg tcg cct tct gag atg caa cgt ggc gat ctg atc ttc tat ggt 2680
Lys Val Ser Pro Ser Glu Met Gln Arg Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly
575 580 585
ccg gga gcg tct cag cac gtg gca att tac ctc ggt gat ggt cag atg 2728
Pro Gly Ala Ser Gln His Val Ala Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Gln Met
590 595 600
att gag gct ccg aat tcg ggt tct gtc gtg aag att tct cct gtt cgc 2776
Ile Glu Ala Pro Asn Ser Gly Ser Val Val Lys Ile Ser Pro Val Arg
605 610 615
tgg agc gga atg acc gag agc gtg gta cgc ctc att tagtttcctc 2822
Trp Ser Gly Met Thr Glu Ser Val Val Arg Leu Ile
620 625 630
ctatgaatct tgatgtggtt catgcgtttt tatgcaatat caaccaaaag ttggtacgat 2882
cctcatatga atgaacgcac atcggatgca tttgacgccc tccttgtgct ctccttcggt 2942
ggtcccgaag ggcacgagga ggttcgtccg tttttggaga atgtcactca cggaaggggg 3002
attccgccgg aacgtctaga tgaagtggcg gttcattacc accacttcgg tggtatcagc 3062
cccatcaatg cgctgaacag ggaaattatc gccaatgtgg aaaaagaatt ggcgtctcgc 3122
gatcacaagc tgcctgttta ttttggtaac cgcaactgga agccgtttga taatgaggcc 3182
gctgaacaaa tggctgatga cggcgtgaaa aacgcgctgg tgttggcaac ttccgcttgg 3242
ggtggctact ccggttgtcg gcagtaccag gaagatattc agggcatgat caagcacctg 3302
gagtctcagg ggcagtcgat cacgttcacc aagctgcgtc agttctacga tcaccctcgt 3362
tttgtctcca ccatggctca attggttcag gattcctacg cgaagcttcc cgatgagctg 3422
cgagatgagg cgcgtctggt cttcaccgcg cactccattc cactgactgc ggacaatgct 3482
gcgggaaccc ctgaggatgg ctccttgtat tccacacagg tcaaggaagc gtcagcactg 3542
attgctgagg ctgttggtgt gtcagatttt gatgtggtgt ggcagtcccg ctcgggtagc 3602
ccgcacactc cgtggctgga gcctgacatc gtggatcacg cagtggagct caacgagaag 3662
ggtcaaaaag cgctcgttgt ctgccctgta ggctttattt ctgatcatat ggaagtcatt 3722
tgggatcttg attccgagct gatggaagaa gccgagaagc gcaacatggt ggtcgagcgt 3782
gtcgctaccg ttggccccac cgatgaattc gca 3815
<210> 4
<211> 630
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
Met Ala Asn Leu Asp Ser Val Arg Pro Gly Val Arg Ala Ala Leu Arg
1 5 10 15
Arg Thr His Thr Gln Val Lys Gly Val Thr Leu Thr Arg Ala Leu Ile
20 25 30
Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser Ser Met Thr Pro Ala Val
35 40 45
Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala Ile Ala Gln Ala Glu Glu
50 55 60
Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala Arg Leu Ala Gly Ser Leu
65 70 75 80
Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Ile Glu Leu Glu Met Gly Ala
85 90 95
Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val Asp Leu His Asp Ala Gln
100 105 110
Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala Leu Ala Ala Lys Lys Asp
115 120 125
Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala Ala Gln Glu Arg Leu Asp
130 135 140
Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn Gly Thr Ser Lys Arg Leu
145 150 155 160
Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu Asp Ala Leu Asp Arg Gln
165 170 175
Thr Tyr Leu Arg Thr Ser Ala Glu Lys Gln Gln Ala Ala Val Glu Glu
180 185 190
Leu Asp Arg Leu Arg Thr Glu Asn Ala Asn Lys Glu Ser Val Leu Arg
195 200 205
Gln Ala Arg Ile Val Ala Glu Gln Arg Glu Ala Glu Ala Val Glu Lys
210 215 220
Gln Val Gln Thr Glu Ala Ala Ile Ala Ala Asn Ser Glu Gln Leu Asn
225 230 235 240
Val Leu Thr Asn Asn Arg Ser Thr Leu Val Ala Gln Arg Asp Gly Ala
245 250 255
Glu Arg Asn Leu Ala Ile Ala Arg Ala Gln Ala Asp Asn Leu Gln Gly
260 265 270
Gln Arg Ala Glu Tyr Glu Glu Phe Gln Gln Ala Glu Gln Ala Arg Ile
275 280 285
Gln Ala Glu Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Lys Arg Arg Ala
290 295 300
Asp Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Glu Ala Gln Glu Ala Ala Gln
305 310 315 320
Gln Ala Gln Ala Ala Glu Glu Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr
325 330 335
Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Gln Ala Ala Gln Ala
340 345 350
Ala Gln Ala Gln Ala Glu Ala Asn Asp Arg Ala Ala Ala Gln Gln Arg
355 360 365
Ala Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Gln Arg Glu Ala Asp
370 375 380
Ala Gln Ala Ala Asn Asp Ala Gln Ala Gln Ala Leu Arg Glu Gln Ala
385 390 395 400
Leu Thr Ala Ala Ser Ile Ala Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ala Ser Gln
405 410 415
Ser Ser His Ala Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Pro Thr Asp Glu Asp Ala
420 425 430
Asp Pro Thr Asp Ile Ala Asp Ile Gln Gly Pro Thr Gln Pro Gly Thr
435 440 445
Asp Glu Ser Gly Asp Phe Gln Ser Asn Ser Ser Asp Asn Asp Ser Thr
450 455 460
Gly Asn Asp Ser Thr Gly Ser Asp Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ser Gly
465 470 475 480
Asn Asp Ser Ser Glu Val Ile Ser Gly Asp Arg Ser Ala Gln Ile Glu
485 490 495
Thr Val Ile Ala Arg Ala Met Ser Gln Leu Gly Val Gln Tyr Ala Trp
500 505 510
Gly Gly Gly Asn Ala Asn Gly Pro Thr Leu Gly Ile Arg Asp Gly Gly
515 520 525
Val Ala Asp Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Lys Val Gly Phe Asp Cys Ser
530 535 540
Gly Leu Thr Leu Tyr Ala Phe Ala Gly Val Gly Ile Ser Leu Pro His
545 550 555 560
Tyr Thr Gly Tyr Gln Tyr Gln His Gly Thr Lys Val Ser Pro Ser Glu
565 570 575
Met Gln Arg Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gln His
580 585 590
Val Ala Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Gln Met Ile Glu Ala Pro Asn Ser
595 600 605
Gly Ser Val Val Lys Ile Ser Pro Val Arg Trp Ser Gly Met Thr Glu
610 615 620
Ser Val Val Arg Leu Ile
625 630
<210> 5
<211> 1266
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1263)
<223> cds of aspartokinase gene
<220>
<221> misc_feature
<222> (1264)..(1266)
<400> 5
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
gca ggc acc gga cgc taa 1266
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 6
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<400> 6
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 7
<211> 1245
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1242)
<223> coding sequence of NCgl2986
<220>
<221> misc_feature
<222> (1243)..(1245)
<223> taa stop codon
<400> 7
gtg gat gaa cta tat cca ttg ata att ttg aac atg aat gat gga agg 48
Met Asp Glu Leu Tyr Pro Leu Ile Ile Leu Asn Met Asn Asp Gly Arg
1 5 10 15
agc agg gtg tct aaa gtc ctg aga gtt ggc gat cgc agc ccg cgc gtg 96
Ser Arg Val Ser Lys Val Leu Arg Val Gly Asp Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
gca gaa gtg cgc act acg ctc gct cgc ctc ggt gtg att gaa ggc tat 144
Ala Glu Val Arg Thr Thr Leu Ala Arg Leu Gly Val Ile Glu Gly Tyr
35 40 45
tcc agg gag atg tct gca aag aca gaa tcc cag aag ttc cac gaa gaa 192
Ser Arg Glu Met Ser Ala Lys Thr Glu Ser Gln Lys Phe His Glu Glu
50 55 60
gag acg ctt ttc gac gaa gaa ctc agc ctc agc atc aag tca ttc cag 240
Glu Thr Leu Phe Asp Glu Glu Leu Ser Leu Ser Ile Lys Ser Phe Gln
65 70 75 80
caa gct cga gga gtc gtt ccc tcc ggg ctt att gac gac ccc acc ctg 288
Gln Ala Arg Gly Val Val Pro Ser Gly Leu Ile Asp Asp Pro Thr Leu
85 90 95
cgc gca atc cgc gaa gcc tcc tac acc ctg gga acc cgc gtg ctg gcc 336
Arg Ala Ile Arg Glu Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Arg Val Leu Ala
100 105 110
tac cag ccc ggc aac cag ctt gtt ggt gac gac gtt gta gaa atc caa 384
Tyr Gln Pro Gly Asn Gln Leu Val Gly Asp Asp Val Val Glu Ile Gln
115 120 125
tcc cat ctc caa gag ctc ggc ttc tac gcc gac cgt gtg gat gga cat 432
Ser His Leu Gln Glu Leu Gly Phe Tyr Ala Asp Arg Val Asp Gly His
130 135 140
ttt ggc gag ctc aca cac aaa gct gtg atg aac tac caa ctc aac tac 480
Phe Gly Glu Leu Thr His Lys Ala Val Met Asn Tyr Gln Leu Asn Tyr
145 150 155 160
ggc atg cag gta gac ggc atc tgt ggc cct gac acc atc cgt gcg ctg 528
Gly Met Gln Val Asp Gly Ile Cys Gly Pro Asp Thr Ile Arg Ala Leu
165 170 175
tcc cga ctt ggt ctg cgc atc aag ggt ggc tct gct caa gct atc cgt 576
Ser Arg Leu Gly Leu Arg Ile Lys Gly Gly Ser Ala Gln Ala Ile Arg
180 185 190
gaa cgc gaa cgc atg cgc aat gca ggc cca cgt ctt gct ggc aag cgt 624
Glu Arg Glu Arg Met Arg Asn Ala Gly Pro Arg Leu Ala Gly Lys Arg
195 200 205
gtg gtc att gat cct gcg ctt ggg ggc tcc aac aag ggt cag atc gtg 672
Val Val Ile Asp Pro Ala Leu Gly Gly Ser Asn Lys Gly Gln Ile Val
210 215 220
aaa ggc ccc tac ggt gag atc tct gag gaa gaa atc ctc tgg gat ttg 720
Lys Gly Pro Tyr Gly Glu Ile Ser Glu Glu Glu Ile Leu Trp Asp Leu
225 230 235 240
gcc acc cgc ctg gaa ggt cgc atg atc gca aca ggc atg gaa acc att 768
Ala Thr Arg Leu Glu Gly Arg Met Ile Ala Thr Gly Met Glu Thr Ile
245 250 255
ctg tcg cgc ccg cac atg gat gat ccc agc agc cgt gat cgc gcg tcg 816
Leu Ser Arg Pro His Met Asp Asp Pro Ser Ser Arg Asp Arg Ala Ser
260 265 270
atc gcg aat gct ttc ggc gct gac ctc atg ctg agc ctg cac tgc gat 864
Ile Ala Asn Ala Phe Gly Ala Asp Leu Met Leu Ser Leu His Cys Asp
275 280 285
tcc tac ccg aat gaa aaa gct aac ggc gtg gcc agc ttc tac ttc ggt 912
Ser Tyr Pro Asn Glu Lys Ala Asn Gly Val Ala Ser Phe Tyr Phe Gly
290 295 300
tcg gaa aac ggc acc aac tcc ttg acc ggt gaa acg ctc tcc gcg tac 960
Ser Glu Asn Gly Thr Asn Ser Leu Thr Gly Glu Thr Leu Ser Ala Tyr
305 310 315 320
atc caa aaa gag atc gtt gcc cgc acc cca ctg aac aac tgt ggc agc 1008
Ile Gln Lys Glu Ile Val Ala Arg Thr Pro Leu Asn Asn Cys Gly Ser
325 330 335
cat gcc cgt acc tgg gat ctg ctg cgc ctc acg cgc atg ccc atg gtg 1056
His Ala Arg Thr Trp Asp Leu Leu Arg Leu Thr Arg Met Pro Met Val
340 345 350
gaa gtt gtc acc ggt tac ctc acc aac ccc gat gac ctg gca gtt ctg 1104
Glu Val Val Thr Gly Tyr Leu Thr Asn Pro Asp Asp Leu Ala Val Leu
355 360 365
act gat cca caa atg cgt gat cac att gcc gaa gcc atc gtt gtc gcc 1152
Thr Asp Pro Gln Met Arg Asp His Ile Ala Glu Ala Ile Val Val Ala
370 375 380
gtc aag cgc ctg tac ctc ctt gat gag gaa gca cag ccc aag acc gga 1200
Val Lys Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Glu Ala Gln Pro Lys Thr Gly
385 390 395 400
acc ttc aag ttc tct gag ctg ttg caa tca gag cag gct ggc taa 1245
Thr Phe Lys Phe Ser Glu Leu Leu Gln Ser Glu Gln Ala Gly
405 410
<210> 8
<211> 414
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<400> 8
Met Asp Glu Leu Tyr Pro Leu Ile Ile Leu Asn Met Asn Asp Gly Arg
1 5 10 15
Ser Arg Val Ser Lys Val Leu Arg Val Gly Asp Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Ala Glu Val Arg Thr Thr Leu Ala Arg Leu Gly Val Ile Glu Gly Tyr
35 40 45
Ser Arg Glu Met Ser Ala Lys Thr Glu Ser Gln Lys Phe His Glu Glu
50 55 60
Glu Thr Leu Phe Asp Glu Glu Leu Ser Leu Ser Ile Lys Ser Phe Gln
65 70 75 80
Gln Ala Arg Gly Val Val Pro Ser Gly Leu Ile Asp Asp Pro Thr Leu
85 90 95
Arg Ala Ile Arg Glu Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Arg Val Leu Ala
100 105 110
Tyr Gln Pro Gly Asn Gln Leu Val Gly Asp Asp Val Val Glu Ile Gln
115 120 125
Ser His Leu Gln Glu Leu Gly Phe Tyr Ala Asp Arg Val Asp Gly His
130 135 140
Phe Gly Glu Leu Thr His Lys Ala Val Met Asn Tyr Gln Leu Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Met Gln Val Asp Gly Ile Cys Gly Pro Asp Thr Ile Arg Ala Leu
165 170 175
Ser Arg Leu Gly Leu Arg Ile Lys Gly Gly Ser Ala Gln Ala Ile Arg
180 185 190
Glu Arg Glu Arg Met Arg Asn Ala Gly Pro Arg Leu Ala Gly Lys Arg
195 200 205
Val Val Ile Asp Pro Ala Leu Gly Gly Ser Asn Lys Gly Gln Ile Val
210 215 220
Lys Gly Pro Tyr Gly Glu Ile Ser Glu Glu Glu Ile Leu Trp Asp Leu
225 230 235 240
Ala Thr Arg Leu Glu Gly Arg Met Ile Ala Thr Gly Met Glu Thr Ile
245 250 255
Leu Ser Arg Pro His Met Asp Asp Pro Ser Ser Arg Asp Arg Ala Ser
260 265 270
Ile Ala Asn Ala Phe Gly Ala Asp Leu Met Leu Ser Leu His Cys Asp
275 280 285
Ser Tyr Pro Asn Glu Lys Ala Asn Gly Val Ala Ser Phe Tyr Phe Gly
290 295 300
Ser Glu Asn Gly Thr Asn Ser Leu Thr Gly Glu Thr Leu Ser Ala Tyr
305 310 315 320
Ile Gln Lys Glu Ile Val Ala Arg Thr Pro Leu Asn Asn Cys Gly Ser
325 330 335
His Ala Arg Thr Trp Asp Leu Leu Arg Leu Thr Arg Met Pro Met Val
340 345 350
Glu Val Val Thr Gly Tyr Leu Thr Asn Pro Asp Asp Leu Ala Val Leu
355 360 365
Thr Asp Pro Gln Met Arg Asp His Ile Ala Glu Ala Ile Val Val Ala
370 375 380
Val Lys Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Glu Ala Gln Pro Lys Thr Gly
385 390 395 400
Thr Phe Lys Phe Ser Glu Leu Leu Gln Ser Glu Gln Ala Gly
405 410
<210> 9
<211> 180
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(180)
<223> N terminus of the polypeptide identified by locus_tag cgR_1596
<400> 9
Met Ala Asn Leu Asp Ser Val Arg Pro Gly Val Arg Ala Ala Leu Arg
1 5 10 15
Arg Thr His Thr Gln Val Lys Gly Val Ala Leu Thr Arg Ala Leu Ile
20 25 30
Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser Ser Met Thr Pro Ala Val
35 40 45
Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala Ile Ala Gln Ala Glu Glu
50 55 60
Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala Arg Leu Ala Gly Ser Leu
65 70 75 80
Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Val Glu Leu Glu Met Gly Ala
85 90 95
Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val Asp Leu His Asp Ala Gln
100 105 110
Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala Leu Ala Ala Lys Lys Asp
115 120 125
Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala Ala Gln Glu Arg Leu Asp
130 135 140
Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn Gly Thr Ser Lys Gly Leu
145 150 155 160
Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu Asp Ala Leu Asp Arg Gln
165 170 175
Thr Tyr Leu Arg
180
<210> 10
<211> 154
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(154)
<223> N terminus of the polypeptide identified by locus_tag NCgl1480
<400> 10
Met Thr Arg Ala Leu Ile Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ser Met Thr Pro Ala Val Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Ile Ala Gln Ala Glu Glu Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala
35 40 45
Arg Leu Ala Gly Ser Leu Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Val
50 55 60
Glu Leu Glu Met Gly Ala Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val
65 70 75 80
Asp Leu His Asp Ala Gln Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala
85 90 95
Leu Ala Ala Lys Lys Asp Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala
100 105 110
Ala Gln Glu Arg Leu Asp Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Ser Lys Gly Leu Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu
130 135 140
Asp Ala Leu Asp Arg Gln Thr Tyr Leu Arg
145 150
<210> 11
<211> 2715
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> polynucleotide NCgl1480*_Mut
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(11)
<223> recognition site for restriction endonuclease SbfI
<220>
<221> misc_feature
<222> (2705)..(2712)
<223> recognition site for restriction endonuclease SbfI
<400> 11
gatcctgcag gcgtcgaaaa gcaatatctt tataagtaaa gttctaaagc tttacttata 60
gcactttcgg taggtgtcga gaaaattccc aaattgcgga aaattcacat actttgtgcc 120
acaaagtgat aaacatcaca aaatttcatg actcagccat tcatgcaggc cagaacatgc 180
aaaaccttgc acgctctggc cttttgttat gtaactgttg tgaaagatgt atcaaaagtt 240
accaaggtga cttaatgttc agatatcgac tcatgggttg ttttccaaaa cttgaatcaa 300
tttgagtaac agtagttatc aagcgttaaa ccttgaaact tccactcttt ttactgatgg 360
gcatttgggc aaacggggaa gcttgctgga gatgcaataa atcggtgaat ggttggtgca 420
atgaagagga gagtggccca tagtttccgc tacggaacgc ggagtcttta cgtttcaatt 480
cttggcaagt atctagcgtc aaggcttgat atgtgaaggg attcggattg aacaggagaa 540
catgtggcca atctagattc agttcgccct ggggtgcggg cagctcttcg acgtacccat 600
acccaggtaa aaggtgtcac gttgaccagg gcgttgattg cgcttgcagt aagcggagct 660
ttgcttagtt ccatgactcc ggcggtggcg cagccacaga atccggatga cgcagccatt 720
gcacaggcag aggaaaatgt ttcggcgggc gatggggaag tcgcccgcct ggcaggatct 780
ttgtccagca ctgacgcgga aattaaccgc atcgagctgg aaatgggtgc tctgcgtgaa 840
gaagtgaaca agtccctcgt ggatttgcat gatgcgcagg caatcgccga gcaggcccgc 900
caagatgcac ttgcagccaa gaaggatctc gatgattctc aagcgcagat cgaagcagcc 960
caagagcgcc ttgatgagat ttcacgtgca gcgtatcgcc aaaacggaac ctccaagagg 1020
ctttcaggca tctcgggcaa tggaaattct gaagatgcgc tagatcgtca gacttacctg 1080
cgaaccagtg cggaaaagca gcaggcagct gttgaagagc ttgatcgcct ccgtacggaa 1140
aacgccaaca aggaatcggt gttgcgccag gcccgcatcg ttgctgagca gcgtgaggcg 1200
gaagccgtcg aaaagcaagt ccagaccgag gctgcaattg ccgcaaacag cgagcagctc 1260
aatgtcttga ctaacaatcg cagtaccttg gttgcccagc gtgatggggc tgagcgcaac 1320
ttggccatcg ctcgtgcgca ggcggataat ctgcaaggtc agcgtgctga gtacgaggaa 1380
ttccagcagg cagagcaggc tcgcatccag gcggaagcgg aagctcaggc tgctgcggag 1440
gagaagcgtc gtgccgatga ggctgctgca caggcagccg ctgaagctca agaagctgcc 1500
cagcaagctc aggcggcgga ggaagcccaa gccgcgcaag cagctgagac agcacaagcc 1560
caagccgcgc aagctgcgga aacccaagct gcacaagccg cgcaagctca ggcagaagcg 1620
aatgatcgtg ccgccgcgca acagcgtgct gcagaggctc aagcagcagc ggaacaggcg 1680
caacgtgagg ctgacgctca ggcggccaac gatgcccaag ctcaggcact gcgtgaacag 1740
gcgctcaccg cagcctccat cgctgcggct gctctaattg cggcgagcca gtccagccat 1800
gccactactc aaaatcctta cccaactgat gaagacgcgg atccgaccga tattgcggac 1860
atccaaggcc caacgcagcc aggtacggat gagtctggag atttccagag caactccagc 1920
gacaacgatt ccacaggcaa cgattccaca ggctctgact cttcagattc agattcctcc 1980
ggcaacgatt cttcagaggt tatttccggc gatcgttccg ctcagattga gactgtgatt 2040
gcgcgcgcca tgagccagtt gggtgtgcag tacgcatggg gtggcggtaa cgctaatggc 2100
ccaactctgg gtatccgtga cggtggcgtg gcggactctt acggcgatta caacaaggtt 2160
ggcttcgact gctctggact gaccttgtat gcgtttgcgg gtgtgggaat ttcacttcct 2220
cactacacgg gctaccagta ccagcacggc accaaggtgt cgccttctga gatgcaacgt 2280
ggcgatctga tcttctatgg tccgggagcg tctcagcacg tggcaattta cctcggtgat 2340
ggtcagatga ttgaggctcc gaattcgggt tctgtcgtga agatttctcc tgttcgctgg 2400
agcggaatga ccgagagcgt ggtacgcctc atttagtttc ctcctatgaa tcttgatgtg 2460
gttcatgcgt ttttatgcaa tatcaaccaa aagttggtac gatcctcata tgaatgaacg 2520
cacatcggat gcatttgacg ccctccttgt gctctccttc ggtggtcccg aagggcacga 2580
ggaggttcgt ccgtttttgg agaatgtcac tcacggaagg gggattccgc cggaacgtct 2640
agatgaagtg gcggttcatt accaccactt cggtggtatc agccccatca atgcgctgaa 2700
caggcctgca ggatc 2715
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer LC-NCgl1480_1
<400> 12
agcggagctt tgcttagttc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer LC-NCgl1480_2
<400> 13
tgcttcgatc tgcgcttgag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> probe NCgl1480_90_C
<400> 14
ccagctcgat gcggttaatt 20
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> probe NCgl1480_90_A
<400> 15
agggacttgt tcacttcttc acgcagagca cccat 35
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer LC-NCgl1480_3
<400> 16
cgctgcggct gctctaattg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer LC-NCgl1480_4
<400> 17
gcgtactgca cacccaactg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> probe NCgl1480_454_C
<400> 18
gttgctctgg aaatctccag 20
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> probe NCgl1480_454_A
<400> 19
ctgtggaatc gttgcctgtg gaatcgttgt cgctg 35
<210> 20
<211> 1326
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20
atccggatga cgcagccatt gcacaggcag aggaaaatgt ttcggcgggc gatggggaag 60
tcgcccgcct ggcaggatct ttgtccagca ctgacgcgga aattaaccgc atcgagctgg 120
aaatgggtgc tctgcgtgaa gaagtgaaca agtccctcgt ggatttgcat gatgcgcagg 180
caatcgccga gcaggcccgc caagatgcac ttgcagccaa gaaggatctc gatgattctc 240
aagcgcagat cgaagcagcc caagagcgcc ttgatgagat ttcacgtgca gcgtatcgcc 300
aaaacggaac ctccaagagg ctttcaggca tctcgggcaa tggaaattct gaagatgcgc 360
tagatcgtca gacttacctg cgaaccagtg cggaaaagca gcaggcagct gttgaagagc 420
ttgatcgcct ccgtacggaa aacgccaaca aggaatcggt gttgcgccag gcccgcatcg 480
ttgctgagca gcgtgaggcg gaagccgtcg aaaagcaagt ccagaccgag gctgcaattg 540
ccgcaaacag cgagcagctc aatgtcttga ctaacaatcg cagtaccttg gttgcccagc 600
gtgatggggc tgagcgcaac ttggccatcg ctcgtgcgca ggcggataat ctgcaaggtc 660
agcgtgctga gtacgaggaa ttccagcagg cagagcaggc tcgcatccag gcggaagcgg 720
aagctcaggc tgctgcggag gagaagcgtc gtgccgatga ggctgctgca caggcagccg 780
ctgaagctca agaagctgcc cagcaagctc aggcggcgga ggaagcccaa gccgcgcaag 840
cagctgagac agcacaagcc caagccgcgc aagctgcgga aacccaagct gcacaagccg 900
cgcaagctca ggcagaagcg aatgatcgtg ccgccgcgca acagcgtgct gcagaggctc 960
aagcagcagc ggaacaggcg caacgtgagg ctgacgctca ggcggccaac gatgcccaag 1020
ctcaggcact gcgtgaacag gcgctcaccg cagcctccat cgctgcggct gctctaattg 1080
cggcgagcca gtccagccat gccactactc aaaatcctta cccaactgat gaagacgcgg 1140
atccgaccga tattgcggac atccaaggcc caacgcagcc aggtacggat gagtctggag 1200
atttccagag caactccagc gacaacgatt ccacaggcaa cgattccaca ggctctgact 1260
cttcagattc agattcctcc ggcaacgatt cttcagaggt tatttccggc gatcgttccg 1320
ctcaga 1326
201800198A 2

Claims (5)

1.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)提供具有分泌L-赖氨酸的能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种的细菌，在其染色体中含有编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
b)在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，以及
c)在所述培养基中积累所述L-赖氨酸以形成含有L-赖氨酸的发酵液。
2.权利要求1的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3的位置923至2812的核苷酸序列。
3.权利要求1的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3的位置923至2815的核苷酸序列。
4.权利要求1的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3的位置585至2815的核苷酸序列。
5.权利要求1的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3的位置565至2815的核苷酸序列。
CN201910670680.0A 2018-07-24 2019-07-24 发酵生产l-赖氨酸的方法 Pending CN110777174A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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