CN1298448A - 微生物制备来自芳族代谢/ⅲ的物质 - Google Patents

微生物制备来自芳族代谢/ⅲ的物质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物制备来自芳族代谢物质的方法;尤其是制备芳族氨基酸的方法。另外,本发明涉及基因结构和转化细胞。按照本发明,通过引入或增加葡糖脱氢酶的活性,观察到物质产量的增加,特别是芳族氨基酸产量的增加。增加氧化葡萄糖的酶的活性导致由含葡萄糖底物于细胞内形成葡糖酸内酯和葡糖酸。在一个优选的实施方案中,所述葡糖脱氢酶来自巨大芽抱杆菌、按照本发明的方法可以用于提供广谱的物质。

Description

微生物制备来自芳族代谢/Ⅲ的物质
本发明涉及微生物制备来自芳族代谢的物质的方法，涉及基因结构和转化细胞。
随着例如对氨基酸的需求持续增加，通过微生物制备的来自芳族代谢的物质，特别是芳族氨基酸，有巨大的经济利益。
因此，例如L-苯丙氨酸用于制备药物，尤其是也用于制备增甜剂天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作为药物和作为饲料的添加剂；对于L-酪氨酸，也同样有作为药物以及作为制药工业中的原料的需要。除了从天然材料中分离外，用生物技术制备也是在经济许可的条件下获得所需光活性形式的氨基酸的一种很重要的方法。或者使用酶法，或者使用微生物实现生物技术制备。
后一种制备方法即微生物制备享有以下优点：即可以使用简单和价廉的原料。然而，尽管在细胞中氨基酸的生物合成以各种各样的方式控制，人们已经进行了许多不同的尝试，以增加产物生成。因此，例如为了切断生物合成的调节，使用了氨基酸类似物。例如，通过选择对苯丙氨酸类似物的抗性，获得了大肠杆菌(E.coli)的突变体(GB-2,053,906)，使得有可能获得L-苯丙氨酸的产量增加。相似的策略也产生了棒状杆菌属(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢杆菌属(Bacillus)(EP-0,138,526)的过量生产菌株。
而且，已知使用重组DNA技术构建的微生物，通过克隆并表达编码不再受反馈抑制的关键酶的基因，在所述微生物中同样消除了生物合成的调节。作为模型，EP-0,077,196描述了一种生产芳族氨基酸的方法，其中在大肠杆菌中过量表达不再受反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一种大肠杆菌菌株，其中为了生产L-苯丙氨酸，另外过量表达分支酸变位酶/预苯酸脱水酶。
上述策略共有的特征是用于提高产量的干涉限于对芳族氨基酸特有的生物合成途径。然而，为了更进一步增加产量，必需努力提高生产芳族氨基酸所需的初级代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(Ery4P)的供给。
PEP是糖酵解产物丙酮酸盐(丙酮酸)的活化前体；Ery4P是戊糖磷酸途径的中间体。
许多不同的用于增加产量的这些尝试都致力于克服对胞质合成氨基酸的限制。在芳族氨基酸的生产中，需要初级代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和Ery4P两者缩合，以形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。
所述文献描述了一些增加Ery4P可得性的策略，例如通过过量表达转酮酶，使得增加Ery4P的供给，并因此增加L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸产物的生成成为可能(EP专利申请第0 600 463号；Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。近来证实(Flores等，Nature Biotechnology 14(1996)620-623)，大肠杆菌的PTS-阴性突变体的自发葡萄糖-阳性回复体通过GalP系统将葡萄糖集中到细胞中，并能够在葡萄糖中生长。转酮酶基因tktA的额外表达导致观察到的中间体DAHP的生成增加(Flores等，Nature Biotechnology 14(1996)620-623)。
在2个德国专利申请(参考号码为DE 196 44 566.3和DE 196 44567.1，还没有公开)中申请人证实，例如通过在大肠杆菌中增加转醛酶酶活性或增加转醛酶和转酮酶的酶活性，或通过在大肠杆菌中增加葡糖激酶的活性，或通过在大肠杆菌中增加葡糖激酶和PEP不依赖性糖转运系统的活性，或通过组合上述提及的酶和转运系统，可能以更大量生产出苯丙氨酸。
本发明的目的是利用另外的方法，通过它增强来自芳族代谢的物质的微生物的合成。
也要构建一种微生物，在所述微生物中增加了来自芳族代谢的物质的生成。
令人惊奇的是，在生产来自芳族代谢的物质的微生物中，通过增强氧化葡萄糖的酶的活性来转化葡萄糖或含葡萄糖底物，实现了上述目的。由此提供了一种替代的代谢途径。该途径包括将游离的葡萄糖氧化成葡糖酸内酯/葡糖酸，并将葡糖酸磷酸化以形成6-磷酸葡糖酸。
该结果特别令人惊奇，因为仅仅增加氧化葡萄糖的酶的活性在生产来自芳族代谢的物质中起重要作用决不是不证自明的。
在本发明的含义中，来自芳族代谢的物质被理解为通过增加Ery4P或Ery4P和PEP的供给有利于其生化合成的所有化合物。例如芳族氨基酸、靛蓝、吲哚乙酸、己二酸、黑色素、莽草酸、分支酸、醌和苯甲酸，也包括它们的潜在衍生物和次级产物。
在本文中应当注意，除了需要按照本发明的干涉之外，也需要对生产物质的微生物进一步遗传改变，用于制备靛蓝、己二酸和其它非天然的次级产物(Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。
生产来自芳族代谢的物质的微生物可以以各种方式代谢葡萄糖或含葡萄糖底物(即包含葡萄糖的二糖和寡糖)：例如已知用ATP依赖性激酶(己糖激酶和葡糖激酶)磷酸化葡萄糖，并因此将葡萄糖集中于糖酵解中。另外许多细菌具有可利用的PEP依赖性系统，用于摄取葡萄糖并使其磷酸化。
葡萄糖也可以被各种可溶性酶或膜结合酶氧化(通过葡糖酸内酯氧化成葡糖酸)。这些酶包括氧化葡萄糖的酶或葡糖脱氢酶。氧化葡萄糖的酶将葡萄糖氧化成葡糖酸内酯，同时还原分子氧。而葡糖脱氢酶也将葡萄糖氧化成葡糖酸内酯，它们使用诸如吡咯并喹啉醌(PQQ)的其它电子受体或诸如烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD)或NADP的其它辅因子。已知膜结合葡糖脱氢酶可以用辅因子吡咯并喹啉醌(PQQ)氧化葡萄糖，反应在所述膜外侧发生。为了将产物(葡糖酸内酯或葡糖酸)摄取到细胞中，就需要一个如已经描述于van Schie等，Journal ofBacteriology 163(1985)493-499；Isturiz等，Journal of GeneralMicrobiology 132(1986)3209-3219；Izu等，Journal of Molecular Biology267(1997)778-793的特殊的转运系统，通常(例如在大肠杆菌中)其表达因葡萄糖的存在而受阻遏，这描述于Izu等，Journal of MolecularBiology 267(1997)778-793和Conway.FEMS Microbiology Reviews103(1992)1-27。
于细胞中发现的使用辅因子NAD或NADP的葡糖脱氢酶是可溶性酶。已知的生产者包括芽孢杆菌属菌株，其中一些具有几个葡糖脱氢酶的异构酶(例如在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中的葡糖脱氢酶Ⅰ至Ⅳ；Mitamura等，1990,Journal of Fermentation andBioengineering 70,363-369)。葡糖脱氢酶的表达是受严格调节的，并已知例如仅在芽孢杆菌属菌种的内孢子形成过程中的前孢子阶段发生；与在葡萄糖中生长相关的葡糖脱氢酶的生理作用还不清楚，这已由Lampel等，Journal of Bacteriology 166(1986)238-243和近来的Steinmetz或Foffnagel(“Bacillus subtilis and other Gram-positiveBacteria”(Sonenshein,Hoch和Losick编辑)，M.Steinmetz 157-170页和P.Fortnagel 171-180页；ISBN 1-55581-053-5；ASM Press,Washington,D.C.,1993)进行了报导。
特别是迄今尚未描述大肠杆菌、棒状杆菌或短杆菌等中的NAD(P)依赖性葡糖脱氢酶。已经将得自芽孢杆菌属菌株的葡糖脱氢酶的基因克隆到大肠杆菌中，并在其中表达(Hilt等，Biochimica et BiophysicaActa 1076(1991)298-304)。具体地说目的在于获得重组的葡糖脱氢酶，这被用作葡萄糖的检测系统或辅因子再生的检测系统(Hilt等，Biochimica et Biophysica Acta 1076(1991)298-304；DE专利申请3711811)。相反，迄今还没有描述这些基因利用葡萄糖例如作为一种底物来获得来自芳族代谢的物质。
根据本发明，已经发现引入葡糖脱氢酶或增加其活性令人惊奇地导致生成物质。增加氧化葡萄糖的酶的活性导致由含葡萄糖底物于细胞内形成葡糖酸内酯和葡糖酸。在一个优选的实施方案中，所述葡糖脱氢酶得自巨大芽孢杆菌，具体的说是巨大芽孢杆菌葡糖脱氢酶Ⅳ，这描述于Mitamura等，Journal of Fermentation andBioengineering 70(1990)363-369，和Nagao等，Journal of Bacteriology 15(1992)5013-5020。
葡糖酸依赖于使葡萄糖磷酸化的酶对其活化。已知这种酶例如可以是对葡糖酸特异性的磷酸烯醇丙酮酸依赖性酶Ⅱ，或是对葡糖酸特异性的ATP依赖性激酶。例如，已知描述于Izu等，FEBS Letters 394(1996)14-16；Izu等，Journal of Molecular Biology 267(1997)778-793，和Tong等，Journal of Bacteriology 178(1996)3260-3269的大肠杆菌ATP依赖性葡糖酸激酶GntK。
在大肠杆菌中，产物6-磷酸葡糖酸是戊糖磷酸途径和ED途径二者的氧化分支的中间体，这描述于Fraenkel，在“EScherichia coli andSalmonella”，第2版(Neidhardt等编辑)189-198页，ASM Press，Washington，美国，ISBN-1-55581-084-5，1996。
通过另外增加使葡萄糖磷酸化的酶的活性，可以提高物质的产量。当使用使葡萄糖磷酸化的酶时，例如来自各种微生物的使葡萄糖磷酸化的酶都是合适的，只要它们可以在生产来自芳族代谢的物质的微生物中以功能方式表达。使用ATP依赖性葡糖酸激酶，优选大肠杆菌葡糖酸激酶，特别是来自大肠杆菌K-12的葡糖酸激酶(GntK)，是特别可取的。其它的使葡萄糖磷酸化的酶的基因(其基因产物使葡糖酸磷酸化)，同样适合于按照本发明的方法。来自其它肠细菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因可以作为实例提及。
葡糖酸激酶的作用限于活化葡糖酸，然而它不是由大肠杆菌或其它细菌在例如葡萄糖存在下代谢。例如在大肠杆菌中，葡糖酸激酶GntK只有当所述生物靠葡糖酸生长且不促使葡萄糖代谢时才重要；实际上它的形成在葡萄糖存在时竟受到阻抑(如Izu等，Journal ofMolecular Biology 267(1997)778-793，和Tong等，Journal ofBacteriology 178(1996)3260-3269所述)，并在葡萄糖存在时不发生。
因此，在此具体的实施方案中，额外增加使葡萄糖磷酸化的酶的活性，提供了一种能使使葡萄糖磷酸化的酶在不存在细胞外葡糖酸或存在葡萄糖时在微生物中成为可利用的酶，所述使葡萄糖磷酸化的酶特别是葡糖酸激酶，最好是大肠杆菌葡糖酸激酶，尤其是来自大肠杆菌K-12的葡糖酸激酶GntK。优点是利用按照本发明的代谢途径的物流增加了。这能使葡糖酸向6-磷酸葡糖酸的转化即使在葡萄糖存在时也增加。这导致在细胞内存在的6-磷酸葡糖酸的比例增加，所述6-磷酸葡糖酸可以利用已知的代谢次序转化为所述物质。
葡糖酸内酯是氧化葡萄糖的酶的反应产物。尽管葡糖酸内酯可以自发转化为葡糖酸，但已经描述了催化促进这种转化的酶(例如Kanagasundaram和Scopes,Biochimica et Biophysica Acta 1171(1992)198-200中描述的运动发酵单胞菌葡糖酸内酯酶)。因此在另一个实施方案中，为了促进葡糖酸内酯分别向葡糖酸(或向6-P-葡糖酸)转化，除了氧化葡萄糖的酶或除了氧化葡萄糖的酶和使葡萄糖磷酸化的酶之外，还表达了葡糖酸内酯酶(例如来自运动发酵单胞菌)基因。
应当注意到，葡糖脱氢酶和葡糖酸激酶的基因天然存在于一些芽孢杆菌物种中；然而，所述酶的基因排列在不同的操纵子中，并明显地未结合用于代谢葡萄糖，如Steinmetz或Fortnagel所述(“Bacillussubtilis and other Gram-positive Bacteria”(Sonenshein，Hoch和Losick编辑)，Steinmetz 157-170页和Fortnagel 171-180页；ISBN 1-55581-053-5；ASM Press,Washington,D.C.,1993)。此外，因为在孢子形成条件下特异性诱导所述葡糖脱氢酶，所以未曾预料这两种酶一起促进物质的生成。
因此，在本发明范围内描述的、与靠葡萄糖或含葡萄糖底物生长有关的氧化葡萄糖的酶的活性增加、或与靠葡萄糖或含葡萄糖底物生长有关的氧化葡萄糖的酶和磷酸化葡糖酸的酶的活性分别增加对于来自芳族代谢的物质的生产的效应，是完全预料不到的。
在本发明另一个优选的实施方案中，除了增加氧化葡萄糖的酶活性或增加氧化葡萄糖的酶和使葡萄糖磷酸化的酶的活性外，也增加用于PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的活性。
该实施方案也包括在一种生产来自芳族代谢的物质的微生物中，增加用于PEP不依赖性葡萄糖或含葡萄糖底物摄取的转运蛋白的活性，其中所述微生物也能够利用PEP依赖性转运系统摄取糖。另外整合PEP不依赖性转运系统使得在生产所述物质的微生物中增加所述糖的供给成为可能。按照本发明，这种糖可以通过细胞内氧化葡萄糖的酶转化为葡糖酸内酯，接着转化为葡糖酸。葡糖酸就是使葡萄糖磷酸化的酶的底物。通常，PEP不需要作为这些反应的能量供体，因此，在糖酵解和戊糖磷酸途径恒定的物流基础上，PEP可以更大量的PEP可被利用，同Ery4P缩合，形成用于芳族化合物(即3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP))的共有生物合成途径的初级代谢物，并随后用于生产来自芳族代谢的物质。
在所述转运蛋白的情况下，将该蛋白的活性理解为是蛋白介导的摄取速率。
关于用于PEP不依赖性摄取葡萄糖或含葡萄糖底物的转运蛋白，使用转运蛋白，尤其是使用易化蛋白(facilitator)是合理的，易化蛋白是按照蛋白介导的易化扩散的原理起作用的转运蛋白。使用来自运动发酵单胞菌的葡糖易化蛋白(Glf)是特别合适的。当使用后者时，从例如运动发酵单胞菌中获得编码该蛋白的基因，即glf，特别是从运动发酵单胞菌ATCC 31821中分离出的易化蛋白基因glf，如Parker等，1995,Molectllar Microbiology 15(1995)795-802和Weisser等，1995,Journal of Bacteriology 177(1995)3351-3354所述。然而，得自其它细菌的、其基因产物转运葡萄糖且在这样做时不使用任何PEP的糖转运基因，例如大肠杆菌的GalP系统，同样适合于按照本发明的方法。而且，可以使用糖转运系统的基因，诸如HXT1至HXT7(它们得自诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevtsiae)、树干毕赤酵母(pichiastipitis)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的真核微生物)，或者更通常使用得自其它生物的糖转运基因，只要它们在所述微生物中以功能方式表达，以及同时所述基因产物可以不需PEP而操作葡萄糖的磷酸化和/或转运。在氨基酸生产者中可以表达所述糖转运基因，这特别合理。
在本发明的定义范围内，可以将用于增加活性的措施理解为适用于以下的所有措施：增加氧化葡萄糖的酶的活性，或增加氧化葡萄糖的酶的活性和另外增加使葡萄糖磷酸化的酶、葡糖酸内酯酶和用于PEP依赖性糖摄取的转运蛋白中的至少一种的活性。下述措施尤其适用于该目的：-引入基因，例如使用载体或温和噬菌体；-增加所述基因拷贝数，例如为了将按照本发明的基因以增加的拷贝数引入到所述微生物中，使用质粒，所述增加的拷贝数是稍微(例如2-5倍)增加的拷贝数至大幅(例如15-50倍)增加的拷贝数；-增加基因表达，例如通过提高转录速率，例如通过使用诸如Ptac、Ptet或其它调节核苷酸序列的启动子元件，和/或通过提高翻译速率，例如通过使用共有核糖体结合位点；-增加现存酶的内源活性，例如利用通过常规方法(例如使用紫外照射或产生突变的化学药品)以非定向方式产生的突变，或者利用诸如缺失、插入和/或核苷酸交换重组DNA方法以特异性方式产生的突变；-通过改变酶的结构增加酶的活性，例如通过使用物理、化学、分子生物学或其它微生物学方法诱变；-使用去调节的酶，例如不再受反馈抑制的酶；-引入相应的编码所述去调节酶的基因。
组合使用上述方法和其它类似的用于增加活性的方法也是可能的。在转运蛋白的情况下，例如通过使用上述方法克隆所述基因，或者例如通过选择显示底物转运增加的突变体，可以增加内源活性。
最好是通过将所述一种或多种基因整合到一种或几种基因结构中，并且将所述一种或多种基因以单拷贝或以增加的拷贝数引入到所述基因结构中，实现活性的增加。
按照本发明的定义，可以将基因结构理解为一个基因或携带按照本发明的基因的任何核苷酸序列。合适的核苷酸序列可以是，例如质粒、载体、染色体、噬菌体或不是以环状方式闭合的其它核苷酸序列。
在朝向Ery4P的物质流增加的微生物中，用于生产芳族氨基酸代谢物的第一个中间体的PEP的利用率可能受到限制。在这些情况下，减少或关闭在代谢中的其它PEP消耗反应(如果存在)是有利的，诸如PEP：糖磷酸转移酶系统(PTS)的反应，其催化PEP依赖性糖摄取。
按照本发明，可以使用显示出天然水平的PTS活性的生物；然而为了进一步改进所述方法，也可能使用其中所述PTS活性已经降低的PTS突变体。或者可以在酶水平上实现这种性质的减少，或者通过使用遗传方法实现这种性质的减少，例如通过使用用于表达pts基因的替代的强阻抑型启动子，或通过将glf基因插入到染色体中，特别是插入到ptsⅠ基因的基因座中，该方法同时包括在所述染色体中使重组DNA稳定(分离稳定性)，并因此能够无需使用载体。此外，连接一个可调节启动子的PTS的活性，也可以在培养过程中通过加入所述相关启动子的诱导物或抑制物来影响。
在按照本发明的用于生产来自芳族代谢的物质的方法中，优选使用另外参与合成这些物质的一种或多种酶去调节和/或其活性增加的微生物。
这些酶具体的说是芳族氨基酸代谢的酶，尤其是DAHP合酶、莽草酸激酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶，以及参与合成来自芳族代谢的物质的所有其它酶，特别是转醛酶、转酮酶和葡糖激酶。
除了按照本发明的酶外，特别是去调节和过量表达DAHP合酶对制备诸如己二酸、胆汁酸和醌化合物以及它们的衍生物的物质很重要。另外，为了实现过量合成例如L-色氨酸、L-酪氨酸、靛蓝以及羟基苯甲酸和氨基苯甲酸和萘醌和蒽醌和它们次级产物的衍生物，应当去调节莽草酸激酶，并增加其活性。此外，去调节和过量表达的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶对于有效生产苯丙氨酸和苯丙酮酸以及它们的衍生物也特别重要。然而，这也将包括其活性有助于下述物质生物化学合成的所有其它酶，所述物质的产量通过供给Ery4P或Ery4P和PEP而增加。
可以注意到，除了按照本发明的干涉之外，为了制备靛蓝、己二酸和其它非天然次级产物，需要对所述微生物做进一步遗传改变。这些措施是技术熟练人员已知的(Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。
按照本发明的方法适用于制备芳族氨基酸，特别是L-苯丙氨酸。在L-苯丙氨酸的情况下，最好是同时增加去调节的DAHP合酶(例如大肠杆菌中的AroF或AroH)和/或同样去调节的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)的基因表达和/或酶活性。
合适的生产生物为埃希氏菌属(Escherichia)物种，还有沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物，和由经典氨基酸方法可知的其它菌株。同样包括来自诺卡氏菌科(Nocardiaceae)和放线菌目(Actinomycetales)科的细菌。大肠杆菌特别适合。
本发明也涉及提供合适的基因结构和携带这些基因结构的转化细胞，这些使得能够特别成功地完成所述方法。
在本发明的范围内，现在可以得到新基因结构，所述重组形式的基因结构或者包括编码氧化葡萄糖的酶的基因和a)编码使葡萄糖磷酸化的酶的基因或者b)编码用于PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的基因或者c)以下三种基因中的至少两种：编码使葡萄糖磷酸化的酶的基因、编码葡糖酸内酯酶的基因或编码用于PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的基因。
具体而言，所述氧化葡萄糖的酶的基因编码葡糖脱氢酶，而所述使葡萄糖磷酸化的酶的基因编码葡糖酸激酶。
葡糖脱氢酶的基因最好得自巨大芽孢杆菌，而葡糖酸激酶的基因最好得自大肠杆菌，葡糖酸内酯酶和转运蛋白的基因最好得自运动发酵单胞菌。下述基因结构特别有利，在所述基因结构中葡糖脱氢酶的基因是来自巨大芽孢杆菌的葡糖脱氢酶Ⅳ(gdhⅣ)，葡糖酸激酶的基因gntK是来自大肠杆菌的GntK，转运蛋白和葡糖酸内酯酶的基因是来自运动发酵单胞菌的glf和gnl基因。按照通用方法分离相关的基因，转化所述细胞：例如当克隆大肠杆菌葡糖酸激酶基因gntK、巨大芽孢杆菌葡糖脱氢酶Ⅳ(gdhⅣ)基因或运动发酵单胞菌葡糖酸内酯酶(gnl)基因或转运基因glf时，聚合酶链式反应(PCR)方法适用于例如分别用大肠杆菌K-12(gntK)、巨大芽孢杆菌(gdhⅣ)和运动发酵单胞菌株ATCC 29191或ATCC 31821(gnl，glf)的染色体DNA特异性扩增所述基因。
在扩增所述DNA并在体外将其同已知载体(pGEM7、pUCBM20、pUC19或其它载体)重组后，使用化学方法、电穿孔、接合或转导来转化所述宿主细胞。
来自所述三种供体生物的gntK、gdhⅣ、gnl和glf基因的完整的核苷酸序列是已知的，并一般从可获得的来源得到，例如贮藏在诸如Heidelberg的EMBL/HUSAR的数据库中，入藏登记号为D 84362(gntK)、D 10626(gdhⅣ)、X 67189(gnl)和M 60615(glf)。使用来自大肠杆菌K-12菌株的染色体DNA特异性扩增所述基因的PCR以及由Izu等，Journal of Molecular Biology 267(1997)778-793和Tong等，Journalof Bacteriology 178(1996)3260-3269所述的基因序列适用于克隆大肠杆菌gntK基因。来自巨大芽孢杆菌的染色体DNA例如适于克隆巨大芽孢杆菌gdhⅣ基因(Nagao等，Journal of Bacteriology 174(1992)5013-5020)。
可以将分离的葡糖脱氢酶Ⅳ基因与在本发明正文所述的一种或多种基因，以任何组合一起整合到一个或几个基因结构内。不考虑对基因结构的精确定位，这产生了诸如gdhⅣ+gntK、gdhⅣ+glf、gdhⅣ+gntK+glf、gdhⅣ+gntK+gnl、gdhⅣ+gnl+glf、gdhⅣ+gntK+gnl+glf的组合。除了上述基因结构以外，任何基因结构是指另外包括一种或多种编码转酮酶、转醛酶、葡糖激酶、DAHP合酶、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶、分支酸变位酶/预苯酚盐脱氢酶或其它确实影响来自芳族代谢的物质合成的酶的基因。
当定位所述基因时，为了避免由于膜蛋白的过量表达引起的可能的负面影响，最好将glf基因以低拷贝数x(诸如x=l至l0)引入到所述一种或多种基因结构中。
包括至少一个分配给所述基因之一的调节基因序列的基因结构是有利的。
因此，最好可以在转录水平上，特别是通过强化转录信号实现调节元件的强化。这可以例如通过提高一种或多种启动子的活性而实现，而提高一种或多种启动子的活性通过改变位于所述结构基因上游的启动子序列，或通过用更有效的启动子完全替换所述启动子而实现。也可以通过在分配给所述基因的调节基因上施加合适的影响强化转录；然而，除此之外，例如通过提高信使RNA(mRNA)的稳定性，也可能强化翻译。
此外，在本发明的范围内，也可以利用带有可复制形式的按照本发明的基因结构的转化细胞。按照本发明的定义，将转化细胞理解为携带按照本发明的基因结构的任何微生物，所述基因结构在所述细胞中引起来自芳族代谢物质的生成增加。利用化学方法(HanahanJ.Mol.Biol.166(1983)557-580)，也可以利用电穿孔、接合或转导转化所述宿主细胞。
对于所述转化，优选使用其中另外参与所述物质合成的一种或多种酶去调节和/或活性增加的宿主细胞。用包含所述相关基因的基因结构转化生产芳族氨基酸或来自芳族代谢的另一物质的微生物菌株，特别是大肠杆菌。
对于用所述基因结构转化，优选使用其中PEP依赖性糖摄取系统(如果存在)的活性同时降低或切断的宿主细胞。
具体而言，提供能够生产芳族氨基酸的转化细胞，芳族氨基酸优选是L-苯丙氨酸。
因此可以提供用于微生物制备来自芳族代谢物质的方法，所述方法使用如上所述的具有如上所述基因结构的转化细胞。
在按照本发明的方法的特别优选的实施方案中，使用下述转化细胞，除了Ery4P以外，所述转化细胞也含有利用率增加的中心代谢的其它代谢物。这些代谢物的实例为α-氧代戊二酸或草酰乙酸，它们是由细胞内合成过程产生的要么是生长中的细胞通过喂养在相关化合物或其前体中可得到的，所述相关化合物诸如作为柠檬酸循环代谢物的延胡索酸或苹果酸。
菌种大肠杆菌AT2471/pGEM7gntKgdhⅣ根据布达佩斯条约的条款，于1998年4月15日保藏在DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏号DSM 12118。
使用的宿主生物，即AT2471，已由Taylor和Trotter(Bacteriol.Rev.13(1967)332-53)保藏于CGSC中，保藏号为4510，并可免费得到。
接下来的正文将表明使用的材料和方法，并以实验实施例和对比例支持本发明：通用方法
在所述遗传研究范围内，除非另有说明，否则在由Difco细菌用胰蛋白胨(10g/l)、Difco酵母提取物(5g/l)和NaCl(10g/l)组成的LB培养基中培养大肠杆菌菌种。根据所使用的菌种的抗性特性，如果必要，向所述培养基中加入氨苄青霉素(100mg/l)和氯霉素(17-34mg/l)。关于这一点预先将氨苄青霉素溶解在水中，将氯霉素预先溶解在乙醇中，然后在过滤除菌后，将所述溶液加入到已经高压灭菌的培养基中。向所述LB培养基中加入Difco细菌用琼脂(1.5％)，以制备琼脂平板。
使用市售的系统(Qiagen,Hilden)通过碱裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA。使用Chen和Kuo的方法(Nucl.Acid Res.21(1993)2260)从大肠杆菌和巨大芽孢杆菌DSM 319中分离染色体DNA。按照生产商(Boehringer,Mannheim，德国或Promega,Heidelberg，德国)的说明使用限制酶、Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ、碱性磷酸酶、RNA酶和T4 DNA连接酶。对于限制性分析，在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离DNA片段，并使用市售的系统(QuiaExⅡ,Hilden，德国)通过提取从所述琼脂糖中分离DNA片段。
在转化之前，在LB培养基中(5ml试管)于37℃和200rpm培养所述细胞2.5-3小时。在光密度(620nm)大约为0.4时，将所述细胞离心下来，并将其悬浮于十分之一体积的TSS(含有10％(w/v)PEG 8000、5％(v/v)DMSO和50mM MgCl2的LB培养基)中。于4℃同0.1-100ng的DNA一起温育30分钟，接着于37℃温育1小时后，在包含合适抗生素的LB培养基上将所述细胞铺平板。
实施例Ⅰ制备pGEM7gntKgdhⅣ，作为以质粒为基础的按照本发明的基因结构的模型
以已知的所述基因的DNA序列(描述于Nagao等，JournalBacteriology 15(1992)5013-5020)为基础，在通过聚合酶链式反应(PCR)特异性扩增巨大芽孢杆菌DSM 319的染色体DNA后，克隆编码葡糖脱氢酶Ⅳ的巨大芽孢杆菌DSM 319 gdhⅣ基因。提供具有限制酶BamHI(5′末端)和SacI(3′末端)切割位点的PCR寡核苷酸引物。引物1(BamHI)构成为5′ATG GAT CCA TGA AAA CAC TAG GAG GATTTT 3′。引物2(SacI)构成为5′GCC AGA GCT CTT TTT TCC ACATCG ATT AAA AAC TAT 3′，并与gdhⅣ基因的3′末端互补。产生的约800个碱基对的DNA扩增产物用BamHI和SacI限制酶切，然后将其与载体pGEM7连接，该载体已经用同样的方法处理(参见表1)。在菌种JM109DE3中实现转化，并在包含X-Gal和氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择。通过测定克隆的gdhⅣ基因的DNA序列检测成功的克隆。该载体(pGEM7gdhⅣ)甚至在没有T7聚合酶系统(菌株JM109DE3)时也能够表达葡糖脱氢酶Ⅳ活性(参见表2)。使用菌株大肠杆菌K-12W3110作为染色体模板，通过特异性DNA扩增克隆大肠杆菌K-12葡糖酸激酶的gntK基因。所述gntK基因的序列已经描述于Tong等，Journal of Bacteriology 178(1966)3260-3269。为了通过PCR扩增，选择另外具有EcoRI(5′)和BamHI(3′)的限制性切割位点的寡核苷酸引物。引物1构成为5′CCG AAT TCT TGT ATT GTG GGG GCA C3′，该引物结合gntK基因的5′上游；引物2构成为5′CCG GAT CCG TTAATG TAG TCA CTA CTT A 3′，并与gntK基因的3′末端互补。纯化约600个碱基对的扩增产物，用EcoRI和BamHI限制酶切，并与同样打开的载体pGEM7连接。在菌株JM109DE3中实现转化，并在包含X-Gal和氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择。通过测定克隆的gntK基因的DNA序列检测成功的克隆。该载体(pGEM7gntK)甚至在没有T7聚合酶系统(菌株JM109DE3)时也能够表达葡糖酸激酶活性(参见表2)。
通过BamHI和SacI双重限制酶切打开载体pGEM7gntK，从而组合所述gntK和gdhⅣ基因。然后将限制酶切载体pGEM7gdhⅣ后获得的含有gdhⅣ基因的800个碱基对的片段与已经以此方式打开的该载体连接。再次进行转化，并在氨苄青霉素上选择。按照本发明的新基因结构pGEM7gntKgdhⅣ介导葡糖脱氢酶Ⅳ和葡糖酸激酶GntK的活性的T7聚合酶不依赖性活性表达(参见表2)。
将已经获得的转化体以甘油培养物(30％)的形式于-80℃在LB培养基中储存。需要时，在使用前直接将所述甘油培养物解冻。
实施例Ⅱ检测葡糖脱氢酶和葡糖酸激酶的酶活性
为了检测在细菌粗提物中的酶活性，在无机培养基中培养大肠杆菌细胞和具有质粒的突变体的细胞。所述无机培养基的组成为：柠檬酸钠·3H2O(1.0g/l)、MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、K2HPO4(12.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.075g/l)和L-酪氨酸(0.04g/l)。以微量元素溶液(1ml/l)的形式加入另外的无机物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5mg/l)、MnCl2·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)组成。在水中溶解维生素Bl(5.0mg/l)，并通过过滤除菌后，将其加入到已高压灭菌的培养基中，需要时也以同样方式加入氨苄青霉素和/或氨苄青霉素和氯霉素。单独将葡萄糖(30g/l)高压灭菌，也同样将其加入到已高压灭菌的培养基中。
在100mM tris/HCl缓冲液(pH8.0)中洗涤收获的细胞。利用超声处理(装有微电极头(microtip)的Branson超声波仪250)，使用25％超声处理循环和40瓦强度，对每毫升细胞悬浮液处理4分钟，破碎沉淀的细胞。在以18,000g于4℃离心30分钟后，使用上清液(粗提物)检测所述葡糖脱氢酶和/或葡糖酸激酶的活性。
按照Harwood和Cutting,Molecular Biological Methods for Bacillus,JohnWiley＆sons检测所述葡糖脱氢酶的活性。葡糖脱氢酶催化葡萄糖氧化成葡糖酸内酯。在波长340nm利用还原的辅因子NADH+H+浓度的增加用分光光度计检测所述酶的活性。在总体积1ml的石英比色杯中进行所述检测。反应混合物组成为Tris HCl(终浓度250mM，pH8.0)，2.5mM乙二胺四乙酸钠，100mM KCl和2mM NAD。在所述缓冲液中于25℃预温育粗提物5分钟。加入葡萄糖(终浓度100mM)开始所述检测反应。在340nm监测消光度的增加。在每种情况下将不含葡萄糖的混合物用作对照。给出的葡糖脱氢酶活性的单位为U/mg，定义为每分钟每毫克蛋白形成1μmol NADH，这相当于每分钟每毫克蛋白转化1μmol葡萄糖。
如Izu等，FEBS Letters 394(1996)14-16所述检测所述粗提物中的葡糖酸激酶。
葡糖酸激酶催化葡糖酸ATP依赖性磷酸化为6-磷酸葡糖酸。在所述酶测试中，当使用NADP依赖性辅助酶6-磷酸葡糖酸脱氢酶(Boehringer Mannheim，第108405号)时，在波长340nm利用NADPH浓度的增加用分光光度计检测形成的6-磷酸葡糖酸。在该方面，形成1μmol NADPH相当于磷酸化1μmol葡糖酸。在总体积1ml的石英比色杯中于25℃进行酶检测。反应混合物含有50mM Tris HCl,pH8.0,100mM ATP,0.25mM NADP，1.2单位辅助酶6-磷酸葡糖酸脱氢酶和可变量的粗提物。所述混合物于25℃预温育5分钟，通过加入葡糖酸(pH6.8；在混合物中的终浓度为10mM)开始所述反应。未加入葡糖酸的混合物用作对照。
按照Bradford M.M.(Anal.Biochem.72(1976)248-254)，使用市售显色试剂检测所述粗提物中的蛋白浓度。牛血清白蛋白用作标准。
表2显示了在使用宿主菌株大肠杆菌W3110和带有质粒pGEM7gdhⅣ、pGEM7gntK或pGEM7gntKgdhⅣ的其突变体时酶检测的结果。我们发现，当使用已经描述的按照本发明的基因结构时，可以按照本发明在细胞中以功能方式表达所述酶。
实施例Ⅲ用显示葡糖脱氢酶活性增加的菌株生产物质
在实施例Ⅱ所述的无机培养基中检测大肠杆菌AT2471和大肠杆菌AT2471/pGEM7gdhⅣ的合成效率。为此用2毫升甘油培养物接种摇瓶(1000ml，含有100ml培养基)，并在定轨摇床上于37℃和150rpm温育摇瓶72小时。以大约12小时的间隔检测所述培养物的pH值，如果需要，通过加入KOH(45％)，使其恢复到7.2的起始值。另外，在24和48小时后取样(2ml)，检测光密度以及葡萄糖和L-苯丙氨酸的浓度。
利用高压液相层析(HPLC,Hewlett Packard，慕尼黑，德国)结合荧光检测(消光335nm，发射570nm)确定苯丙氨酸浓度，使用nucleosil-120-8 C18柱(250×4.6毫米)作为固相；利用梯度进行洗脱(洗脱液A：90％50mM磷酸，10％甲醇，pH2.5；洗脱液B：20％50mM磷酸，80％甲醇，pH2.5；梯度：0-8分钟，100％A；8-13分钟，0％A；13-19分钟，100％A)。将洗脱速率设定在1.0ml/分钟；将柱温设定在40℃。在室温下于反应毛细管(14米×0.35毫米)中使用邻苯二醛进行柱后衍生。在所述条件下发现L-苯丙氨酸的保留时间为6.7分钟。
用酶测试条(strip)(Diabur,Boehringer Mannheim，德国)检测葡萄糖浓度，不管结果如何，接着计量加入2ml浓缩的葡萄糖溶液(500g/l)，确保在实验混合物中葡萄糖没有成为限制因素。
培养48小时后，仅仅引入质粒pGEM7gdhⅣ造成描述苯丙氨酸浓度的指示值达到145，此值是与宿主菌株大肠杆菌AT2471的指示值(苯丙氨酸)100相比得出。这个结果证实，按照本发明在生产物质的微生物中增加葡糖脱氢酶的活性具有增加芳族化合物合成的效应。
实施例4使用菌株生产物质，在所述菌株中除了所述葡糖脱氢酶活性增加外，还表达PEP不依赖性糖摄取系统
使用质粒pZY600(Weisser等，J.Bacteriol.177(1995)3351-3345)作为模板扩增运动发酵单胞菌glf基因。同时，选择引物导致引入一个BamHI切割位点和一个KpnI切割位点。使用这些独特的切割位点将所述基因插入到同样用BamHI和KpnI打开的载体pUCBM20(Boehringer Mannheim)中。通过用BamHI和HindⅢ限制酶切，从该载体(pBM20glf)中分离出1.5kb大小的DNA片，并连接到同样用限制酶BamHI和HindⅢ打开的载体质粒pZY507(Weisser等，J.Bacteriol.177(1995)3351-3345)。在转化大肠杆菌并克隆所述转化体后得到重组质粒pZY507glf。此载体赋予对氯霉素的抗性，含有lacIq-tac启动子系统并具有低拷贝数。
将载体pZY507glf和如实施例Ⅰ所述获得的本发明的基因结构一起转化到宿主菌株AT2471中。
在实施例Ⅲ所述的实验条件下，在所有情况下在两个平行的混合物中培养突变体大肠杆菌AT2471glf、大肠杆菌AT2471glf/pGEM7、大肠杆菌AT2471glf/pGEM7gntK和大肠杆菌AT2471glf/pGEM7gntKgdhⅣ。48小时后，检测培养基中的L-苯丙氨酸浓度。
与起始菌株大肠杆菌AT2471glf(它获得的L-苯丙氨酸浓度相当于指示值100)相比，载体pGEM7的存在使指示值为96，并因此实际上获得了同样的浓度。相比之下，使用大肠杆菌AT2471glf/pGEM7gntK产生的L-苯丙氨酸浓度相当于指示值为179(与先前提到的菌株相比)。在大肠杆菌AT2471glf/pGEMgntKgdhⅣ中同时表达两个替代代谢基因，即葡糖脱氢酶和葡糖酸激酶，使得表示苯丙氨酸浓度的指示值进一步增加到195成为可能。
这个结果证实，通过引入葡糖脱氢酶活性和增加葡糖酸激酶的活性表达一个替代代谢途径，特别是在同时转化和表达PEP不依赖性糖摄取系统的那些微生物中对L-苯丙氨酸的合成有正面影响。
实施例Ⅴ使用PTS-突变体生产物质，在所述突变体中除了增加葡糖脱氢酶活性外，还表达PEP不依赖性糖摄取系统
为了将所述glf基因整合到编码大肠杆菌PTS系统组分的基因中，用BglⅡ消化质粒pPTS1，并对其用克列诺片段处理。唯一的切割位点位于ptsI基因中。从质粒pBM20glfglk中分离作为BanHI/KpnI片段的glf基因，并同样对其用克列诺片段处理。通过平端连接获得具有与ptsHI基因相同方向的glf基因的克隆。从所得的质粒pPTSglf中获得具有ptsH基因的3′区和具有整合的glf和crr的ptsI的4.6kb的PstI片段。将该片段连接入载体pGP704的EcoRV切割位点。因为该载体只能在λpir菌株中复制，所以如果不含有该噬菌体的转化体能在羧苄青霉素中生长，那么它们就已经将所述载体整合到染色体中。通过DNA印迹分析(Miller V.L.等，J.Bateriol.170(1988)2575-83)检查所述整合。所得的转化体除了包括所述glf基因外，还包括完整的PTS基因。
可以在第二次同源交换中重组所述载体部分，导致羧苄青霉素抗性丧失。因为在这种情况下，通过插入glf基因间断pts基因，所以在这些突变体中没有以功能方式表达所述PTS。如下选择所需的PTS-突变体：在没有抗生素的LB培养基中重复传代培养仍然是PTS+的转化体后，将等份的细胞悬浮液在包含100μg/l磷霉素(phosphomycin)的LB板上倒平板。PTS-突变体能够在这些平板上生长。在包含或者磷霉素或者20μg/l的羧苄青霉素的LB平板上将生长的克隆划线接种。从在磷霉素平板上显示重新生长、但在羧苄青霉素平板上不能生长的克隆中分离染色体DNA。通过DNA印迹分析证实了，glf基因整合到编码PTS系统的基因中。对应的突变体被鉴定为在表型上是PTS缺陷型。
选择一个克隆作为宿主生物大肠杆菌AT247lglfintPTS-，并将其用于用质粒pGEM7gntKgdhⅣ的转化(参见上文)。
按照实施例Ⅲ和Ⅳ所述实验条件，在每种情况下在两个平行混合物中，培养PTS阴性突变体大肠杆菌AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhⅣ和对应的宿主菌株AT2471glfintPTS-。培养48小时后，由结果计算总体生物量-比产出率(integral，biomass-specificproduction)。
与宿主菌株AT2471glfintPTS-(用指示值100表示其总体生物量-比产出率)相比，所述突变体AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhⅣ获得的总体生物量-比产出率指示值为133。
这个结果证实，引入活性葡糖脱氢酶和增加葡糖酸激酶的活性，特别在特征为PTS系统的活性减少或者完全切断、同时已将PEP不依赖性糖摄取系统整合到其中的那些微生物中，对苯丙氨酸的合成产量有正面影响。表1：菌株                基因型/特征                           来源或参考文献
巨大芽孢杆菌DSM 319  gdhⅣ基因供体 Nagao等，J.Bacteriol.174,5013-5020
大肠杆菌AT2471 tyrA4,relA1,spoT1,thi-1  Taylor和Trotter,Bacteriol.Rev.13(1967)332-53
JM109DE3 Δ(pro-lac)/F′pro+lacZΔM15；具有T7 RNA聚合酶的基因 Promega Co.
大肠杆菌K-12W3110  F-，原养野生型菌株，thi-1；gntK基因供体 Coli Genetic StockCenter,Yale University,New Haven,CT，美国
质粒pZY507  Cm2  Weisser等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4
pZY507glf 在pZY507中的运动发酵单胞菌glf基因 Weisser等，J.Bacteriol177(1995)3351-4
pGEM7 ApR；T7和SP6启动子 Promega Co.
pGEM7gntK 含有大肠杆菌gntK基因的pGEM7 本申请
pGEM7gdhⅣ 含有巨大芽孢杆菌gdhⅣ基因的pGEM7 本申请
pGEM7gntKgdhⅣ 含有gntK和gdhⅣ基因的pGEM7 本申请
表2具有不同基因结构的大肠杆菌粗提物中葡糖脱氢酶和葡糖酸激酶的活性的检测菌株                        葡糖脱氢酶的比   葡糖酸激酶的比
                        活                活W3110/pGEM7                  n.d.a.                 n.d.a.W3110/pGEM7gdhⅣ             0.4U/mg                 n.d.W3110/pGEM7gntK               n.d.a.              0.9U/mgW3110/pGEM7gntKgdhⅣ         1.0U/mg              0.9U/mgn.d.a.=无可检测的活性；n.d.=未检测

Claims (29)

1．用于微生物制备来自芳族代谢物质的方法，其中在生产这些物质的微生物中由于增加氧化葡萄糖的酶的活性而转化含葡萄糖底物。
2．按照权利要求1的方法，其特征在于，将葡糖脱氢酶活性引入到所述微生物中和/或在所述微生物中增加葡糖脱氢酶的活性。
3．按照权利要求2的方法，其特征在于，将巨大芽孢杆菌葡糖脱氢酶活性引入到所述微生物中和/或在所述微生物中增加巨大芽孢杆菌葡糖脱氢酶活性。
4．按照权利要求2或3的方法，其特征在于，将巨大芽孢杆菌葡糖脱氢酶Ⅳ活性引入到所述微生物中和/或在所述微生物中增加巨大芽孢杆菌葡糖脱氢酶Ⅳ活性。
5．按照权利要求1-4之一的方法，其特征在于，额外增加使葡萄糖磷酸化的酶活性。
6．按照权利要求5的方法，其特征在于，增加葡糖酸激酶活性。
7．按照权利要求5或6的方法，其特征在于，增加大肠杆菌葡糖酸激酶活性。
8．按照权利要求2-7之一的方法，其特征在于，额外增加葡糖酸内酯酶活性，特别是增加运动发酵单胞菌葡糖酸内酯酶活性。
9．按照权利要求1-8之一的方法，其特征在于，额外增加PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的活性。
10．按照权利要求9的方法，其特征在于，所述转运蛋白是易化蛋白。
11．按照权利要求9或10的方法，其特征在于，所述易化蛋白是运动发酵单胞菌葡萄糖易化蛋白(Glf)。
12．按照权利要求2-11之一的方法，其特征在于，
a)通过引入所述基因
b)和/或通过增加所述基因拷贝数
c)和/或通过增加基因表达
d)和/或通过增加所述酶的内源活性
e)和/或通过改变所述酶的结构
f)和/或通过使用去调节的酶
g)和/或通过引入编码去调节的酶的基因
增加氧化葡萄糖的酶活性或增加氧化葡萄糖的酶，并另外增加使葡萄糖磷酸化的酶、葡糖酸内酯酶和PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的活性中的至少一种活性。
13．按照权利要求12的方法，其特征在于，通过将一种或多种基因整合到一种或几种基因结构中实现所述活性的增加，而所述一种或多种基因作为单拷贝或以增加的拷贝数引入到所述基因结构中。
14．按照权利要求9-13之一的方法，其特征在于，如果存在PEP依赖性糖摄取系统，则另外降低或消除其活性。
15．按照权利要求1-14之一的方法，其特征在于，使用另外参与所述物质合成的一种或多种酶去调节和/或显示活性增加的微生物。
16．按照权利要求1-15的方法，其特征在于，制备的所述物质是芳族氨基酸。
17．按照权利要求16的方法，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
18．按照权利要求1-17之一的方法，其特征在于，使用的微生物属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽胞杆菌属、棒状杆菌属或短杆菌属。
19．按照权利要求18的方法，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
20．基因结构，以重组形式包括或者编码氧化葡萄糖的酶的基因和编码使葡萄糖磷酸化的酶的基因；或者编码氧化葡萄糖的酶的基因和编码PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的基因；或者编码氧化葡萄糖的酶的基因和以下三种基因中的至少两种基因，即编码使葡萄糖磷酸化的酶的基因、编码葡糖酸内酯酶的基因或编码PEP不依赖性糖摄取的转运蛋白的基因。
21．按照权利要求20的基因结构，其特征在于，所述氧化葡萄糖的酶的基因编码葡糖脱氢酶，而所述使葡萄糖磷酸化的酶的基因编码葡糖酸激酶。
22．按照权利要求20或21的基因结构，其特征在于，所述葡糖脱氢酶的基因得自巨大芽孢杆菌，所述葡糖酸激酶的基因得自大肠杆菌，而所述葡糖酸内酯酶和所述转运蛋白的基因得自运动发酵单胞菌。
23．转化细胞，带有可复制形式的按照权利要求20-22的一种基因结构。
24．按照权利要求23的转化细胞，其特征在于，在所述细胞中，另外参与所述物质合成的一种或多种酶去调节和/或显示活性增加。
25．按照权利要求23或24的转化细胞，其特征在于，所述细胞是大肠杆菌细胞。
26．按照权利要求23-25之一的转化细胞，其特征在于，如果存在PEP依赖性糖摄取系统，那么另外降低或消除所述系统的活性。
27．按照权利要求23-26之一的转化细胞，其特征在于，它能够生产芳族氨基酸。
28．按照权利要求27的转化细胞，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
29．按照权利要求1-19之一的微生物制备物质的方法，其特征在于，使用按照权利要求23-28之一的转化细胞，在所述转化细胞中，存在按照权利要求20-22之一的基因结构。
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