JP2012526552A - エタノール生産におけるトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した発現及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、2009年5月15日出願の米国特許仮出願第61/178,672号、2009年8月19日出願の米国特許仮出願第61/235,340号、及び2010年1月4日出願の米国特許仮出願第61/292,094号の優先権を主張する。
本発明は、米国エネルギー省(U.S.Department of Energy)によって与えられた、契約番号第US DOE FG02−96ER20222号、第DE−FG36−08GO88142号、及び第DE−FC36−GO17058号の下での米国政府の支援を得て行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
(a)細菌の候補株をフルフラールの存在下で増殖させること;及び
(b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること
を含む工程によって調製される、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
本明細書で使用される、「単離された」は、他の細菌による汚染がないことを意味する。単離された細菌は、その単離細菌の特性及び機能を妨げない少量の他の細菌の存在下で存在し得る。単離された細菌は、一般に少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%純粋である。好ましくは、本発明による単離された細菌は少なくとも98%又は少なくとも99%純粋である。
本発明は、エタノールの形成のために糖類を分解するのに適した細菌に関する。この細菌は、特にフルフラール及び/又は5−HMFを含む培地において、改善されたエタノール生産能力を有する。改善されたエタノール生産の能力は、糖消化及び発酵の間のフルフラール及び/又は5−HMFに対する細胞の耐性を増大するトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の選択された増大した発現に関連する。
本発明はさらに、フルフラール及び/又は5−HMFの存在下での、例えば増大したフルフラール及び/又は5−HMFの存在下でのエタノール生産のために糖類を発酵させるのに適した細菌を生産する方法に関する。従って、本発明は、参照細菌と比較してpntA及びpntB遺伝子の発現又はPntABポリペプチドの活性が増大しており、参照細菌と比較してフルフラール及び/又は5−HMF耐性が増大しており、細菌はエタノールを生産することができ、細菌はフルフラール及び/又は5−HMFの存在下で細菌の候補株を増殖させることと、フルフラール及び/又は5−HMFの存在下でエタノールを生産する細菌を選択することとを含む工程によって調製される、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
本発明の細菌は、エタノールの生産のために糖類を分解するのに適している。従って、本発明は、上述した本発明の単離された細菌又は組換え細菌と供給源を接触させ、それによって供給源からエタノールを生産することを含む、供給源からエタノールを生産する方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、供給源は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス若しくはオリゴ糖源、又はそれらの何れかの組合せから成る群より選択できる。
LY168株は、ヘミセルロース加水分解物における糖類の発酵に関してこれまでに記述されている。LY180(NRRL B−50239)を生じさせる基質範囲を改善するためにいくつかの変更を加えた(ラクトース利用の回復、エンドグルカナーゼの組込み及びセロビオース利用の組込み)。これらの菌株についての関連する特徴を以下の表1に示す。表1に示す組込みのために使用した線状フラグメントはGenBankに寄託されている。
エタノール生産性菌株を、固体培地については20g/lキシロースを添加し、発酵実験については50g/lキシロース又はそれ以上を添加したAM1無機塩培地に保持した(22)。大腸菌株LY180(48、60)はKO11の誘導体であり、この試験のための出発点として使用した。大腸菌W(ATCC9637)は、当初大腸菌Bの誘導体であると報告された、KO11株の親であることに留意されたい(29)。
大腸菌トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を、隣接するHindIII部位を提供するプライマによりBioRad iCycler(Hercules,CA)を用いてLY180株ゲノムDNAから増幅した(リボソーム結合部位、コード領域、及び200bpのターミネータ領域)(25)。HindIIIで消化した後、生成物をHindIII消化したpTrc99a(ベクタ)に連結し、大腸菌TOP10F’(Carlsbad,CA)に形質転換した。QiaPrep Spin Mini Prep Kit(Valencia,CA)を用いてプラスミドを精製した。制限酵素での消化及びポリメラーゼ連鎖反応によって遺伝子の配向性を確認した(図10の表1)。
培養物を小さな発酵槽で670mg dcw/lの密度に増殖させた。初期試料を取り出し、対照として使用した。50g/l保存水溶液から直ちにフルフラールを添加して(最終濃度0.5g/l)、2回目の試料採取の前に15分間培養を続けた。試料をエタノール−ドライアイス浴中で急速に冷却し、4℃で遠心分離によって採取し、Qiagen RNA Laterに再懸濁して、−80℃で保存した。Qiagen RNeasy Mini Kitを用いてRNAを抽出し、DNase Iで処理して、フェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。大腸菌K12のために設計されたプローブを使用したマイクロアレイ比較のために、RNAをNimbleGen(Madison,WI)に送付した。各々の試料は、4つの発酵槽からのプールされた材料から成っていた。完全な実験を2回実施して、データを平均した(8つの発酵槽)。ArrayStar(DNA Star,Madison,WI)及びSimPhenyソフトウエア(Genomatica Inc.,San Diego,CA)を使用してデータを解析した。発現比を2つのプールされたデータセットの平均として提示する。対照として水だけを添加した実験では、54の遺伝子(>トランスクリプトームの2%)が水の添加後に2倍より大きく変化することが認められた。これらのうち8つだけがフルフラール添加によって影響を受け、フルフラール送達手順の転写への影響がフルフラールの作用に比べて無視し得るものであることを指示した。
ネットワーク成分解析(Network Component Analysis;NCA)は、発現比及び公知の調節関係から転写因子活性比を計算するものであり、これを先に記述されているように実施した(45、46、56)。関連性ファイルをRegulon DB及びEcoCyc(4、14)に従って更新した。「緊縮調節因子」のレギュロンを、MOPSグルコース中のBW25113の中間対数増殖の間のセリンヒドロキサメート処理によるセリン飢餓に対する5分間応答の分析により、先に記述されているように定義した(12)。有意に変化した調節活性を有する調節因子を、ヌル分布との比較によって及び0.05のP値カットオフを使用して同定した。
活発に増殖している細胞において0.5g/lフルフラールの添加前と添加の15分後にメッセージレベルを比較した。水対照も比較のために含めた。小さな群の遺伝子の発現がフルフラールに応答して5倍より大きく変化していることが認められた(図12の表3)。よりストリンジェントでない測定基準(2倍又はそれ以上)を使用すると、約400の遺伝子(トランスクリプトームの10%)についての発現レベルが、水対照又はフルフラール添加前の培養物と比較して、フルフラール添加に応答して変化した。これらの変化した遺伝子の分布は機能群の間で大きく異なっており、フルフラールの作用機構に関する有用な洞察を提供した(図11の表2)。大部分の機能群では、遺伝子成員の10%未満の発現レベルが2倍又はそれ以上変化した。この低頻度の変化を有する群は、補因子、炭素化合物、調節、高分子合成(細胞構造、DNA、脂質、転写及び翻訳)、及びその他(ファージ、推定上/IS、調節及び未分類/不明)を含んだ。4つの群(細胞プロセス、中枢代謝、エネルギー及び輸送)では成員遺伝子の10%〜20%についての発現レベルが変化した。中枢代謝、エネルギー及び輸送に関連する、影響を受けた遺伝子の大部分は、フルフラール添加時に発現が増大した。これらの変化は、利用可能であり得る付加的な化合物を捕捉し、代謝する、及びエネルギー産生のための炭素流を増大させる機会を提供する。細胞プロセスに関係する変化した遺伝子の多くは運動性及び化学走性に関与するが、LY180株は非運動性である(データは示していない)。
フルフラールに対する細胞応答の全体的見解を提供するためにネットワーク成分解析(NCA)を用いた。この解析は、トランスクリプトームデータから、摂動活性を有する調節因子を同定するために公知の調節ネットワーク構造を利用する(46、56)。この解析に含まれた60の調節因子のうちで、22がフルフラール負荷後に有意に変化した発現を有すると同定され、有意性はランダムネットワークに対して評価した(図6A)。システイン及びメチオニン生合成の調節因子(CysB及びMetJ)並びにアミノ酸のリプレッサ(ArgR)及びヌクレオチド生合成のリプレッサ(PurR)は、フルフラール添加によって有意に影響された。緊縮応答(アミノ酸及び炭素飢餓の間、資源を増殖から転用すること)の集合的なインジケータである緊縮調節因子も、停滞した生合成及び多くの中間体の過剰と一致する活性化を示す。合わせて考慮すると、これらの結果は、多くのアミノ酸及び生合成中間体のプールがフルフラール添加によって変化していたことを示す。システイン及びメチオニン生合成に関与する遺伝子の発現は増大したが、大部分の他の生合成経路の発現減少したという事実は、フルフラール負荷から生じる初期事象としてのシステイン及びメチオニンプールの枯渇と一致する。
硫黄のシステイン及びメチオニンへの同化に関与する多くの遺伝子(cysC、cysH、cysI、cysM、cysN、cysQ、metA、metB、metC、metL、sbp、tauA、tauB、tauC及びtauD)は2倍又はそれ以上増大した。これらはいくつかの機能群内に散らばっている(図11の表2):アミノ酸、中枢代謝、調節及び輸送。硫黄の同化に関与する多くの付加的な遺伝子も2倍未満上方調節されて、幅広いフルフラール応答を明らかにするために含めている(図8)。硫黄はAM1培地中で硫酸塩として供給され、4分子のNADPHを必要とするエネルギー消費型反応である、組込みのために硫化水素のレベルに還元されねばならない。これらの遺伝子の発現のフルフラール誘導性増大は、アミノ酸、プリン及びピリミジンの生合成に関与する多くの他の遺伝子について認められる減少とは著しい対照を成している(図11の表2)。タウリン輸送遺伝子(tauABCD;硫黄の選択的供給源)、硫酸塩結合性輸送タンパク質(sbp)、及び多くのシステイン生合成遺伝子の転写活性化因子(cbl)の発現は、添加されたフルフラールに応答して5倍を超えて増大した(図12の表3)。合わせて考慮すると、これらの結果は、フルフラールの添加が、この経路における高いNADPH必要量に関連した含硫アミノ酸(システイン及びメチオニン)の細胞内欠乏を生じさせることを明らかにしている。
20アミノ酸すべてを、AM1無機塩培地におけるLY180の増殖を改善するそれらの能力に関して個別に試験した(図9A)。個々のアミノ酸の細胞含量におおよそ基づいて0.1mMの濃度を選択した(50)。5つのアミノ酸だけが、この低濃度で供給した場合にフルフラール耐性を改善した:システイン>メチオニン>セリン、アルギニン>ヒスチジン。2つの含硫アミノ酸は、フルフラール耐性のために明らかに最も有益であった。5倍高い濃度(0.5mM)で供給した場合は、すべてのアミノ酸がある程度まで有益であった(図9B)。しかし、システインが最も有効であることは変わらず、次いでセリン、メチオニン及びアルギニンであった。0.05mMのシステイン濃度では、LY180は、総細胞硫黄量にほぼ等しい、1g/lフルフラールの存在下で0.8g/lの密度に増殖することが可能であった(図4C)。0.01mMシステインではフルフラール耐性の測定可能な改善は認められなかった。
フルフラールの添加は増殖を阻害し、硫黄の同化に関与する遺伝子の転写を増大させた。選択的硫黄化合物、タウリンの取込み及び組込みに関与する遺伝子(tauABC及びtauD)は、最大の発現増大を有する10遺伝子に含まれた(図12の表3)。tau遺伝子は、典型的には硫黄飢餓の間だけ発現される(57)。システインはフルフラール阻害を取り除くのに有効であったので、これらの遺伝子の発現増大はフルフラールによる含硫アミノ酸のプールの減少から生じる。フルフラールは、硫酸塩からの還元硫黄(H2S)のアベイラビリティを制限することによって又は還元硫黄のシステインへの組込みを阻害することによって、含硫アミノ酸の生合成を阻害する。
ヘミセルロース加水分解物中に存在するフラン阻害剤を耐容する生物触媒の能力は、再生可能な化学物質の生産のために重要である。この実施例は、エタノール生産性大腸菌(E.coli)LY180のフルフラール耐性変異株であるEMFR9が、5−ヒドロキシメチルフルフラール(5−HMF)に対する耐性も獲得していることを明らかにする。フラン耐性は、NADPHに対して低いKmを有する2つのフランレダクターゼ、yqhD及びdkgAのより低い発現から生じる。フラン耐性はまた、NADPH/NADHトランスヒドロゲナーゼ(pntAB)をコードするプラスミドを付加することによっても増大した。
菌株、培地及び増殖条件
この試験で使用した菌株及びプラスミドは以前に記述されている(70及び23)。これらは、LY180(大腸菌のエタノール生産性誘導体)、EMFR9(LY180のフルフラール耐性誘導体)、LY180ΔyqhD、LY180ΔdkgA、LY180ΔyqhDΔdkgA、yqhDを含有するpLOI4301を含む。dkgAを含有するプラスミドpLOI4303(48)、及びpntABを含有するpLOI4316(70)も使用した。培養物を、20g/lキシロース(固体培地)、50g/lキシロース(Bioscreen C増殖アナライザ及び試験管培養物)、又は100g/l(pH制御発酵)を含むAM1最小培地(23)において37℃で増殖させた。
AM1及び0.1mMのIPTGを含む培養試験管(13×100mm)を0.05OD550nmに接種し、37℃で培養した。これらを1〜2OD550nmの密度で採取した。細胞ペレットを100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で1回洗浄して、10OD550nmの密度で緩衝液に再懸濁した。試料(1ml)を、Lysing Matrix Bを含む2ml試験管に添加し、FastPrep−24(MP Biomedicals,Solon,OH)を用いて破壊した(20秒間)。NADPHのフラン依存性酸化を、DU800分光光度計(Beckman Coulter,Fullerton,CA)を用いて340nmで測定した。反応物(総容量200μl;37℃)は、粗抽出物50μL、0.2mMのNADPH及び20mMの5−HMFを含んでいた。BCAアッセイ(Thermo Scientific,Rockford,IL)を用いてタンパク質を測定した。
データを平均±SD(n≧3)として提示する。Graphpad Prismソフトウエア(La Jolla,CA)を使用して統計比較(両側スチューデントt検定)を行った。
EMFR9株は5−HMFに対する増大した耐性を示す
フルフラール耐性変異株、EMFR9中に存在する突然変異は、5−HMFに対する耐性も増大させた(図14)。1.0g/Lの5−HMFで、EMFR9による増殖及びエタノール生産は、5−HMFの不在下でのLY180(親)のものに等しかった(図14A、14B)。5−HMFは、細胞収率又はエタノール収率に有害な影響を及ぼさずに発酵の最初の24時間にEMFR9によって速やかに代謝された。LY180は1.0g/lの5−HMFによって完全に阻害されたが、5−HMFレベルは培養の間緩やかに減少した(図14A、14B及び14C)。接種しない場合は減少が認められず(データは示していない)、これが代謝作用の結果であることを確認した。
EMFR9におけるフルフラール耐性は、2つのNADPH依存性オキシドレダクターゼ、YqhD及びDkgAのサイレンシングから生じることが以前に明らかにされた(23)。これらの活性をコードする遺伝子をpCR2.1 TOPOにクローニングし、EMFR9に形質転換して、0.1mMのIPTGで誘導した。細胞を採取し、破壊して、5−HMFレダクターゼ活性に関して試験した(図15A)。プラスミドからの個別のyqhD及びdkgAの発現は、NADPHの5−HMF依存性酸化の速度の5倍増大を生じさせ、YqhD及びDkgAが5−HMFを基質として利用することを確認した。
NADPHのアベイラビリティを高めるためにプロトン転位トランスヒドロゲナーゼpntAB(68)をLY180において過剰発現させた(図16)。阻害剤の不在下では(図16A)、ベクタを含むLY180(対照)及びLY180(pTrc99a pntAB)の両方が同じ速度で増殖した。IPTG(0.01mM)でのLY180(pTrc99a−pntA)の誘導は、5−HMFの不在下では有害であった。しかし、非誘導LY180(pTrc099a pntAB)は、5−HMF(0.9g/l及び1.8g/l)の存在下でベクタ対照よりも速やかに増殖した(図16B及び16C)。pntABの同様の効果がフルフラールに関して以前に認められている(23)。従って両方のフランによる増殖の阻害はフランの還元から生じると思われ、生合成のために必要なNADPHのプールを枯渇させる。加えて、pntABの過剰発現は、フルフラールの不在下でさえも、72時間後に全体的な増殖の増大を導き、生合成がこれらの条件下でNADPHによって制限され得ることを指示した。
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本明細書で特定された、全ての出版物、特許出願及び特許は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている。
当業者は、通常の実験を実施するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識又は確認することができる。そのような均等物は、本明細書に包含されることが意図されている。
Claims (32)
- 参照細菌と比較して少なくとも1つのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大している、単離又は組換えエタノール生産性細菌。
- トランスヒドロゲナーゼ遺伝子がpntA及びpntBである、請求項1に記載の細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較してpntA及びpntB遺伝子の増大した発現を有する、単離又は組換え細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール耐性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 参照細菌が野生型細菌である、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌がエタノール生産性である、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が参照細菌と比較してエタノール生産性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール又は5−HMFの存在下で増大したエタノール生産性を示す、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が参照細菌と比較して増殖性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール又は5−HMFの存在下に増殖性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、約0.025%フルフラール〜約0.15%フルフラールの濃度で5−HMFの存在下に増殖性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、約0.025%フルフラール〜約0.15%フルフラールの濃度でフルフラールの存在下に増殖性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較して増殖性及びエタノール生産性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較して加水分解物の存在下で増殖性が増大している、請求項3に記載の細菌。
- 加水分解物が、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス又はセルロースバイオマスを含む生成物に由来する、請求項14に記載の細菌。
- 当該発現が、pntA及びpntB遺伝子の発現を調節するプロモータ又は調節タンパク質を修飾する又は付加することによって増大する、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、嫌気又は微好気条件下で主発酵生成物としてエタノールを生産することができる、請求項3に記載の細菌。
- 当該細菌が、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌から成る群より選択される、請求項3に記載の細菌。
- グラム陰性細菌が、エシェリキア属(Escherichia)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、ザイモモナス属(Zymomonas)、グルコノバクター属(Gluconobacter)、ジオバクター属(Geobacter)、シュワネラ属(Shewanella)、サルモネラ属(Salmonella)、エンテロバクター属(Enterobacter)及びクレブシエラ属(Klebsiella)から成る群より選択される、請求項18に記載の細菌。
- グラム陽性細菌が、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、オエノコッカス属(Oenococcus)、連鎖球菌属(Streptococcus)及びユーバクテリウム属(Eubacterium)から成る群より選択される、請求項18に記載の細菌。
- 細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項3に記載の細菌。
- 細菌がクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)である、請求項3に記載の細菌。
- 参照細菌と比較してPntA及びPntBタンパク質の活性が増大している、単離又は組換え細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール耐性を増大している、請求項23に記載の細菌。
- 当該細菌が、参照細菌と比較して5−HMF耐性を増大している、請求項23に記載の細菌。
- 参照細菌と比較してpntA及びpntB遺伝子の発現が増大しており、且つ細菌が参照細菌と比較してフルフラール耐性を増大している、単離又は組換え細菌。
- 参照細菌と比較してpntA及びpntB遺伝子の発現又はPntA及びPntBポリペプチドの活性が増大しており、参照細菌と比較してフルフラール又は5−HMFの耐性が増大しており、当該細菌がエタノールを生産することができ、並びに当該細菌が:
(a)細菌の候補株をフルフラール又は5−HMFの存在下で増殖させること;及び
(b)フルフラール又は5−HMFの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含む工程によって調製される、単離又は組換え細菌。 - バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖を、請求項1〜26のいずれか一項に記載の単離又は組換え細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
- バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖を、請求項1〜26のいずれか一項に記載の単離された又は組換え細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、フルフラールの存在下でバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
- 請求項28に記載の方法によって生産されるエタノール。
- 請求項29に記載の方法によって生産されるエタノール。
- 請求項1〜27のいずれか一項に記載の単離又は組換え細菌を含むキット。
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