KR101886186B1

KR101886186B1 - 퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주 및 이를 이용한 이소부탄올의 생산 방법

Info

Publication number: KR101886186B1
Application number: KR1020160135131A
Authority: KR
Inventors: 양영헌; 서형민; 송헌석; 전종민; 송영하; 유영선
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; (주)에이피테크놀로지
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2018-08-07
Also published as: KR20180042660A

Abstract

본 발명은 두 개의 알데하이드 옥시도리덕테이즈(aldehyde oxidoreductase)를 발현하는 것을 통해 퍼퓨랄(furfural)에 대한 내성이 향상된 재조합 균주 및 상기 균주를 이용하여 바이오매스로부터 이소부탄올을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 퍼퓨랄 내성을 가지는 재조합 대장균은 목질계 바이오매스를 분해하여 리그노셀룰로스를 얻기 위한 전처리 과정에서 생기는 독성물질인 퍼퓨랄 등을 포함하는 배지에서도 효과적으로 생장할 수 있으며, 이를 통해 배지 내 탄소원을 이소부탄올과 같은 유용 물질을 생산할 수 있으므로, 경제적이고 친환경적인 이소부탄올 생산이 가능하다.

Description

퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주 및 이를 이용한 이소부탄올의 생산 방법{A recombinat organism enhanced furfural tolerance and method for production of isobutanol using the same}

본 발명은 두 개의 알데하이드 옥시도리덕테이즈(aldehyde oxidoreductase)를 발현하는 것을 통해 퍼퓨랄(furfural)에 대한 내성이 향상된 재조합 균주 및 상기 균주를 이용하여 바이오매스로부터 이소부탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

지구온난화로 인한 환경위기가 찾아오고 있으며 고유가로 인한 에너지 위기에 직면하고 있는 것이 현재 상황이다. 이러한 상황에서 바이오매스는 사회 전반에 필요한 에너지 및 소재를 모두 안정적으로 공급할 수 있다는 점에서 지속 가능한 저탄소 녹색사회 구현을 위한 독보적인 대안으로 제시되고 있다. 특히, 식물 유래의 목질계 바이오매스는 광합성을 통하여 생합성되는 식물류와 폐목재류, 및 볏짚류 등을 포함하는 개념이다. 목질계 바이오매스는 재생 가능하고 풍부한 양의 탄소원으로 포함하면서 지구 상에 막대한 양으로 존재한다는 장점을 가지며, 해부학적 구성상 셀룰로스 40~60%, 헤미셀룰로스 20~40%, 리그닌(lignin) 10~25%로 이루어진 복합고분자인 리그노셀룰로오즈가 대표적인 예라고 할 수 있다.

즉, 리그노셀룰로오즈는 지구상에서 가장 풍부한 탄소자원이 될 수 있으며, 50% 이상의 탄수화물 조성물을 포함하여, 탄소원을 대체할 수 있는 자원으로 부각되고 있다. 뿐만 아니라, 미생물 발효에 사용되는 단당류인 포도당으로 가수분해될 수 있는 기질인 셀룰로오즈를 주로 포함하고 있기 때문에 다양한 산업 분야에 걸쳐 대체에너지원으로서 사용될 수 있다.

리그노셀룰로오즈 바이오매스로부터 탄수화물을 추출하기 위해서, 바이오매스의 구조를 풀어 사용할 수 있도록 전처리하는 과정을 필수적으로 수반한다. 이를 위한 전처리 과정으로서, 산 가수분해, 암모니아 가수분해 및 열수 가수분해 등의 다양한 전처리 과정이 사용될 수 있다. 이러한 전처리 과정을 통해, 리그노셀룰로즈 바이오매스로부터 셀룰로스, 헤미셀룰로스 또는 이들의 단위 다당체까지의 단계로 분해하여 탄소원으로서 사용할 수 있다.

그러나, 현재 사용되고 있는 화학적 방법을 전처리를 통해 분해된 바이오매스원에는 퍼퓨랄(furfural), 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethylfurfural, HMF), 아세테이트 및 방향족 중합체와 같은 독성 화합물이 부산물로 생성되어 배지 내에 존재할 수 있기 때문에, 이후 생물학적인 발효 공정에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서, 리그노셀룰로오스를 바이오매스로서 생물학적 공정의 탄소원으로 사용하기 위해, 이러한 화학적 가수분해 전처리 방법을 효율적으로 사용하기 위한 탈독(detoxification)하는 방법의 개발이 요구되고 있다.

리그놀셀룰로스의 전처리 과정에서 생성되는 부산물 중에서, 퍼퓨랄은 산 가수분해와 같은 극렬한 전처리 과정에서 생산되는 부산물이다. 바이오매스의 특징에 따라 약간의 차이는 있으나, 산 가수분해 전처리 과정에서 약 10 mM의 퍼퓨랄이 생성된다. 퍼퓨랄은 독성을 나타내어 DNA를 파괴하고 해당과정을 억제하여, 미생물의 당 대사작용에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다. 퍼퓨랄은 알데하이드 옥시도리덕테이즈(aldehyde oxidoreductase, AOR)에 의해 환원되어, 독성이 더 적은 화합물인 퓨퍼릴 알콜(furfuryl alcohol)로 전환될 수 있다. 그러나 AOR은 대부분이 NADPH를 조효소로서 사용하는 NADPH 의존성 효소이므로, 세포 내의 NADPH 소모량이 증가하여 세포의 생장을 저해한다는 단점이 있다.

따라서, 이에 대한 대응 방법으로서 미국특허 제 2012-008015 호에는 퍼퓨랄에 대한 내성을 증가시키기 위해 YqhD와 같은 NADHP 의존적인 AOR을 제거하면서, 퍼퓨랄에 대하여 활성을 가지는 NADH 의존적인 효소인 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(FucO)를 사용하는 방법을 개시하고 있다. 상기 FucO는 YqhD와 같은 AOR과 같이 퍼퓨랄 환원 활성을 가져, 퍼퓨랄의 독성을 탈독하기 위해 대체 효소로서 사용될 수 있다. 이 외에도, 세포막에 결합된 수소전달효소(Membrane-bound transhydrogenase, PntAB) 또한 NADPH의 사용능을 증가시킴으로서 퍼퓨랄 내성을 증가시킬 수 있는 방법에 사용된 바 있다(Wang, Xuan, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 110.10 (2013): 4021-4026.).

이소부탄올은 발린 생합성 과정 및 Ehrlich 대사반응을 통해 생산된다. 구체적으로, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis spp.)와 같이 α-케토이소발레르산 디카르복실라제(α-ketoisovalerate decarboxylase)를 발현하는 미생물에서 발린 생합성 과정을 통해서 α-케토이소발레르산(α-Ketoisovalerate)이 합성되면, 이는 다시 kivD 유전자에 의해 이소부틸알데하이드로 전환되어, 최종적으로 이소부틸알데하이드는 AOR에 의해 이소부틸 알코올로 환원된다.

이소부틸알데하이드에 대하여 높은 활성을 나타내는 AOR 중 하나로서, NADPH 의존적 효소인 대장균 유래의 YqhD이 많이 사용된다. 따라서, 이소부탄올(2-methylpropan-1-ol) 생산에 있어서 효과적으로 사용될 수 있는 방법은 재조합 대장균 균주를 사용하는 것이다. 대장균 재조합을 통해, 포도당 기반의 합성 배지에서 이소부탄올에 대해 높은 생산성 및 생산 효율을 나타낼 수 있음이 보고된 바 있다(Atsumi, Shota, Taizo Hanai, and James C. Liao. nature 451.7174 (2008): 86-89.).

그러나, 리그노셀룰로스 배지로부터 대장균을 사용하여 이소부탄올을 생산하는 과정에서, 퍼퓨랄과 같은 독성 화합물이 포함되어 대장균의 생장을 저해하므로 발효 효율이 낮다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 이소부틸알데하이드 및 퍼퓨랄에 대하여 넓은 기질 특이성을 가지는 효소인 YqhD와 같은 환원효소의 특징을 사용할 수 있음이 보고된 바 있으며(Miller, Elliot N., et al. Applied and environmental microbiology 75.13 (2009): 4315-4323.), 이 때 대장균의 NADPH 의존적 효소인 YqhD를 대체하기 위해, L. 락티스 유래의 NADH 의존적 효소인 AdhA를 사용할 수 있으며, L. 락티스 유래의 AdhA는 아세트알데하이드와 같은 다른 기질 중에서 이소부틸알데하이드에 의해 효소 특이성을 증가시킬 수 있음이 보고되기도 했다(Liu, Xiang, et al. Journal of biotechnology 164.2 (2013): 188-195.)

그럼에도 불구하고, 리그노셀룰로스는 지구상에 막대한 양으로 존재하는 탄소자원이 될 수 있으며, 이를 바이오매스로 사용하여 효율적인 목적 산물의 생산이 가능하기 위해서는, 퍼퓨랄에 대하여 내성을 가지도록 재조합된 미생물의 개발이 계속되고 있으나, 현재 퍼퓨랄에 대한 내성을 증진시키고 목적 유용 산물을 생산하는 방법을 위한 연구들은 바이오에탄올의 생산 방법에 주로 제한되어 있고, 퍼퓨랄 내성 균주를 통하여 이소부탄올을 생산하는 방법에 대하여는 아직까지 활발히 연구되지 않았다.

따라서, 본 발명자들은 목질계 바이오매스인 리그노셀룰로스로부터 이소부탄올을 효과적으로 생산하는 방법에 있어서, 세포의 생장에 영향을 미치는 퍼퓨랄에 대한 내성을 가지는 재조합 균주를 제조하고자 노력한 결과, 알데하이드 옥시도리덕테이즈(AOR)인 대장균 유래의 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, YqhD) 및 대장균 유래의 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase, FucO)을 동시에 발현하는 재조합 대장균을 제조하였으며, 상기 재조합 대장균이 퍼퓨랄을 퓨퍼릴 알코올로 환원함으로써 퍼퓨랄에 대한 내성을 나타낼 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 이소부탄올의 생산량이 효과적으로 증가할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명자들은 알데하이드 옥시도리덕테이즈(AOR)인 대장균 유래의 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, YqhD) 및 대장균 유래의 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase, FucO)을 동시에 발현하는 퍼퓨랄(furfural) 내성 재조합 대장균을 이용하여, 이소부탄올의 대량 생산 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 이소부탄올의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 퍼퓨랄(furfural) 내성이 향상된 재조합 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 바이오매스 유래 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 이소부탄올(isobutanol)의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 알코올 디하이드로게네이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 대장균(E. coli) 유래의 YqhD 일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 FucO 일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 균주는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 세포막 단백질인 수소 전달 효소(membrane-bound transhydrogenase, PntAB)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 추가 형질전환되는 것 일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 균주는 하기 a) 내지 d)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발린 생합성 경로 관여 효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 추가 형질전환되는 것일 수 있다:

a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS);

b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유래의 α-케토이소발레르산 디카르복실라제(α-ketoisovalerate decarboxylase, KivD);

c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라제(Ketol-acid reductoisomerase, ilvC); 및

d) 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 디하이드록시산 탈수소효소(dihydroxyacid dehydratase, ilvD).

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 균주는 0 내지 40 mM의 퍼퓨랄이 포함된 환경에서 생장 가능한 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 바이오매스는 목질계 리그노셀룰로오즈(lignocellulose)인 것 일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배양은 20 내지 40 ℃ 온도에서 수행하는 것 일 수 있다.

따라서, 본 발명은 두 개의 알데하이드 옥시도리덕테이즈를 활용하여 퍼퓨랄 내성을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용하는 이소부탄올 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 제조한 대장균 유래의 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, YqhD) 및 대장균 유래의 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase, FucO)을 동시에 발현하는 재조합 대장균은 퍼퓨랄이 포함된 배지에서, 세포에 독성을 나타내는 퍼퓨랄을 퍼퓨릴 알코올로 환원하여, 퍼퓨랄에 내성이 증가되는 효과를 나타낸다. 또한 상기 재조합 대장균은 퍼퓨랄이 포함된 배지에서 세포 생장이 가능함과 동시에, 탄소원으로부터 이소부탄올을 효과적으로 합성할 수 있으므로, 이소부탄올 생산 방법의 사용 균주로서 효과적이다.

본 발명의 퍼퓨랄 내성을 가지는 재조합 대장균은 목질계 바이오매스를 분해하여 리그노셀룰로스를 얻기 위한 전처리 과정에서 생기는 독성물질인 퍼퓨랄 등을 포함하는 배지에서도 효과적으로 생장할 수 있으며, 이를 통해 배지 내 탄소원을 이소부탄올과 같은 유용 물질을 생산할 수 있으므로, 경제적이고 친환경적인 이소부탄올 생산이 가능하다.

도 1은 배지 내 퍼퓨랄(furfural) 농도에 따른, 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, YqhD) 및 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase, FucO) 발현 대장균의 생장 저해 효과를 나타낸다.
도 2는 배지 내 퍼퓨랄 첨가에 따른 YqhD 및 FucO 발현 대장균의 생장 및 이소부탄올 생산 효과를 확인한 도이다:
도 2a는 15 mM 퍼퓨랄을 포함하는 배지에서 YqhD 및 FucO 발현 대장균의 생장 저해 효과를 나타내며; 및
도 2b는 15 mM 퍼퓨랄을 포함하는 배지에서 YqhD 및 FucO 발현 대장균의 이소부탄올 생산 효과를 나타낸다.
도 3은 YqhD 단독 발현 대장균(HM501)과 YqhD 및 FucO 발현 대장균(HM601)의 이소부탄올 생산 공정을 비교하는 도이다:
도 3a는 HM501 및 HM601 균주의 생장(세포 밀도), 이소부탄올 생산량 및 포도당 소비량을 나타내며; 및
도 3b는 HM501 및 HM601 균주 배양 배지 내 잔존 퍼퓨랄 및 생성된 퍼퓨릴 알코올을 나타낸다.
도 4는 GC 분석을 통한 HM601 균주를 퍼퓨랄 포함 배지에서 배양하면서 감소하는 퍼퓨릴 및 생산되는 퍼퓨릴 알코올을 나타낸다.
도 5는 YqhD 및 FucO 공동 발현 및 PntAB 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 리그노셀룰로스는 지구상에 막대한 양으로 존재하는 탄소자원이 될 수 있으며, 이를 바이오매스로 사용하여 효율적인 목적 산물의 생산이 가능하기 위해서는, 퍼퓨랄에 대하여 내성을 가지도록 재조합된 미생물의 개발이 계속되고 있으나, 현재 퍼퓨랄에 대한 내성을 증진시키고 목적 유용 산물을 생산하는 방법을 위한 연구들은 바이오에탄올의 생산 방법에 주로 제한되어 있고, 퍼퓨랄 내성 균주를 통하여 이소부탄올을 생산하는 방법에 대하여는 아직까지 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명은 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 퓨퍼랄(furfural) 내성이 향상된 재조합 균주를 제공한다.

본 발명의 “알코올 디하이드로게네이즈”는 알코올을 아세토알데하이드(acetoaldehyde)로 전환할 수 있는 효소로서 당업계에 알려진 효소라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다. 구체적으로, 상기 알코올 디하이드로게네이즈는 대장균 유래인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YqhD인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열 또는 이로부터 하나 또는 둘 이상의 유전자가 추가, 결실 또는 치환된 염기서열이 암호화하는 단백질도 사용될 수 있다.

본 발명의 “1,2-프로판디올 옥시도리덕타제”는 1,2-프로판디올과 같은 기질을 산화환원할 수 있는 효소로서 당업계에 알려진 효소라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다. 구체적으로, 상기 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제는 대장균 유래인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 YqhD인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열 또는 이로부터 하나 또는 둘 이상의 유전자가 추가, 결실 또는 치환된 염기서열이 암호화하는 단백질도 사용될 수 있다.

본 발명의 “재조합 균주”는 세포막 단백질인 수소 전달 효소(membrane-bound transhydrogenase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 추가로 형질전환하여 제조할 수 있다. 상기 세포막 단백질인 수소 전달 효소는 세포막에 결합되어 수소이온을 전달하는 효소로서 당업계에 알려진 효소로서, NADP(H) 및 NAD(H) 간의 수소전달반응(transhydrogenation)을 개시하여 산화 환원 보조 인자(redox cofactor)의 균형을 조절함으로써 NADPH 사용능을 증가시킬 수 있는 효소라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다. 구체적으로, 상기 세포막 단백질인 수소 전달 효소는 대장균 유래인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 서열번호 3의 아미노산으로 구성되는 PntAB인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열 또는 이로부터 하나 또는 둘 이상의 유전자가 추가, 결실 또는 치환된 염기서열이 암호화하는 단백질도 사용될 수 있다.

본 발명의 “재조합 균주”는 발린 생합성 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 추가로 형질전환하여 제조할 수 있다. 상기 발린 생합성 경로에 관여하는 효소는, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS), 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유래의 α-케토이소발레르산 디카르복실라제(α-ketoisovalerate decarboxylase, KivD), 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라제(Ketol-acid reductoisomerase, ilvC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 디하이드록시산 탈수소효소(dihydroxyacid dehydratase, ilvD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 상기 아미노산 4 내지 서열번호 7의 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 염기서열 또는 이로부터 하나 또는 둘 이상의 유전자가 추가, 결실 또는 치환된 염기서열이 암호화하는 단백질도 사용될 수 있다.

본 발명의 “재조합 균주”는 0 내지 40 mM의 퍼퓨랄이 포함된 환경에서 생장 가능하며, 구체적으로 10 내지 30 mM의 퍼퓨랄이 포함된 환경에서 생장할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 재조합 균주는 2 개의 알데하이드 옥시도리덕테이즈를 발현하여 배지 내 퍼퓨랄을 퍼퓨릴 알코올로 환원할 수 있다.

구체적으로, 바이오매스를 이용하여 유용물질을 생물 전환하는 이소부탄올의 생산 공정에 있어서, 바이오매스 전처리 과정에서 생성되는 퍼퓨랄 존재 하에서 유용물질 생산 균주를 배양하는 경우, 알코올 디하이드로게네이즈의 광범위한 효소작용으로 퍼퓨릴 알코올이 생성되며, 이 과정에서 NADPH가 소모되고 조력인자(cofactor)의 균형이 무너져 균 생장률이 낮아진다. 그러나, YqhD와 함께 FucO를 발현하는 본 발명의 재조합 균주는 NADH 의존적인 FucO에 의해 퍼퓨랄을 퍼퓨릴 알코올로 전환하는 데 도움을 줄 수 있으며, 이로 인해 배지 내 퍼퓨랄이 빠른 속도로 환원되어 세포가 생장할 수 있도록 한다.(하고, 이에 따라 이소부탄올의 생산 효과 또한 높아질 수 있다.).

본 발명의 재조합 균주를 이용하는 이소부탄올의 대량 생산 방법에 있어서, “바이오매스”는 산 가수분해, 암모니아 가수분해 및 열수 가수분해와 같이 당업계에 바이오매스를 분해하여 탄소원 기질로 사용하기 위해 당업계에서 사용되고 있는 전처리 과정을 통해 분해된 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 바이오매스를 산 가수분해하여 수득한 목질계 리그노셀룰로오즈인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 목질계 리그노셀룰로오즈에는 산 가수분해와 같은 전처리 과정에서 생성된 독성물질을 포함할 수 있으나, 본 발명의 재조합 균주는 세포 생장을 억제하는 퍼퓨랄에 대한 내성을 가지므로, 효과적인 이소부탄올 대량 생산이 가능하다.

본 발명의 “재조합 균주”는 20 내지 40℃에서 배양하는 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 30 내지 40℃에서 배양하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유래의 α-케토이소발레르산 디카르복실라제(α-ketoisovalerate decarboxylase, KivD), 대장균 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라제(Ketol-acid reductoisomerase, ilvC) 및 대장균 유래의 디하이드록시산 탈수소효소(dihydroxyacid dehydratase, ilvD)의 발린 생합성 경로 관련 효소를 발현하는 재조합 대장균에, YqhD 및 FucO 과발현을 위한 재조합 벡터를 형질전환하여 재조합 대장균을 제조하였다(표 1, 표 2).

또한, 본 발명자들은 HM60, HM60::yqhD(HM501), HM60::fucO(HM502) 또는 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주에서 퍼퓨랄 내성 및 이소부탄올 생산 효과를 확인한 결과, HM60::yqhD(HM501) 및 HM60::yqhD::fucO(HM601)가 퍼퓨랄 포함 배지에서도 유의적으로 생장할 수 있고, 이를 통해 유의적인 이소부탄올 생산량을 나타냄을 확인하였다(도 1 및 도 2).

또한, 본 발명자들은 YqhD 및 FucO 공동 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인한 결과, YqhD 만을 발현하는 HM501 균주에 비해 YqhD 및 FucO을 함께 발현하는 HM601 균주의 경우 퍼퓨랄 환원이 효과적으로 나타나 세포의 생장 속도가 증가하였으며, 이소부탄올 생산량 역시 증가하여 약 2 배 높은 수준을 나타내는 것을 확인하였다(표 3, 표 4, 도 3 및 도 4).

아울러, 본 발명자들은 수소이온 전달 반응을 통해 NADPH 사용능을 증가시키는 것으로 알려져 있는 PntAB 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인한 결과, YqhD 만을 발현하는 HM501 균주에서는 PntAB 발현에 따라 이소부탄올 생산량이 증가하였으나, YqhD 및 FucO을 함께 발현하는 HM601 균주에서는 유의적인 차이를 나타내지 않으므로, YqhD 및 FucO을 함께 발현하는 것이 효과적인 이소부탄올 생산 방법임을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제조한 대장균 유래의 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, YqhD) 및 대장균 유래의 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase, FucO)을 동시에 발현하는 재조합 대장균은 퍼퓨랄이 포함된 배지에서, 세포에 독성을 나타내는 퍼퓨랄을 퍼퓨릴 알코올로 환원하여, 퍼퓨랄에 내성이 증가되는 효과를 나타낸다. 또한 상기 재조합 대장균은 퍼퓨랄이 포함된 배지에서 세포 생장이 가능함과 동시에, 탄소원으로부터 이소부탄올을 효과적으로 합성할 수 있으므로, 이소부탄올 생산 방법의 사용 균주로서 효과적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

옥시도리덕테이즈 ( oxidoreductase ) 과발현 재조합 대장균의 제조

<1-1> 균주 배양

본 발명의 실시예를 수행하기 위해 사용한 균주의 종류는 하기 [표 1]과 같으며, 배양 조건은 아래와 같다.

바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 30 ℃에서 호기배양하였다. 대장균 DH5α 및 대장균 DSM01는 각각 유전자 클로닝 균주 및 이소부탄올 생산 균주로서 사용하였고, 배양배지로서 LB 한천 배지 또는 LB 액체배지를 사용하였다. LB 한천 배지는 10 g 트립톤, 5 g 효모 추출물, 10 g NaCl 및 20 g 한천을 1 ℓ 증류수에 용해하여 제조하였다. 재조합 대장균의 배양 시에는 100 ㎍/㎖ 스펙티노마이신(spectinomycin), 100 ㎍/㎖ 앰피실린 또는 25 ㎍/㎖ 크로람페니콜(chloramphenicol) 중 적절한 항생제를 배지에 첨가하여 배양하였다.

본 발명에서 사용한 미생물 균주 및 플라스미드

균주명 /플라스미드 명	관련 정보	출처
미생물 균주
바실러스 섭틸리스 168	야생형	KCTC 구입
락토코커스 락티스 KF147	야생형	KCTC 구입
대장균 균주
DH5α	F.φ80lacZ M15 endArecAhsdR (rk.mk.) supEthigyrArelA Δ(lacZYA-argF)U169
K12 MG1655	F.ompThsdSB (rB.mB.) gal dcm	Novagen 구입
DSM01	K12 MG1655 ΔldhA::FRT, ΔadhE::FRT, ΔfrdA::FRT, Δpta::FRT
HM60	DSM01 harboring pHM46 and pHM51	본 발명
HM60::yqhD (HM501)	DSM01 harboring pHM46 and pHM47	본 발명
HM60::fucO (HM502)	DSM01 harboring pHM51 and pHM52	본 발명
HM60::yqhD::fucO (HM601)	DSM01 harboring pHM47 and pHM52	본 발명
HM501::pntAB	HM501 harboring pHM55	본 발명
HM601::pntAB	HM601 harboring pHM55	본 발명
HM501::pACYC	HM501 harboring pACYCDuet-1	본 발명
HM601::pACYC	HM601 harboring pACYCDuet-1	본 발명
플라스미드
pCDFDuet-1	CDF ori, Spec^R	Novagen 구입
pET23a	pBR322 ori, Amp^R	Novagen 구입
pACYCDuet-1 P15A	P15A ori, Cm^R	Novagen 구입
pHM46	pCDFDuet-1::alsS, kivD	본 발명
pHM51	pET23a::ilvC, ilvD	본 발명
pHM47	pET23a::ilvC, ilvD, yqhD	본 발명
pHM52	pCDFDuet-1::alsS, kivD, fucO	본 발명
pHM55	pACYCDuet-1::pntAB	본 발명

<1-2> 재조합 대장균 제조 및 재조합 효소의 발현

본 발명의 이소부탄올 생산 재조합 균주를 제조하기 위해서, 발린 생합성 과정의 흐름에 따라 관련 효소를 과발현하는 재조합 대장균을 제조하였다. 발린 생합성 과정의 관련 효소로서, 피루베이트에 대한 높은 친화도를 가지는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS), L. 락티스 유래 α-케토이소발레르산 디카르복실라제(α-ketoisovalerate decarboxylase, KivD), 대장균 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라제(Ketol-acid reductoisomerase, ilvC) 및 대장균 유래의 디하이드록시산 탈수소효소(dihydroxyacid dehydratase, ilvD)를 발현하면서, 추가로 본 발명의 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, YqhD), 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(FucO) 또는 이 둘 모두를 발현하는 대장균 형질전환체를 제조하였다(표 1).

구체적으로, 바실러스 섭틸리스, 락토코커스 락티스 또는 대장균을 각각 배양하고 유전체 DNA(genomic DNA)를 수득한 다음, 이로부터 alsS, ilvC, ilvD, kivD, yqhD 또는 FucO의 목적 유전자를 PCR 증폭하였다. PCR 증폭을 위해, 하기 [표 2]에 기재된 서열의 프라이머를 사용하였다. 증폭된 유전자는 각각 2 개의 제한효소로 말단을 절단한 다음 정제하여 벡터 플라스미드에 삽입하고, 유전자 시퀀싱하여 구축된 플라스미드를 확인하였다. 그런 다음, heat-shock 방법으로 대장균 DH5α에 형질전환하였다.

본 발명에서 목적 유전자를 증폭하기 위해 사용한 프라이머의 서열

프라이머 명	방향	서열	서열번호
ilvCF	정방향	CTCT GGATCC AATGGCTAACTACTTCAATACACTGAATC	서열번호 9
ilvCR	역방향	CTCT GAGCTC TTAACCCGCAACAGCAATACGTTTC	서열번호 10
ilvDF	정방향	CTCT GAGCTC AAAATGGGACGGCACGCAC	서열번호 11
ilvDR	역방향	CTCT CTGCAG TTAACCCCCCAGTTTCGATTTATCG	서열번호 12
yqhDF	정방향	AGCT AAGCTT AGGAGATATAATGA ACA ACT TTAATCTGC	서열번호 13
yqhDR	역방향	CTAT TCTAGA TTAGCGGGCGGCTTC	서열번호 14
alsSF	정방향	CTCT GGATCC GTTGACAAAAGCAACAAAAGAA	서열번호 15
alsSR	역방향	CTCT GAGCTC CTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAG	서열번호 16
kivDF	정방향	GATCTAGC CATATG TATACAGTAGGAGATTACCTATTAG	서열번호 17
kivDR	역방향	CTCT CTCGAG TTATGATTTATTTTGTTCAGCA	서열번호 18
pntABF	정방향	CTCT GGATCC AATGCGAATTGGCATACCAAG	서열번호 19
pntABR	역방향	CTCT GAGCTC TTACAGAGCTTTCAGGATTGCA	서열번호 20
fucOF	정방향	CTCT GAGCTC AGGAGATATACC ATGATGGCTAACAGAATGATT	서열번호 21
fucOR	역방향	CTCT GTCGAC TTACCAGGCGGTATGGTAAAGCTC	서열번호 22

형질전환하여 제조한 각각의 재조합 대장균을 LB 한천 배지(plate)에 3분도말하여 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 획득하고, 이를 LB 액체배지(broth) 3 ㎖에 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕배양하여 24 시간 동안 전배양하였다. 그런 다음, 세포를 전배양한 배지 1 ㎖를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하여(초기 OD₆₀₀=0.01), 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하여 본배양하였다. 본배양 개시 3시간 후에는 IPTG를 최종 농도 0.1 mM이 되도록 배지에 첨가하여 각각의 실험군 대장균에 해당하는 단백질의 과발현을 유도하였고, 본배양은 총 24시간 동안 수행하였다.

YqhD 또는 FucO 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인

<2-1> YqhD 및 FucO 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 확인

퍼퓨랄을 포함하는 배지에서 YqhD 및 FucO 발현에 따른 대장균 생장의 억제 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 HM60, HM60::yqhD(HM501), HM60::fucO(HM502) 또는 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주를 각각 5 ㎖의 M9 최소 배지에 접종하였다. M9 최소 배지는 20 g/ℓ 포도당 및 5 g/ℓ 효모 추출물을 포함하며, 0, 10, 20, 30, 35 또는 40 mM의 농도로 퍼퓨랄을 첨가하였다. 모든 퍼퓨랄 농도 조건에서 배지의 초기 pH는 6.8±0.1로 조절하였다. 배지에 균주를 접종한 다음, 호기성 미생물 조건에서 배양하였으며, 48 시간 동안 세포를 배양한 후, 배지를 수득하여, 96 웰 마이크로플레이트 리더기(TECAN, Switzerland)를 사용하여 OD₅₉₅의 흡광도를 측정하여 세포 생장을 비교하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 HM60, HM60::yqhD(HM501), HM60::fucO(HM502) 또는 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주는 모두 35 mM 이상의 퍼퓨랄 배지에서 생장이 증가하지 않는 것을 확인하였다. 10 mM의 낮은 퍼퓨랄 농도에서 HM60 및 M60::fucO(HM502) 균주의 생장이 저해되지 않는 반면, HM60::yqhD(HM501) 균주는 생장이 저해되어, YqhD 과발현 세포는 퍼퓨랄에 더욱 민감할 뿐 아니라, 퍼퓨랄을 포함하지 않은 배지에서도 세포 밀도가 감소하는 것을 확인하였다(도 1). 이에 비해, FucO를 과발현하는 HM60::fucO(HM502)는 다른 균주에 비해 퍼퓨랄 농도의 증가에도 안정적인 새포생장을 나타내는 것을 확인하였다(도 1). 이는, 배지 내에 포함된 퍼퓨랄을 환원하여 탈독작용을 하기 위해, 균주는 세포 내 NADPH를 소모하며, 이를 통해 결과적으로 세포의 생장이 저해되는 것임을 확인하였다. 추가로, YqhD 및 FucO를 모두 발현하는 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주는 YqhD 또는 FucO를 단독으로 과발현하는 균주에 비해 높은 퍼퓨랄 내성을 나타내어 안정된 세포 생장이 나타나는 것을 확인하였다.

<2-2> YqhD 및 FucO 발현에 따른 재조합 균주의 이소부탄올 생산 효과의 확인

퍼퓨랄을 포함하는 배지에서 대장균의 생장이 억제되는 것은 NADPH를 소모하여 퍼퓨랄을 환원하기 때문이며, 이를 통해 NADPH를 요구하는 생합성경로가 차단되어 이소부탄올의 생산이 억제될 것을 예상하고 퍼퓨랄이 존재하는 배지 환경에서 배양된 재조합 균주의 생장과 이소부탄올의 생산 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 HM60, HM60::yqhD(HM501), HM60::fucO(HM502) 또는 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주를 15 mM 퍼퓨랄을 첨가한 M9 최소 배지에 각각 접종한 후, 48 시간 동안 세포를 배양하였다. 배양 종료 후, 배지를 수득하여 4000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고 상층액의 배지만을 수득한 다음, 동량의 클로로포름을 첨가하였다. 5 초간 배지와 클로로포름을 볼텍싱 혼합하고, 1 분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하여 클로로포름 층을 수득하고 이를 이소부탄올 추출 시료로서 사용하였다.

시료 내 이소부탄올의 정량분석은 가스 크로마토그래피(GC; Young Lin Tech, Korea) 분석을 수행하여 측정하였다. 분석에 사용한 컬럼은 DB-Wax 컬럼(30 m×0.32 mm×0.5 μm)(Agilent Technologies, CA, USA)이며, 불꽃이온화 검출기(FID)를 사용하였다. split ratio는 1:20, 컬럼 내 시료 주입량은 2 ㎕으로 설정하였다. 캐리어 가스는 헬륨 가스로, 3.0 ㎖/min 속도를 유지하였다. 컬럼이 장착된 오븐은 초기 5분 동안 40 ℃도로 예열하고, 40℃에서 230℃까지 분당 12℃씩 증가시킨 후, 최종시간 5 분 동안 유지하여 분석을 수행하였다. 반응 후에는, 동일 조건에서 GC 분석하여 얻은 표준 정량 곡선에 분석한 시료의 피크 면적 값을 대입하여 배지 내 생산된 이소부탄올의 양을 정량하였다. 무처리 대조군으로는 퍼퓨랄을 첨가하지 않은 배지에 재조합 대장균을 접종하고, 동일한 방법으로 이소부탄올 생산 반응을 유도하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 HM60, HM60::yqhD(HM501) 및 HM60::fucO(HM502) 균주의 경우, 세포 밀도가 각각의 무처리 대조군에 비해 각각 26, 14 및 7% 감소하는 것을 확인하였다(도 2a). 이소부탄올 생산에 있어서, HM60::yqhD(HM501) 균주는 퍼퓨랄이 포함된 배지에서 HM60 및 HM60::fucO(HM502) 균주에 비해 높은 수준의 이소부탄올 생산량을 나타내었으나, 무처리 대조군에 비해서는 감소하여 무처리 대조군의 약 50% 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 2b). 이를 통해, YqhD만을 과발현하는 균주에서는 세포의 생장이 저해됨에도 불구하고 이소부탄올 생산 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

또한, qhD 및 FucO를 모두 발현하는 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주는, 퍼퓨랄 포함 여부와 관계없이 YqhD 또는 FucO를 단독으로 과발현하는 균주에 비해 현저한 수준으로 이소부탄올을 생산할 수 있음을 확인하였다(도 2b).

YqhD 및 FucO 공동 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인

YqhD 또는 FucO를 단독으로 과발현하는 균주에 비해서 YqhD 및 FucO를 함께 과발현하는 균주가 퍼퓨랄 포함 배지에서 효과적으로 생장할 수 있고 이소부탄올 생산 효과 역시 높은 수준을 나타내는 것을 확인하였으므로, 이를 보다 구체적으로 확인하였다. HM60::fucO(HM502) 균주는 HM60::yqhD(HM501)에 비해 이소부탄올 생산 효과가 높지 않으므로, HM60::yqhD(HM501) 균주와 HM60::yqhD::fucO(HM601) 균주를 비교하였다.

구체적으로, HM501 균주 또는 HM601 균주를 15 mM 퍼퓨랄이 포함된 M9 최소 배지에 접종한 다음, 총 3일 동안 배양하였다. 배양 중에 일정량의 배지를 수득하여 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 GC 분석을 수행하여 배지 내 생산된 이소부탄올의 양을 정량하였다. 배지 내 퍼퓨랄과 이로부터 환원되어 생성된 퓨퍼릴 알코올의 농도 또한 이소부탄올 정량을 위한 GC 분석과 동일한 조건으로 GC 분석을 수행하여 정량하였다. 정량한 퍼퓨랄의 농도를 사용하여 시간 당 감소된 퍼퓨랄의 농도(mM/h)를 계산하여 재조합 대장균의 탈독 속도(detoxification rate)를 구하였다. 배지 내 잔여 포도당의 농도는 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid; DNS) 정량법을 사용하여 96 웰 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 540 nm 파장에서 발색 정도를 확인하였다. 무처리 대조군으로는 퍼퓨랄을 첨가하지 않은 배지에 HM501 균주 또는 HM601 균주를 접종하여 배양하였다.

그 결과, 하기 [표 3], [표 4], 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이 배양 초기 HM601 균주는 HM501 균주에 비해 세포 생장 속도가 높은 수준으로 나타남과 함께 배지 내 탄소원의 소비가 약 1.4 배 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다(표 3).

또한, HM501 균주에 비해 HM601 균주는 이소부탄올의 생산 효과가 증가하여, 배양 개시 72 시간 후의 이소부탄올 생산량이 HM601 균주의 경우 HM501 균주보다 약 2 배 수준으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3a).

아울러, 퍼퓨랄의 환원(탈독 반응)에 있어서, HM501 균주와 HM601 균주 모두 배지 내 퍼퓨랄을 환원하여 배지 내 퍼퓨랄 농도가 감소하였고, HM601 균주의 퍼퓨랄 탈독 속도는 HM501 균주보다 약 2.1 배 높은 수준이며, 두 균주 모두 배지 내 퍼퓨랄을 퓨퍼릴 알코올로 환원하여 배지 내 퍼퓨랄 농도가 완전히 감소하는 것을 확인하였다(도 3b, 표 3). HM601 균주의 경우 배양 개시 48 시간에 배지 내 모든 퍼퓨랄을 퓨퍼릴 알코올로 전환하였고 이후 가역성 효소반응을 촉매하는 FucO에 의해 퓨퍼릴 알코올이 다시 퍼퓨랄로 전환되는 것을 확인하였다(도 4). FucO 및 YqhD를 함께 발현하는 HM601 균주는 15 mM 퍼퓨랄을 포함하는 배지에서 4.37 g/ℓ의 최종 이소부탄올 생산량을 나타내어, 무처리 대조군과 유사한 수준을 나타내는 것을 확인하였다(표 4). 이를 통해, FucO 및 YqhD 환원 효소를 함께 과발현하는 것은 퍼퓨랄을 퓨퍼릴 알코올로 전환하고, 이소부틸알데하이드를 이소부탄올로 전환하는 속도가 증가하여 퍼퓨랄의 분해와 이소부탄올 생산 증가 효과를 가져올 수 있음을 알 수 있다.

YqhD 및 FucO 공동 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 분해 효과 확인

재조합 균주	포도당 소비 속도 (g/ℓ/h)	퍼퓨랄 분해 속도 (mM/h)
HM60	-	1.90 ± 0.48
HM502 (HM60::fucO)	-	2.45 ± 0.38
HM501 (HM60::yqhD)	0.35 ± 0.05	1.27 ± 0.46
HM601 (HM60::yqhD::fucO)	0.50 ± 0.05	2.65 ± 0.22

YqhD 및 FucO 공동 발현에 따른 재조합 균주의 배지 내 퍼퓨랄 첨가 유무에 따른 이소부탄올 생산 효과의 확인

재조합 균주	퍼퓨랄 무첨가 배지 이소부탄올 생산량(g/ℓ)	15 mM 퍼퓨랄 첨가 배지 이소부탄올 생산량(g/ℓ)	변화 비율^* (%)
HM501(HM60::yqhD)	4.02	2.17	- 46
HM501::pntAB	4.24	3.89	- 9
HM601(HM60::yqhD,fucO)	4.33	4.37	+ 1

* 변화 비율(%)은 15 mM 퍼퓨랄 첨가 배지의 이소부탄올 생산량/퍼퓨랄 무첨가 배지의 이소부탄올 생산량을 백분율로 나타내며, 양수는 증가값 및 음수는 감소값을 나타낸다.

YqhD 및 FucO 공동 발현 및 PntAB 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인

세포막 단백질인 수소 전달 효소(membrane-bound transhydrogenase, PntAB)를 사용하여 NADP(H) 및 NAD(H) 간의 수소전달반응(transhydrogenation)을 개시하여 산화 환원 보조 인자(redox cofactor)의 균형을 조절함으로써 NADPH 사용능을 증가시키는 것을 통해 재조합 대장균 균주가 퍼퓨랄에 대한 내성을 증가시킬 수 있고, 이를 통해 바이오 에탄올 생산량을 증가시킬 수 있음이 보고된 바 있다. 본 발명의 YqhD 및 FucO 공동 발현을 통한 이소부탄올 생산에서도 PntAB의 여부에 따라 퍼퓨랄 내성 및 이소부탄올 생산이 증가할 수 있는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 HM501::pACYC, HM601::pACYC, HM501::pntAB 또는 HM501::pntAB 균주를 각각 15 mM 퍼퓨랄이 포함된 M9 최소 배지에 접종한 다음, 96 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 배지를 수득하여 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 GC 분석을 수행하여 배지 내 생산된 이소부탄올의 양을 정량하였다. 상대적인 생장률(relative growth rate)은 HM60 균주를 배양하면서 중간 대수기(mid-log phase)에 OD₅₉₅를 측정한 값으로 생장 곡선을 그린 다음, 배양 96 시간 이후 각각의 균주 배양 배지의 OD₅₉₅를 측정하여 이를 HM601의 생장곡선과 비교하였다.

그 결과, 도 5 및 표 5에서 나타난 바와 같이 YqhD를 과발현하는 HM501 균주의 경우, PntAB를 발현하지 않는 HM501::pACYC 균주보다 PntAB를 발현하는 HM501::pntAB 균주가 퍼퓨랄에 대한 내성이 증가하면서 약 1.2 배 높은 수준의 세포 밀도를 나타내는 것을 확인하였으며(도 5a), 이소부탄올 생산량 역시 증가하여 pntAB 비발현 HM501::pACYC 균주에 비해 약 1.7배 높은 수준의 이소부탄올 생산량을 나타내는 것을 확인하였다(도 5b). 이에 비해, FucO 및 YqhD 환원 효소를 함께 과발현하는 HM601 균주의 경우에는 PntAB 발현 유무와 관계없이 HM501::pntAB에 비해 높은 수준의 세포 생장 및 이소부탄올 생산 효과를 나타내는 것을 확인하였다(표 5).

YqhD 및 FucO 공동 발현 및 PntAB 발현에 따른 재조합 균주의 퍼퓨랄 내성 여부 및 이소부탄올 생산 효과의 확인

재조합 균주	상대적인 생장 속도	이소부탄올
재조합 균주	상대적인 생장 속도	생산량(g/ℓ)	생산수율(g/g)
HM60	1.00	0.91 ± 0.02	0.05
HM60::yqhD (HM501)	0.76	2.17 ± 0.23	0.11
HM60::fucO (HM502)	1.79	2.21 ± 0.12	0.11
HM60::yqhD::fucO (HM601)	1.43	4.33 ± 0.15	0.23
HM501::pntAB	1.27	3.89 ± 0.13	0.20
HM601::pntAB	1.41	4.32 ± 0.21	0.23

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP AP TECHNOLOGY CO., LTD. <120> A recombinat organism enhanced furfural tolerance and method for production of isobutanol using the same <130> 1060811 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 387 <212> PRT <213> Echerichia coli <400> 1 Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val 20 25 30 Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp 35 40 45 Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly 50 55 60 Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser 85 90 95 Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu 100 105 110 Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys 115 120 125 Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser 130 135 140 Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg 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Claims

알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propandiol oxidoreductase)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고,
상기 알코올 디하이드로게네이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 대장균(E. coli) 유래의 YqhD인, 퍼퓨랄(furfural) 내성이 향상된 재조합 균주.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 FucO인 것을 특징으로 하는, 퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 균주는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 세포막 단백질인 수소 전달 효소(membrane-bound transhydrogenase, PntAB)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 추가 형질전환되는 것을 특징으로 하는, 퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 균주는 하기 a) 내지 d)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발린 생합성 경로 관여 효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 추가 형질전환되는 것을 특징으로 하는, 퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주:
a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS);
b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유래의 α-케토이소발레르산 디카르복실라제(α-ketoisovalerate decarboxylase, KivD);
c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라제(Ketol-acid reductoisomerase, ilvC); 및
d) 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 대장균 유래의 디하이드록시산 탈수소효소(dihydroxyacid dehydratase, ilvD).
제 1항에 있어서, 상기 재조합 균주는 0 내지 40 mM의 퍼퓨랄이 포함된 환경에서 생장 가능한 것을 특징으로 하는, 퍼퓨랄 내성이 향상된 재조합 균주.
제 1항 및 제3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 균주를 바이오매스 유래 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 이소부탄올(isobutanol)의 대량 생산 방법.
제 7항에 있어서, 상기 바이오매스는 목질계 리그노셀룰로오즈(lignocellulose)인 것을 특징으로 하는, 이소부탄올의 대량 생산 방법.
제 7항에 있어서, 상기 배양은 20 내지 40 ℃ 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 이소부탄올의 대량 생산 방법.