KR101591843B1

KR101591843B1 - 푸르푸랄 내성 유전자 및 이를 포함하는 푸르푸랄 내성 균주

Info

Publication number: KR101591843B1
Application number: KR1020140036970A
Authority: KR
Inventors: 우한민; 박홍실; 공경택; 엄영순; 김연제; 서동진
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2016-02-12
Also published as: KR20150113435A; US20150275187A1

Abstract

본 발명에 의한 푸르푸랄 내성 유전자를 포함하는 푸르푸랄 내성 균주는 푸르푸랄이 포함되어 있는 배지에서 효과적인 생장이 가능하다. 따라서 비식용 바이오매스인 목질계 바이오매스로부터 유래한 당화액 등에 푸르푸랄과 같은 독성 부산물이 포함되어 미생물의 발효가 어려웠던 문제를 해결할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 균주의 제조방법에 의하면 비교적 적은 수의 타겟유전자들을 가지고 내성유전자를 선별할 수 있어서 내성균주 개발을 위한 시간과 비용 등을 절약할 수 있다. 또한 이러한 유전자발굴 방법은 상기 푸르푸랄 내성 유전자 외에 알려져 있지 않은 다른 여러 가지 기능성 유전자를 찾아내는 방법에 널리 적용될 수 있다.

Description

푸르푸랄 내성 유전자 및 이를 포함하는 푸르푸랄 내성 균주{Furfural-resistant gene and furfural-resistant strains comprising the same}

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 유래된 당화액의 부산물인 푸르푸랄(furfural)에 저항성을 가진 유전자 및 이를 포함하는 균주에 관한 것이다.

지구온난화와 석유자원 고갈에 대한 우려가 높아지면서, 세계 바이오 연구계가 대체 에너지원 개발과 더불어 석유화학 대체물질 개발에 큰 관심을 갖고 있다. 이를 위해 목질계 바이오매스(woody biomass)로부터 미생물 균주의 발효를 통한 바이오연료 및 플랫폼 화학물질의 생산 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 상기 목질계 바이오매스는 주로 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌(lignin) 등으로 구성되며, 미생물의 발효과정을 통해 재생 가능한 연료, 플라스틱, 그 외 여러 가지 화학물질로 전환될 수 있다.

미생물 발효에 목질계 바이오매스를 사용하기 위해서는 셀룰로오스를 당으로 분해시키는 전처리 과정이 필요한데, 높은 온도와 압력에서 산을 이용하게 되는 전처리 당화과정을 거쳐 만들어진 당화액에는 미생물이 이용할 수 있는 포도당(glucose), 목당(xylose) 등의 당 종류뿐만 아니라 전처리 과정 중에 만들어진 여러 가지 부산물들도 함께 존재하게 된다. 전처리 당화과정 중 만들어지는 부산물에는 푸르푸랄(furfural), 히드록시메틸푸르푸랄(hydroxymethylfurfural, HMF), 아세트산(acetic acid) 등이 있다. 이들은 미생물에 독성을 갖고 있어 당화액을 이용한 발효과정에서 생산성을 떨어뜨리게 된다는 문제가 있어, 당화액 내 독성물질에 내성을 갖는 균주의 개발이 반드시 필요하다.

상기 당화액에 존재하는 부산물 중 목당(xylose)으로부터 만들어지는 푸르푸랄(furfural)은 당화액에 있는 중요한 미생물 발효 저해물질 중 하나로, 당화액의 독성은 푸르푸랄(furfural)의 농도와 상당한 관련성을 갖는다. 푸르푸랄은 세포 내에서 상대적으로 푸르푸랄보다 독성이 덜한 퓨퓨릴 알코올(furfuryl alcohol)로 전환되는데, 이 과정에서 NADH 또는 NADPH를 사용하게 되어 세포내 NAD(P)H 양의 불균형이 일어나 세포생장 및 발효를 저해하게 된다. 이 외에도 유전자 변이를 일으키거나 세포막을 약하게 만들고, 당화액 내의 히드록시메틸푸르푸랄, 아세트산 등과 같은 다른 물질들과 상호작용해 독성이 더 심해진다고 알려져 있다.

국제공개특허공보 WO2012-135420A2 (2012. 10. 4) 대한민국공개특허공보 10-2003-0040605 (2003. 5. 23)

Wang, X., E. Miller, et al., 2011,, "Increased furfural tolerance due to overexpression of NADH-dependent oxidoreductase FucO in Escherichia coli strains engineered for the production of ethanol and lactate." Applied and environmental microbiology 77(15): 5132-5140 Sasano, Y., D. Watanabe, et al., 2012, "Overexpression of the yeast transcription activator Msn2 confers furfural resistance and increases the initial fermentation rate in ethanol production." Journal of bioscience and bioengineering 113(4): 451-455

본 발명은 목질계 바이오매스 유래 당화액 내에 포함된 독성을 갖는 부산물인 푸르푸랄에 내성을 갖는 유전자 및 이를 포함하는 균주를 제공하고자 한다.

본 발명의 구현예들에서는 cg1661(서열번호 1) 및 cg1310(서열번호 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 서열을 포함하는 푸르푸랄(Furfural) 내성 유전자, 및 이를 포함하는 푸르푸랄 내성 균주를 제공한다.

본 발명의 구현예들에서는 푸르푸랄 내성 유전자를 스크리닝하는 방법으로, 푸르푸랄 내성 유전자를 발굴하기 위한 타겟 유전자를 선정하는 단계, 및 상기 타겟 유전자를 모균주에 삽입하고 과발현시킨 결과 푸르푸랄 내성을 나타내는 경우 푸르푸랄 내성 유전자로 선정하는 단계를 포함하는 푸르푸랄 내성 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 푸르푸랄 내성 유전자를 포함하는 푸르푸랄 내성 균주는 푸르푸랄이 포함되어 있는 배지에서 모균주(야생균주)에 비해 더 빠른 생장속도를 보이므로, 모균주가 생산하는 물질의 생산률을 증가시킬 수 있다. 따라서 비식용 바이오매스인 목질계 바이오매스로부터 유래한 당화액 등에 푸르푸랄과 같은 독성 부산물이 포함되어 미생물의 발효가 어려웠던 문제를 해결할 수 있다. 이로써 기존의 전분계 바이오매스 뿐만 아니라 비식용 바이오 매스로부터도 당화액 내의 독성물질에 의한 생장저해 및 생산률의 감소 없이 아미노산과 같은 식품 첨가물, 사료첨가물 등을 효과적으로 생산할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 균주의 제조방법에 의하면, 비교적 적은 수의 타겟유전자들을 가지고 내성유전자를 선별할 수 있어서 내성균주 개발을 위한 시간과 비용 등을 절약할 수 있다. 또한 이러한 유전자발굴 방법은 독성물질에 대한 내성유전자뿐만 아니라, 알려져 있지 않은 다른 여러 가지 기능성 유전자를 찾아내는 방법에 널리 적용될 수 있다.

도 1은 다양한 농도의 푸르푸랄(0, 6.5, 13 및 20 mM)이 첨가된 배지에서의 코리네박테리움 글루타미쿰 야생균주(wild type)의 생장곡선을 나타낸 도이다.
도 2는 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장에 따른 배양액 내 푸르푸랄(fufural) 및 퓨퓨릴 알코올(furfuryl alcohol)의 농도를 분석한 결과로서, A는 배지에 푸르푸랄이 6.5mM 첨가된 경우, B는 배지에 푸르푸랄이 13mM 첨가된 경우, C는 배지에 푸르푸랄이 20mM 첨가된 경우이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 FucO의 상동순서검색(homology search)과정을 대략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 푸르푸랄이 6.5mM 첨가된 배지에서, 타겟 유전자가 형질전환된 균주(pAN6-cg0310, pAN6-cg1310, pAN6-cg1661, pAN6-cg3374)와 양성대조군(pAN6-b2799), 음성대조군(pAN6)의 생장농도를 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서의 음성대조군(pAN6)의 생장농도와 각각 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 푸르푸랄이 13mM 첨가된 배지에서, 타겟 유전자가 형질전환된 균주(pAN6-cg0310, pAN6-cg1310, pAN6-cg1661, pAN6-cg3374)와 양성대조군(pAN6-b2799), 음성대조군(pAN6)의 생장농도를 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서의 음성대조군(pAN6)의 생장농도와 각각 비교한 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 구현예들은 cg1661(서열번호 1) 및 cg1310(서열번호 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 서열을 포함하는 푸르푸랄(Furfural) 내성 유전자를 제공한다.

상기 푸르푸랄(furfural)은 다양한 바이오매스의 당화과정 중 부산물로 만들어지는 유기 화합물로서, 화학식은 OC₄H₃CHO이며, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다. 푸르푸랄은 독성을 가지고 있어, 바이오매스의 당화액에서 미생물을 발효시킬 때 미생물의 생산속도와 발효생산물의 생산율을 저하시킨다.

이에 본 발명의 구현예들은 푸르푸랄이 포함된 환경에서도 우수한 생장능력을 갖는 균주로서, 상기 푸르푸랄 내성 유전자를 포함하는 푸르푸랄 내성 균주를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 구현예들에 따른 푸르푸랄 내성 균주는 상기 모균주에 푸르푸랄 내성 유전자인 cg1661(서열번호 1) 및 cg1310(서열번호 2)를 포함하는 푸르푸랄 내성 유전자가 삽입된 것이다. 일 구현예로서 상기 모균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(ACCESSION NC_006958, VERSION NC_006958.1 GI:62388892)이다. 상기 유전자의 삽입은 상기 푸르푸랄 내성 유전자를 벡터를 이용하여 모균주의 세포 내로 삽입한 다음 과발현시키는 것이며, 상기 벡터는 pAN6과 같은 플라스미드를 예로 들 수 있다. 일 구현예로서 상기 푸르푸랄 내성 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032/pAN6-cg1661(KCTC 12565BP)이다.

본 발명의 구현예들에 따른 상기 푸르푸랄 내성 균주는 푸르푸랄이 포함된 배지에서 생장할 수 있다. 또한, 일 구현예에 따른 상기 푸르푸랄 내성 균주는 상기 모균주에 대하여 푸르푸랄이 포함된 배지에서의 생장률이 약 1.4배 이상, 보다 구체적으로 약 1.8배 이상 증가한 것이다. 모균주가 코리네박테리움 글루타미쿰인 경우, 푸르푸랄 내성균주를 포함하지 않는 코리네박테리움 글루타미쿰(야생 균주; wild type)의 경우 목질계 바이오매스로부터 유래된 당화액에서 배양시 당화액 내에 포함된 푸르푸랄의 독성에 의해 생장하기 어렵다. 그러나, 본 발명의 구현예들에 따른 푸르푸랄 내성 균주는 상기와 같은 본 발명의 푸르푸랄 내성 유전자를 포함하여 푸르푸랄 내성을 가짐으로 인해, 목질계 바이오매스로부터 유래된 당화액에서 효과적으로 생장할 수 있다. 이로써, 모균주보다 증가된 아미노산 생산성을 가질 수 있다.

이에, 본 발명의 구현예들은 상기 푸르푸랄 내성 균주를 목질계 바이오매스로부터 유래된 당화액에 접종하는 것을 포함하는 아미노산 생산방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구현예들은 상기와 같은 푸르푸랄 내성 유전자를 스크리닝하는 방법으로, 푸르푸랄 내성 유전자를 발굴하기 위한 타겟 유전자를 선정하는 단계, 및 상기 타겟 유전자를 모균주에 삽입하고 과발현시킨 결과 푸르푸랄 내성을 나타내는 경우 푸르푸랄 내성 유전자로 선정하는 단계를 포함하는 푸르푸랄 내성 유전자의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 구현예들은 상기와 같은 푸르푸랄 내성 유전자를 발굴하기 위한 타겟 유전자를 선정하기 위하여, 문헌조사를 통해 푸르푸랄 내성을 가질 것으로 예상되는 유전자 조사하고, 모균주의 유전자 중 상기 문헌을 통해 조사한 유전자와 유사한 유전자를 타겟유전자로 선정하는 단계, 및 마이크로어레이(microarray)를 이용해 푸르푸랄 스트레스(Furfural stress)에 따른 유전자발현 패턴을 분석하여 유전자 발현률이 높게 나타나는 유전자를 타겟유전자로 선정하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.

일 구현예로서 상기 문헌조사를 통해 타겟유전자를 선정하는 단계는, 문헌상에 알려진 푸르푸랄 내성유전자를 찾고 상동순서검색(homology search)을 통해 모균주에서 유사성이 높게 나오는 유전자들을 타겟유전자로 선정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, Wang, X., E. Miller, et al., 2011, "Increased furfural tolerance due to overexpression of NADH-dependent oxidoreductase FucO in Escherichia coli strains engineered for the production of ethanol and lactate." Applied and environmental microbiology 77(15): 5132-5140로부터 NADH-의존성 산화환원효소(NADH-dependent oxidoreductases, fucO)가 푸르푸랄을 퓨퓨릴 알코올(furfuryl alcohol)로 전환시킨다는 것을 찾아낼 수 있다(하기 화학식 2 참조). 그 다음, 모균주에 존재하는 상기 조사한 FucO와 유사한 유전자를 타겟유전자로 선정할 수 있다. 이때 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.

일 구현예로서 모균주가 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자 중 상기 문헌을 통해 조사한 유전자와 유사한 유전자인 cg1310 (rolM, maleylacetate reductase, 서열번호 2)을 타겟유전자로 선정할 수 있다.

다른 일 구현예로서 상기 마이크로어레이(microarray)를 이용해 타겟 유전자를 선정하는 단계는, 구체적으로 모균주에 푸르푸랄을 농도별로 처리한 다음, 모균주의 mRNA를 마이크로어레이를 수행하여 푸르푸랄 스트레스(Furfural stress)에 따른 유전자발현 변화, 즉 푸르푸랄에 의해 발현이 높아지는 유전자들 중 발현양상이 푸르푸랄 내성과 관련성이 있다고 판단되는 유전자들을 타겟유전자로 선정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 모균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용하는 경우, cg0310(서열번호 3), cg3374(서열번호 4), cg1661(서열번호 1) 및 cg3399(서열번호 5)를 타겟 유전자로 선정할 수 있다.

본 발명의 구현예들은 상기와 같이 선정된 타겟 유전자를 모균주에 삽입하고 과발현시켜 푸르푸랄에 대한 내성이 높은 유전자를 푸르푸랄 내성 유전자로 최종 선정할 수 있다. 구체적으로, 선정된 타겟 유전자들을 클로닝하여 모균주에 삽입하여 타겟 유전자 과발현 균주를 만든 다음, 이 균주들을 푸르푸랄이 포함된 배지에서 배양해 상기 타겟유전자를 삽입하지 않은 발현벡터(예: pAN6)만을 삽입한 균주의 생장속도와 비교하여, 생장속도가 증가한 균주에 삽입된 타겟 유전자를 푸르푸랄 내성유전자로 선별할 수 있다. 예를 들면, 모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용하는 경우. 상기 타겟 유전자 cg1310, cg0310, cg3374, cg1661 및 cg3399를 각각 유전자 재조합하여 모균주에 삽입하고 과발현시킨 다음, 실질적으로 모균주에 비하여 높은 세포성장율을 보이는 재조합 균주를 선별하고, 이 재조합 균주에 삽입되었던 타겟유전자를 최종 푸르푸랄 내성 유전자로 선정할 수 있다. 일 구현예로서 상기 단계에 의해 선정된 최종 푸르푸랄 내성 유전자는 막 단백질(efflux permease)류의 cg1661 및 환원효소(reductase)류인 cg1310 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 모균주에서 푸르푸랄의 생장저해정도의 확인

푸르푸랄 내성 균주를 개발하기 위하여, 먼저 모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰을 선정하고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생 균주(wild type)로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서의 푸르푸랄 농도에 따른 생장저해 정도와 세포생장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄과 퓨르푸릴 알코올의 농도를 확인하였다.

구체적으로, 배양액은 최소배지인 CGXII 배지에 탄소원으로 2% 포도당(glucose)을 첨가하였고 푸르푸랄을 각각 6.5mM, 13mM, 20mM 첨가하여 푸르푸랄이 없을 때의 생장속도와 비교하였다. 이때 상기 CGXII 배지의 조성은 20 g/l (NH₄)₂SO₄, 5 g/l 우레아(Urea), 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l K₂HPO₄, 0.25 g/l MgSO₄·7H₂O, 42 g/l MOPS, 10 mg/l CaCl₂, 0.2 mg/l 비오틴(Biotin), 0.03g/l 프로테카테츄익 애씨드(Protecatechuic acid), 트레이스 금속(Trace metal; 10 mg/l FeSO₄·7H₂O, 10 mg/l MnSO₄·H₂O, 1 mg/l ZnSO₄·7H₂O, 0.2 mg/l CuSO₄·7H₂O, 0.02 mg/l NiCl₂·6H₂O)이다. 배양은 250mL 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 배양액 50mL에 초기 OD₆₀₀를 1로 접종 후 30℃에서 배양하였다. 배양 결과, 도 1에서와 같이 배지의 푸르푸랄의 농도가 증가할수록 균주의 생장속도가 느려졌으며 가장 낮은 농도인 6.5 mM에서도 푸르푸랄이 없는 배지에 비해 50%이상 생장이 감소하는 것을 확인하였다.

또한 상기 6.5mM, 13mM, 20mM의 푸르푸랄이 첨가된 각각의 배지에서 배양시간별로 배양액 내의 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장에 따른 배양액 내 푸르푸랄(fufural) 및 퓨퓨릴 알코올(furfuryl alcohol)의 농도 변화를 알아보기 위하여 가스크로마토그래피(GC)를 이용하여 배양액을 분석하였다. 이때 각 채취시간마다 얻은 배양액은 12000rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액만을 필터를 이용해 얻어 분석에 사용하였다. 배양액 분석 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 A, B 및 C에서 확인할 수 있는 바와 같이, 배지에 첨가된 푸르푸랄은 농도에 상관없이 모두 세포 내로 들어가 퓨퓨릴 알코올로 전환되는 것을 확인할 수 있다.

[실시예 2] 푸르푸랄 내성유전자 발굴을 위한 타겟유전자의 선정

푸르푸랄 내성유전자 발굴을 위한 타겟유전자의 선정에는 문헌조사를 통한 방법과 마이크로어레이를 이용하는 방법의 두 가지 방법을 이용하였다.

문헌 조사를 통한 방법

상기 실시예 1에서 배지에 첨가된 푸르푸랄이 세포 내에서 퓨퓨릴 알코올로 전환되는 것을 확인하였으므로 푸르푸랄 환원효소(Furfural reductase)를 찾기 위해 문헌조사를 실시하였다. 그 결과, Wang, X., E. Miller, et al., 2011, "Increased furfural tolerance due to overexpression of NADH-dependent oxidoreductase FucO in Escherichia coli strains engineered for the production of ethanol and lactate." Applied and environmental microbiology 77(15): 5132-5140에서 대장균(E. coli)에서 NADH를 이용한 푸르푸랄 환원효소인 FucO 유전자를 찾았다. 그리고 이와 유사한 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰에서 찾기 위해 Blast X(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용한 상동순서검색(homology search)를 하였다. 상기 검색과정을 도 3에 대략적으로 나타내었다.

그 결과 유사성이 있다고 보여지는 유전자들 중 마이크로어레이 결과 발현이 증가한 cg1310(서열번호 2)을 타겟 유전자로 선정하였다. 그리고, 상기 선정한 타겟 유전자의 정보와 이들의 푸르푸랄 농도에 따른 유전자 발현패턴을 마이크로어레이로 분석하여 얻은 배지내 푸르푸랄 농도에 따른 상기 타겟유전자의 발현량을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.

유전자 번호	유전자 이름	발현 단백질	유전자 발현량
			배지내 푸르푸랄 농도: 6.5mM	배지내 푸르푸랄 농도: 13mM	배지내 푸르푸랄 농도: 20mM
cg1310	rolM	Maleylacetate reductase	1.476	2.872	2.183

상기 표 1의 유전자 발현량은 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서 스트레스를 받지 않고 자란 야생균주(wild type)인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 대한, 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 자란 야생균주의 타겟 유전자 cg1310의 mRNA 발현량의 상대값을 나타난 것이다. 분석결과 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지인 경우보다 배지 내 푸르푸랄이 포함된 경우 상기 타겟 유전자의 mRNA 발현량이 증가하였으며, 푸르푸랄의 농도가 6.5mM에서 13mM로 더 많이 포함된 경우 상기 타겟 유전자의 mRNA 발현량도 더 높게 나타났다.

유전자 발현 분석을 통한 방법

푸르푸랄 스트레스에 따른 유전자발현 분석 방법으로 마이크로어레이(microarray)를 이용하였다.

구체적으로, 전체 유전자 중 http://www.coryneregnet.de/ 에서 분류한 모듈(Module)에 해당하는 유전자와 각각의 유전자에 해당하는 단백질의 이름에 transport, permease 및 pump 중 하나 이상이 들어간 경우를 추가한 유전자들 중에서 모든 푸르푸랄 농도에서 발현량이 증가한 유전자를 선별해낸 다음, 이 중 각각의 농도에서 하나라도 발현량이 10배 이상 증가한 유전자를 선별하였다. 그리고 선별된 유전자들 중 문헌조사를 통해 기존에 스트레스에 반응한다고 알려져 있는 유전자들을 제외하여, cg0310(서열번호 3), cg1661(서열번호 1), cg3374(서열번호 4), cg3399(서열번호 5)를 타겟 유전자로 선정했다. 이들은 각각 카탈라아제(catalase), 세포막에 존재하는 유출펌프(efflux pump), 산화환원효소(oxidoreductases), 투과효소(permease) 종류의 유전자이다. 그 다음, 상기 마이크로어레이를 통해 선정한 타겟 유전자들의 정보 및 유전자 발현패턴을 마이크로어레이로 분석하여 얻은 배지 내 푸르푸랄 농도에 따른 상기 타겟유전자의 발현량을 하기 표 2에 정리하여 나타내었다.

유전자 번호	유전자 이름	발현 단백질	유전자 발현량
유전자 번호	유전자 이름	발현 단백질	배지내 푸르푸랄 농도: 6.5mM	배지내 푸르푸랄 농도: 13mM	배지내 푸르푸랄 농도: 20mM
cg0310	katA	catalase	3.219	3.443	10.956
cg1661	-	Arsenite efflux pump ACR3 or related permease	7.240	3.071	13.186
cg3374	cye1	Putative NADH-dependent flavin oxidoreductase	1.461	3.219	29.016
cg3399	-	Permease of the major facilitator superfamily	4.485	6.529	15.694

상기 표 2의 유전자 발현량은 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서 스트레스를 받지 않고 자란 야생균주(wild type)에 대한, 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 자란 야생균주의 타겟 유전자들의 mRNA 발현량의 상대값을 나타난 것이다. 분석결과 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지인 경우보다 배지 내 푸르푸랄이 포함된 경우 상기 각 타겟 유전자의 mRNA 발현량이 증가하였으며, 푸르푸랄의 농도가 높을수록 상기 타겟 유전자들의 mRNA 발현량도 더 높게 나타났다.

[실시예 3]푸르푸랄이 첨가된 배지에서 타겟유전자들의 내성 효과 확인

상기 실시예 2에서 선정된 타겟 유전자들의 내성효과를 확인하는 실험을 실시하였다. 이때 상기 실시에 2의 타겟 유전자 중 cg3399는 20mM의 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 배양한 결과 생장하지 못하였으므로 본 실험에서 제외하였다.

구체적으로, 본 발명의 타겟 유전자로서 cg0310, cg1310, cg1661 및 cg3374, 그리고 양성 대조군으로서 E. coli K-12 MG1655의 FucO 유전자(L-1,2-propanediol oxidoreductase)인 b2799(ACCESSION NP_417279, VERSION NP_417279.2 GI:345452723)를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 발현벡터인 pAN6를 이용하여 야생균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 25μF, 200Ω, 2,500 V의 조건 하에 전기천공(electroporation)법으로 형질전환(transformation)하였다. 음성 대조군으로서 다른 유전자를 삽입하지 않은 pAN6도 야생균주에 동일한 방법으로 형질전환하였다. 상기 pAN6(Kan^r)는 고 복제 플라스미드(high copy plasmid)로서 pEKEx2에서 유래된 코리네 박테리움/대장균의 유전자 발현 규정을 위한 셔틀 벡터(P_tac, lacI ^q, pBL1 oriV_C.glutamicum , pUC18 oriV_E.coli )이다. 이는 Frunzke, J., Engels, V., Hasenbein, S., Gatgens, C., Bott, M., 2008. Co-ordinated regulation of gluconate catabolism and glucose uptake in Corynebacterium glutamicum by two functionally equivalent transcriptional regulators, GntR1 and GntR2. Molecular microbiology. 67, 305-322에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다. 상기 형질전환 후, 25μg/ml 카나마이신(Kanamycin)이 포함 된 BHIS(37g/l brain heart infusion (Difco), 91g/l sorbitol) 아가 플레이트(agar plate)에서 셀렉션(selection)하였다. 그 결과 재조합 균주 pAN6-cg0310, pAN6-cg1310, pAN6-cg1661, pAN6-cg3374, pAN6-b2799가 각각 제조되었다.

상기 pAN6는 lacI 유전자를 갖고 있기 때문에 IPTG 인덕션(induction)을 통해 유전자 발현을 조절할 수 있다. 이에, 상기 재조합 균주의 푸르푸랄 내성을 확인하기 위하여 IPTG를 균주의 접종과 동시에 0.5 mM로 넣어주어 인덕션하여 유전자를 과발현시켰다. 그 다음, 상기 재조합 균주들을 각각 푸르푸랄이 6.5 mM, 13 mM로 첨가된 CGXII 배지에서 배양하였다. 그리고 시간에 따른 OD₆₀₀ 값을 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서의 음성 대조군의 시간에 따른 OD₆₀₀ 값과 비교하여, 도 4 및 도 5에 나타내었다.

그 결과, pAN6-cg1310이 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서의 음성대조군(pAN6)의 세포성장 대비 약 1.5배, pAN6-cg1661이 약 1.8배 증가하여, 푸르푸랄 내성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 따라서 이를 최종 푸르푸랄 내성 유전자로 결정하였다.

한국미생물자원센터(국내)

KCTC12565BP

20140305

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Furfural-resistant gene and furfural-resistant strains comprising the same <130> 14P067/IND <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cg1661 <400> 1 ttgaaacggg tcgttgaagc gtgggataga tttcaaatcc cactgtatat cacggctctt 60 atcgccggag cactggtggg tttgcagtgg ccaggctcta cagggggttt cgaaagcgcc 120 attaacccag cgttaatggc gctgctttat gccacttttc tcggtattcc gatcactcgg 180 attggtgcag cgctgaaaga tctgagattt ctcatagtgc tcatgtccgt caattttgtt 240 gcagtgcctc tggtggcttt tgcgttgagc agattcattg cgggtgatga ggcgcttcta 300 atcggatttt tactggtgat tctcgcgccg tgcattgatt acgtcattgt ctttgctggt 360 ttggccaggg ccgcccaaga caagctcctt gccgccacgc caatattaat gcttgtccaa 420 atcctgctga tccccgtctt cctggctgtt tttgtgggtt cagatgccct tggctcaatc 480 tctttcggcc catttgtaga agcatttttc ctcctgattc tcattccact tgttgctgct 540 gcgggaactc agcaagtggc aagaaagtgg caggtaggac gtacaattat ggctgctgca 600 gaagcaatca tggtgccttt aatgatgctg acgttgttcg 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Claims

cg1661(서열번호 1) 및 cg1310(서열번호 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 서열로 표시되는 푸르푸랄(Furfural) 내성 유전자.
제 1 항의 유전자를 포함하고,
모균주가 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 푸르푸랄 내성 균주.
제 2 항에 있어서, 상기 푸르푸랄 내성 균주는 푸르푸랄이 포함된 배지에서 생장할 수 있는 것을 특징으로 하는 푸르푸랄 내성균주.
제 2 항에 있어서, 상기 푸르푸랄 내성 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 야생균주(wild type)인 모균주에 대하여 푸르푸랄이 포함된 배지에서의 생장률이 1.4배 이상 증가한 것을 특징으로 하는 푸르푸랄 내성균주.
제 4 항에 있어서, 상기 모균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)인 푸르푸랄 내성 균주.
제 5 항에 있어서, 상기 푸르푸랄 내성 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032/pAN6-cg1661(KCTC 12565BP)인 푸르푸랄 내성 균주.
제 2 항의 푸르푸랄 내성 균주를 목질계 바이오매스로부터 유래된 당화액에 접종하는 것을 포함하는 아미노산 생산방법.
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