CN103993008A

CN103993008A - 一种大批量提取质粒dna的试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN103993008A
Application number: CN201410262140.6A
Authority: CN
Inventors: 荣洪魁; 鹿锋信
Original assignee: Cerberus (wuhan) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Cerberus (wuhan) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明提供一种大批量提取质粒DNA的试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括悬浮剂、裂解液、蛋白析出中和液、质粒DNA沉淀剂、洗涤剂以及质粒DNA溶解剂。采用本发明的方法提取质粒DNA操作时间短，所用试剂组成简单、来源广泛且价格低；获得的质粒DNA产量高、纯度好、无蛋白和RNA的污染，提取的质粒DNA可以直接用于酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，极大方便了生物实验操作，节省实验时间并提高实验效率。

Description

一种大批量提取质粒DNA的试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种大批量提取质粒DNA的试剂盒及其方法。

背景技术

质粒DNA是基因工程常用的载体，可以携带外源基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学研究领域中应用最广泛和最基本的技术。质粒提取的效率和质量对于后续实验(酶切、PCR扩增和测序等)的成功与否有着直接的关系。目前，国内外的生物试剂公司都研制了与提取质粒DNA技术相关的试剂盒。该类试剂盒多以纯化柱为主，成本高、试剂繁杂且耗时较长，获得的质粒DNA产量低，纯度低，不能满足下游的酶切和测序的要求，这样加大了实验的工作量，使得实验时间显著延长，影响生物学实验操作和实验结果。

发明内容

鉴于背景技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种大批量提取质粒DNA的试剂盒及其方法，其可采用96孔板液体培养基大批量地获得质粒DNA，能降低实验经费和试验时间；

本发明的又一目的在于提供一种大批量提取质粒DNA的试剂盒及其方法，其采用96孔板液体培养基得到的质粒DNA纯度好、无蛋白和RNA的污染；其可直接用于酶切、测序、原核转化和真核转染等实验，极大方便了生物实验操作、节省实验时间并提高实验效率。

为了实现本发明的目的，在本发明的第一个方面，本发明提供一种大批量提取质粒DNA的试剂盒，所述试剂盒包括悬浮剂、裂解液、蛋白析出中和液、质粒DNA沉淀剂、洗涤剂以及质粒DNA溶解剂。

为了实现本发明的目的，在本发明的第二个方面，本发明提供一种大批量提取质粒DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(1)摇菌扩增质粒：将样品培养，所述样品为大肠杆菌，将具有质粒的大肠杆菌接种于含有TB或2xYT营养成分的96孔板液体培养基中，置于37℃恒温摇床上以200～220转/分钟摇动培养；(2)将培养8小时的大肠杆菌液置于20℃板式离心机以4000g转速离心3min，弃掉上清液；(3)将100μl悬浮剂加入离心后得到的沉淀中，充分振荡混匀；再加入200μl裂解液，置于水平振荡仪上混匀120s；然后加入150μl蛋白析出中和液，混合均匀；(4)将上述溶液以4000g转速离心10min，收集上清液；(5)将质粒DNA沉淀剂加入所述上清液中，颠倒混匀，以4000g转速离心15min；弃上清液，将220μl洗涤剂加入得到的质粒DNA沉淀中洗涤，离心5min；弃上清液，将沉淀真空抽滤5min；(6)采用50μl质粒DNA溶解剂溶解抽滤后得到的质粒DNA沉淀。

通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明采用碱裂解改良剂除去蛋白质和RNA，采用本发明的方法提取质粒DNA操作时间短，所用试剂组成简单、来源广泛且价格低；获得的质粒DNA产量高、纯度好、无蛋白和RNA的污染，提取的质粒DNA可以直接用于酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，极大方便了生物实验操作，节省实验时间并提高实验效率。

附图说明

图1为从大肠杆菌提取的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

附图标记说明

泳道1、2与3为从大肠杆菌提取的质粒DNA的电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

根据本发明的第一方面的一种大批量提取质粒DNA的试剂盒，所述试剂盒包括悬浮剂、裂解液、蛋白析出中和液、质粒DNA沉淀剂和质粒DNA溶解剂。

在根据本发明的一种大批量提取质粒DNA的试剂盒中，所述悬浮剂包含50mmol/L葡萄糖、25mmol/L pH值为7.5-8.5的Tris-HCl与10mmolEDTA经过120℃-121℃蒸汽高压灭菌15min，使用前添加200μg/ml RNA酶(RNaseA)；所述裂解液包含0.2mol/L NaOH与M/V为1％十二烷基磺酸钠(SDS)；所述蛋白析出中和液包含KAc、冰醋酸、10-15mg/ml聚乙二醇(PEG)并蒸汽高压灭菌15min，其中K⁺的浓度为3mol/L，Ac^-的浓度为5mol/L；所述质粒DNA沉淀剂为异丙醇；所述洗涤剂为70％乙醇；所述质粒DNA溶解剂为纯净水。

PEG可增强水溶性大分子之间的有效作用，可诱导水溶液中大分子的聚集.在质粒提取中可使提取的质粒稳定可靠。

在根据本发明的一种大批量提取质粒DNA的试剂盒中，所述Tris-HCl的pH值优选为8.0。

在根据本发明的一种大批量提取质粒DNA的试剂盒中，当NaOH的浓度小于0.1mol/L时，菌体裂解不完全得到少量的DNA；当NaOH的浓度大于0.25mol/L时，裂解过度使得质粒DNA开环，会导致中和液中PEG对蛋白聚集作用减弱使得质粒DNA纯度降低，优选地，所述NaOH的浓度为0.2mol/L。

在根据本发明的一种大批量提取质粒DNA的试剂盒中，优选地，所述PEG的浓度为12mg/L。

根据本发明的第二方面的一种大批量提取质粒DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(1)摇菌扩增质粒：将样品培养，所述样品为大肠杆菌，将具有质粒的大肠杆菌接种于含有TB或2xYT营养成分的96孔板液体培养基中，置于37℃恒温摇床上以200～220转/分钟摇动培养；(2)将培养8小时的大肠杆菌液置于20℃板式离心机以4000g转速离心3min，弃掉上清液；(3)将100μl悬浮剂加入离心后得到的沉淀中，充分振荡混匀；再加入200μl裂解液，置于水平振荡仪上混匀120s；然后加入150μl蛋白析出中和液，混合均匀；(4)将上述溶液以4000g转速离心10min，收集上清液；(5)将质粒DNA沉淀剂加入所述上清液中，颠倒混匀，以4000g转速离心15min；弃上清液，将220μl洗涤剂加入得到的质粒DNA沉淀中洗涤，离心5min；弃上清液，将沉淀真空抽滤5min；(6)采用50μl质粒DNA溶解剂溶解抽滤后得到的质粒DNA沉淀。

在根据本发明的第二方面的一种大批量提取质粒DNA的方法中，所述悬浮剂包含50mmol/L葡萄糖、25mmol/LpH值为7.5-8.5的Tris-HCl与10mmolEDTA经过120℃-121℃蒸汽高压灭菌15min，使用前添加200μg/mlRNA酶(RNaseA)；所述裂解液包含0.2mol/L NaOH与M/V为1％十二烷基磺酸钠(SDS)；所述蛋白析出中和液包含KAc、冰醋酸、10-15mg/ml聚乙二醇(PEG)并蒸汽高压灭菌15min，其中K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L；所述质粒DNA沉淀剂为异丙醇；所述洗涤剂为70％乙醇；所述质粒DNA溶解剂为纯净水。

实施例

将具有质粒的大肠杆菌接种于含有TB或2xYT营养成分的96孔板液体培养基中，置于37℃恒温摇床上以210转/分钟摇动培养；(2)将培养8小时的大肠杆菌液置于20℃板式离心机以4000g转速离心3min，弃掉上清液；(3)将100μl悬浮剂(所述悬浮剂中葡萄糖浓度为50mmol/L、Tris-HCl的pH值为8.0，浓度为25mmol/L与10mmolEDTA经过121℃蒸汽高压灭菌15min，使用前添加RNA酶(RNaseA)，其浓度为200μg/ml)加入离心后得到的沉淀中，充分振荡混匀；再加入200μl裂解液(所述裂解液中NaOH浓度为0.2mol/L，十二烷基磺酸钠(SDS)的M/V为1％)置于水平振荡仪上混匀120s；然后加入150μl蛋白析出中和液(所述蛋白析出中和液中具有KAc、冰醋酸、12mg/ml聚乙二醇(PEG)并蒸汽高压灭菌15min，其中K⁺的浓度为3mol/L，Ac^-的浓度为5mol/L)，混合均匀；(4)将上述溶液以4000g转速离心10min，收集上清液；(5)将质粒DNA沉淀剂(所述质粒DNA沉淀剂为异丙醇，其体积为上清液体积的70％)加入所述上清液中，颠倒混匀，以4000g转速离心15min；弃上清液，将220μl洗涤剂(所述洗涤剂为70％乙醇)加入得到的质粒DNA沉淀中洗涤，离心5min；弃上清液，将沉淀真空抽滤5min；(6)采用50μl质粒DNA溶解剂(所述质粒DNA溶解剂为纯净水)溶解抽滤后得到的质粒DNA沉淀。

所提取质粒DNA的电泳检测：

所需试剂及仪器：5×TBE、54g Tris碱、27.5g硼酸、4.65gEDTA-2Na·2H₂O并加重蒸水至1000ml、10mg/ml溴化乙锭(EB)、琼脂糖、6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，40％(W/V)蔗糖水溶液(用时需稀释到1×)、电泳仪、成像仪。

1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加10mg/ml EB母液至终浓度0.5μg/ml(注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE)。取制备的质粒DNA1-2μl，加6μl1×上样缓冲液混匀上样,在中间或最后一个孔加入3μl的DNAMarker，采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置(大约25min)，取出凝胶置紫成像仪下检测，照相。

采用本发明的技术方案得到的结果为1ml的大肠杆菌可得到DNA的量为2.0μg。

根据计算在260nm波长下，每毫升1微克DNA溶液的OD值为0.020，即在OD260＝1时，双链DNA含量为50微克/毫升；单链DNA与RNA含量为40微克/毫升。

采用本发明的技术方案得到的OD260/OD280为1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.7，表明有蛋白质污染)

结果显示，采用本发明的技术方案提取的DNA质量和纯度较高。

本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种大批量提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，其包括悬浮剂、裂解液、蛋白析出中和液、质粒DNA沉淀剂、洗涤剂以及质粒DNA溶解剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述悬浮剂包含50mmol/L葡萄糖、25mmol/L pH值为7.5-8.5的Tris-HCl与10mmolEDTA经过120℃-121℃蒸汽高压灭菌15min，使用前添加200μg/ml RNA酶(RNaseA)；

所述裂解液包含0.1-0.25mol/L NaOH与M/V为1％十二烷基磺酸钠(SDS)；

所述蛋白析出中和液包含KAc、冰醋酸与10-15mg/ml聚乙二醇(PEG)并蒸汽高压灭菌15min，其中K⁺的浓度为3mol/L，Ac^-的浓度为5mol/L；

所述质粒DNA沉淀剂为异丙醇；

所述洗涤剂为70％乙醇；

所述质粒DNA溶解剂为纯净水。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl的pH值为8.0。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NaOH的浓度为0.2mol/L。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG的浓度为12mg/L。

6.采用权利要求1-5中任一项所述的试剂盒的一种大批量提取质粒DNA的方法，包括以下步骤：

(1)摇菌扩增质粒：将样品培养，所述样品为大肠杆菌，将具有质粒的大肠杆菌接种于含有TB或2xYT营养成分的96孔板液体培养基中，置于37℃恒温摇床上以200～220转/分钟摇动培养；

(2)将培养8小时的大肠杆菌液置于20℃板式离心机以4000g转速离心3min，弃掉上清液；

(3)将100μl悬浮剂加入离心后得到的沉淀中，充分振荡混匀；再加入200μl裂解液，置于水平振荡仪上混匀120s；然后加入150μl蛋白析出中和液，混合均匀；

(4)将上述溶液以4000g转速离心10min，收集上清液；

(5)将质粒DNA沉淀剂加入所述上清液中，颠倒混匀，以4000g转速离心15min；弃上清液，将220μl洗涤剂加入得到的质粒DNA沉淀中洗涤，离心5min；弃上清液，将沉淀真空抽滤5min；

(6)采用50μl质粒DNA溶解剂溶解抽滤后得到的质粒DNA沉淀。

7.根据权利要求6所述的一种大批量提取质粒DNA的方法，其特征在于，

所述裂解液包含0.2mol/L NaOH与M/V为1％十二烷基磺酸钠(SDS)；

所述蛋白析出中和液包含KAc、冰醋酸、10-15mg/ml聚乙二醇(PEG)并蒸汽高压灭菌15min，其中K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L；

所述质粒DNA沉淀剂为异丙醇；

所述洗涤剂为70％乙醇；

所述质粒DNA溶解剂为纯净水。