CN102212569A - 一种提高l-苯丙氨酸生产强度的酪氨酸流加方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高L-苯丙氨酸生产强度的酪氨酸流加方法，属于生物工程技术领域。本发明以L-酪氨酸(L-Tyr)缺陷型的大肠杆菌为出发菌株，在初始培养基中L-Tyr消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-Tyr至发酵结束。本发明优点在于：减少了有害副产物乙酸的产生，提高了发酵过程菌体的代谢活性；使与生长代谢部分偶联的L-Phe生产过程得到加强，提高了L-Phe对葡萄糖底物的的率系数；提高了单位体积和时间内L-Phe的产量，减少了发酵周期，提高了生产强度。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高L-苯丙氨酸生产强度的酪氨酸流加方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-苯丙氨酸(L-Phe)是人体必需但自身无法合成的八种氨基酸之一，也是一种重要的医药和食用化学品中间体。在医药行业主要用于生产氨基酸输液和合成氨基酸类药物；在食品行业主要用于合成二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame，简称APM)，具有良好的应用前景。L-Phe的制备方法主要有提取法、化学合成法、酶法和发酵法四种。其中提取法因为含量低，很少采用。目前市场所需的产品除少量化学合成外大多都是通过微生物发酵生产的，但主要依赖进口。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：适合于大肠杆菌的L-苯丙氨酸的高密度生产方法。
为解决上述技术问题，提供技术方案为：以L-酪氨酸(L-Tyr)缺陷型的大肠杆菌为出发菌株，在初始培养基中L-Tyr消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-Tyr至发酵结束。
特别地，控制残糖浓度为5±3g/L以内，在初始培养基中L-Tyr消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-Tyr至发酵结束。
所述L-酪氨酸(L-Tyr)缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)WSH-BR165(pAP03)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2010年1月18日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏编号为CCTCC M 2010013，详见专利申请201010135604.9。
培养基成分：
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH调至7.2；接种前加入卡那霉素至40mg/L。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 3，NaCl1，Na-Citrate 1.5，CaCl2·2H2O 0.015，FeSO4·7H2O 0.1125，维生素B1-HCl 0.075，L-Tyr 0.3，蛋白胨4，酵母粉2，微量元素营养液(TES)1.5mL/L，卡纳霉素0.04，pH调至6.8。
TES(g/L)：Al2(SO4)3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，CuSO4·5H2O 2.5，H3BO30.5，MnSO4·7H2O 24，Na2MoO4·2H2O 3.0，NiSO4·6H2O 2.5，and ZnSO4·7H2O 15。
培养方法：
三角摇瓶中的种子培养方法：接种量10％，温度37℃，摇床转速200r/min。
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃，并开始流加L-Tyr至发酵结束。
发酵过程中初始糖耗至5g/L时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束。通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3，流速为25mg/h，50mg/h，75mg/h and100mg/h的L-Tyr流加的实施方法为：将0.9g，1.8g，2.7g与3.6g L-Tyr溶解于72mL的28％(v/v)的氨水中后于升温诱导后以2mL/h的速度泵入发酵液中。
所述控制发酵过程中糖浓度的方法为：通过每2h测定实际残糖浓度，通过调节葡萄糖溶液流加速率控制残糖浓度在5g/L±3g/L。
残糖的测定方法：取发酵上清液，稀释一百倍后，使用葡萄糖-谷氨酸盐分析仪SBA-40C测定残糖。
细胞干重(DCW)的测定方法为：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加去离子水定容，摇匀，用722型可见分光光度计，于610nm处比色测OD值，利用细胞干重标准曲线算得细胞干重，若测摇瓶发酵培养中的菌体浓度则在定容前加2mL 2N的盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙。
L-苯丙氨酸浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法，高效液相色谱(HPLC)柱前衍生化方法进行测定(Rapid，accurate，sensitive，and reproducible HPLC analysis of amino acids.Henderson，J.W，Ricker，R.D.，Bidlingmeyer，B.A.，Woodward，C.，Agilent Technologies，USA，2000)。
本发明优点在于：
1)减少了有害副产物乙酸的产生，提高了发酵过程菌体的代谢活性；
2)使与生长代谢部分偶联的L-Phe生产过程得到加强，提高了L-Phe对葡萄糖底物的的率系数；
3)提高了单位体积和时间内L-Phe的产量，减少了发酵周期，提高了生产强度。
具体实施方式
对比例
培养基组成详见发明内容部分。
三角摇瓶中的种子培养方法：接种量10％，温度37℃，摇床转速200r/min。
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃。以恒定的速度F＝15mL/h向发酵液中流加700g/L的葡萄糖溶液直至发酵结束，发酵过程中通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
当菌体浓度达到11.5g/L而升温诱导时刚好耗完。此后菌浓基本不再变化，而菌体随时间的代谢活性的变化使得其对底物的需求量随时间变化，因此在恒速流加葡萄糖的对比例中，残糖浓度处于有上升趋势的变动中。在30h后，监测到残糖浓度开始大于10g/L，发酵液中开始积累有害的副产物乙酸，乙酸浓度积累至5g/L以上。
实施例一
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃，当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
与对照相似，当初始L-Tyr消耗完后，菌体浓度基本不变，保持在最大菌浓11.5g/L左右。诱导后底物葡萄糖一直被维持在适合L-Phe生产的浓度，在发酵过程中乙酸浓度始终维持在3g/L以下，没有有害副产物的积累所带来的影响，结果见表1。
实施例二
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃，当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
将0.9g L-Tyr溶解于72mL的28％(v/v)的氨水中后于升温诱导后以2mL/h的速度泵入发酵液中，即以25mg/h恒速流加L-Tyr。
经检测升温诱导后发酵液中L-Tyr已经消耗完，由于其线性的流加方式，菌体生长的比生长速率在不停的减小，结果见表1。
实施例三
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃，当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
将1.8g L-Tyr溶解于72mL的28％(v/v)的氨水中后于升温诱导后以2mL/h的速度泵入发酵液中，即以50mg/h恒速流加L-Tyr。
菌体的平均比生长速率较大，得到了较高的最大菌体量，详见表1。
实施例四
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃，当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
将2.7g L-Tyr溶解于72mL的28％(v/v)的氨水中后于升温诱导后以2mL/h的速度泵入发酵液中，即以75mg/h恒速流加L-Tyr。
菌体的平均比生长速率较大，得到了较高的最大菌体量，详见表1。
实施例五
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.5L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为40％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当OD610达到0.2时便升温至38.5℃，当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
将3.6g L-Tyr溶解于72mL的28％(v/v)的氨水中后于升温诱导后以2mL/h的速度泵入发酵液中，即以100mg/h恒速流加L-Tyr。结果详见表1。
表1发酵结果
Claims (6)
1.一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，以L-酪氨酸缺陷型的大肠杆菌为出发菌株，其特征在于，在初始培养基中L-酪氨酸消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-酪氨酸至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，初始培养基中残糖浓度下降到5g/L时，通过流加葡萄糖的方式，控制发酵过程中控制残糖浓度在5±3g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010013。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液浓度为700g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以L-酪氨酸缺陷型的大肠杆菌CCTCC M 2010013为出发菌株，在初始培养基中L-酪氨酸消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-酪氨酸至发酵结束，发酵过程中初始糖耗至5g/L时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以L-酪氨酸缺陷型的大肠杆菌CCTCC M 2010013为出发菌株，在初始培养基中L-酪氨酸消耗完后，以75mg/h恒速流加L-酪氨酸至发酵结束，发酵过程中初始糖耗至5g/L时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
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