CN112831443A - 一株枯草芽孢杆菌、菌剂及其在防治植物病害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌、菌剂及其在防治植物病害中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌QNJK01，其保藏编号为CGMCC 20376。本发明还提供一种用于培养上述枯草芽孢杆菌的发酵培养基，其包括以下成分：200g/L的马铃薯、10～50g/L的葡萄糖、1～5g/L的氯化铵、0.1～0.5g/L的硫酸锰、0.1～0.5g/L的硫酸镁。本发明提供的一株新的枯草芽孢杆菌QNJK01对植物根部病害特别是花生根部真菌病害和根结线虫病具有广谱防治效果，通过盆栽试验以及田间试验证明，枯草芽孢杆菌QNJK01不仅可高效防治花生常见的多种真菌病害，同时还可以有效防治花生根结线虫病，大幅度地提高花生植株的饱果率和产量；枯草芽孢杆菌QNJK01对果蔬根部真菌病害和根结线虫病也具有良好的防治效果。

Description

一株枯草芽孢杆菌、菌剂及其在防治植物病害中的应用

技术领域

本发明涉及微生物和植物病害生物防治领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌、菌剂及其在防治植物病害中的应用。

背景技术

花生是世界上重要的油料作物之一，种植广泛。我国是花生生产大国，在我国花生是一种重要的经济作物和出口创汇作物，为世界油脂的生产做出了突出贡献。2017年，我国花生面积达4607.66千公顷，单位面积产量为3709.55公斤/公顷。花生及花生仁出口金额达到224.7百万美元，居世界第一位，是我国为数不多的净出口农作物品种之一。花生根部病害是世界性问题，危害花生严重的根部病害主要有花生白绢病、花生根腐病、花生立枯病、花生冠腐病和花生根结线虫病。我国花生连作比较普遍，花生根部病害发生尤为严重，严重制约我国花生产业的发展。

目前防治花生病害方法基本分为农业防治、物理防治、化学防治和生物防治四大类。轮作和选育种植抗病花生品种是两种有效的农业防治花生病害的方法，由于花生耕种范围广、耕地资源和耕作条件等方面制约，轮作受到较大限制；目前生产上尚缺乏农艺性状良好的花生抗病品种。热力处理是有效的杀死病原物方法，但成本高、无差别杀死土壤中有益微生物，破坏土壤的微生态环境难以大面积推广应用。化学杀菌剂以及杀线剂高效、使用方便，是花生病害防治的主要方法；长期使用化学制剂导致农药残留超标、病原菌抗药性增、防效下降、严重污染环境等问题日趋突出，已不适用于绿色、高效的防治花生病害要求，因此迫切的需要寻找一种新的绿色防治花生病害方法。

生物防治具有绿色、安全、环境友好等特点，是控制花生根部病害的重要手段，也是今后的发展方向，开发生防制剂以作为化学农药的补充或替代品，利用拮抗微生物来防治花生根部病害的研究倍受关注，具有良好的社会、经济效益与环境效益。

生物防治研究已经取得了一定研究进展，但受生防菌菌种资源、发酵培养技术、制剂化、稳定性及成本、实际应用效果等问题的限制，目前尚处于研究、试验阶段。已发现可用于花生根部病害防治的微生物主要有真菌和细菌两大类。大部分生防真菌在室内及盆栽试验中有较好的防治效果，但在大田防治试验中往往会受定殖能力、温度、湿度等多种因素的限制而无法发挥出理想的效果。细菌一般具有易培养、繁殖快、定殖能力强等特点，是重要的花生根部病害生防菌资源，但是自然界中现有和未发现的细菌种类繁多，而不同细菌菌株生防效果差异极大，具有菌株特异性，多对应用的植物病害具有一定特异性，应用范围受限制。同时，目前由于设施农业的快速发展，瓜类、蔬菜等植物根部真菌病害和根结线虫危害日益严重，缺少高效、广谱拮抗生防菌防控相应病害。因此，筛选高效、广谱拮抗细菌菌株是花生根部病害和蔬菜根部线虫及真菌病害生物防治研究应用需要解决的重要问题。

因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株具有广谱拮抗效果、可有效防治花生多种根部病害的枯草芽孢杆菌、菌剂及其在防治植物病害中的应用，以解决现有多种植物根部病害防治中化学农药高毒或成本高实施应用困难、破坏土壤生态环境等不足的问题，而现有生防细菌普遍应用范围窄，实际应用时需要多种细菌组合使用，成本高昂的问题。

为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，为枯草芽孢杆菌QNJK01，其保藏编号为CGMCC 20376。

上述枯草芽孢杆菌具有以下生物学特性：所述的枯草芽孢杆菌QNJK01为杆状，其长度为2～3μm、宽度为0.7μm～0.8μm；产芽孢、芽孢中生至偏端生，革兰氏染色反应阳性；所述枯草芽孢杆菌能利用蔗糖、葡萄糖，不能利用乳糖和山梨醇，柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、明胶水解、接触酶试验反应都为阳性；酪氨酸分解、丙酸盐利用反应都为阴性。

第二方面，本发明还提供一种用于培养上述枯草芽孢杆菌的发酵培养基，其包括以下成分：180～220g/L的马铃薯、10～50g/L的葡萄糖、1～5g/L的氯化铵、0.1～0.5g/L的硫酸锰、0.1～0.5g/L的硫酸镁。

优选地，上述发酵培养基包括以下组分：200g/L的马铃薯、50g/L的葡萄糖，2g/L的氯化铵、0.2g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸锰。

第三方面，本发明还提供一种枯草芽孢杆菌菌剂，该菌剂采用上述枯草芽孢杆菌QNJK01进行发酵培养制备得到，菌剂的剂型为液体或固体。

第四方面，本发明还提供一种上述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)发酵种子培养液制备：调节发酵培养基初始pH值为5，装瓶量为20％，按1％接种量接种1×10⁸CFU/mL枯草芽孢杆菌悬浮液，在28℃培养条件下振荡培养16～18h。

(2)将发酵培养基加入发酵罐中，装料系数为50～80％，121℃灭菌20～40min；再按1％～9％的接种量接入培养16～18h的枯草芽孢杆菌种子液，200～300r/min，20℃～40℃条件下发酵，加入消泡剂控制消泡，发酵过程中通气量(V/V·min)1:(1～2)，控制pH为5，发酵30～40h，得到发酵液；

(3)用无菌水将发酵液调整到1×10⁹CFU/mL，即得枯草芽孢杆菌的液体菌剂；将所述液体菌剂按1:1的体积质量比加入灭菌的麸皮吸附，干燥后即得枯草芽孢杆菌固体菌剂。

第五方面，本发明还提供上述枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌菌剂在防治植物病害中的应用，所述植物病害包括花生病害、棉花病害、番茄病害、辣椒病害、茄子病害和瓜类病害。

优选地，所述花生病害包括花生冠腐病、花生立枯病、花生根腐病、花生白绢病和花生根结线虫病。

优选地，枯草芽孢杆菌的固体菌剂的使用方法为：在植物播种时，施用枯草芽孢杆菌的固体菌剂，施用剂量为5kg/亩～7kg/亩。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的一株新的枯草芽孢杆菌QNJK01，对花生以及其他植物根部病害具有广谱防治效果，通过室内平板实验，盆栽实验以及田间试验都充分验证了：枯草芽孢杆菌QNJK01不仅可高效防治花生常见的多种真菌病害，包括根腐病、立枯病、白绢病和冠腐病，同时还可以有效防治花生根结线虫病，大幅度地提高花生植株的饱果率和产量。

2、本发明提供的上述枯草芽孢杆菌QNJK01的专用发酵培养基，配方成分简单，满足该菌的生长特性和营养需求；枯草芽孢杆菌QNJK01的菌剂的制备方法效率高，操作简单，可最大程度地提高枯草芽孢杆菌QNJK01的发酵产量，保证了枯草芽孢杆菌QNJK01的市场推广应用的可行性。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌QNJK01的芽孢及着生位置；

图2枯草芽孢杆菌QNJK01挥发性代谢产物对齐整小核菌生长的抑制作用；

图3枯草芽孢杆菌QNJK01挥发性代谢产物对茄孢镰刀菌生长的抑制作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：枯草芽孢杆菌的分离筛选

1.培养基的制备

LB液体培养基的配方为：酵母提取物5g；胰蛋白胨10g；氯化钠10g；琼脂粉20g；蒸馏水，1L。pH调制7.2，121℃高温灭菌20min。

2.枯草芽孢杆菌的分离筛选

实验方法：利用五点取样法从山东省安丘市柘山镇多年连作花生病田取花生根际土壤样品，利用LB固体培养基采用稀释涂布法对土壤中微生物进行分离。将分离得到的单菌落进行转接划线纯化，保存在相应培养基斜面中，便于后续实验使用。

拮抗菌筛选：分别将花生冠腐病、花生白绢病、花生根腐病、花生立枯病的病原菌黑曲霉、齐整小核菌、镰刀菌以及立枯丝核菌接种到PDA培养基上，实验组将前述分离得到的细菌分别与不同病原菌进行对峙培养，对照组不接种分离的细菌，每组设置3次重复，待对照组病原菌长满平皿，测量处理组病原菌生长状况，用这种方法筛选到对黑曲霉、齐整小核菌、镰刀菌以及立枯丝核菌均有较强拮抗作用的菌株后，采用相同方法检测这些菌株对其他常见植物病害病原菌的拮抗作用。

拮抗菌挥发性物质的拮抗活性：以花生根腐病、花生立枯病、花生白绢病和花生冠腐病4种病原菌为指示菌，测定拮抗菌产生的挥发性物质的抑菌活性。具体方法为：将拮抗菌Y13涂布在PDA固体培养基表面制备涂布拮抗菌的PDA平板，对照为不涂菌的PDA平板；将直径5mm供试病原菌菌饼接种至PDA平板中央；将接种了病原真菌的PDA平板分别倒扣到涂布拮抗菌的PDA平板和不涂菌的PDA平板上，用封口膜将两个培养皿封住，于28℃恒温培养箱中培养，3次重复。待对照即将长满平板时，测量并记录对照组以及处理组的病原菌菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100

实验结果：从土壤样品筛选到一株对多种植物真菌病害的病原真菌均有拮抗作用且拮抗效果最强的细菌，编号为QNJK01，其对植物真菌性病害的病原菌及其它常见植物病害的病原菌的抑制率见下表1，抑菌效果见图2和图3。可知，该QNJK01对常见的多种花生根部病害都具有较好的抑菌效果，并且这株分离自花生病田的细菌QNJK01对其他多种植物病害(如棉花、番茄和茄子等常见病害)也具有较好的抑菌效果，尤其是对茄子黄萎病、瓜类枯萎病的抑菌效果分别高达70.15％和86.35。

表1 QNJK01对植物病害病原菌的拮抗效果

QNJK01的挥发性物质对4种病害的病原菌均有较好的抑制效果，对齐整小核菌、黑曲霉以及镰刀菌的抑制率均达到90％以上(见表2)。

表2 QNJK01挥发性物质对4种病原菌的抑制效果

实施例2枯草芽孢杆菌QNJK01的鉴定

1、形态学鉴定和生理生化特性检测

将分离到的菌株QNJK01接种到LB平板上，28℃恒温培养18～48h，观察菌落生长情况，挑取菌体制备涂片，进行革兰氏染色，显微观察菌体形态和芽孢形成情况，进行形态学鉴定。采用常规方法进行糖(醇)类发酵试验、Voges-Proskauer试验(伏-普试验，V.P.试验)、甲基红试验(M.R试验)、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、明胶水解试验，接触酶试验、酪氨酸水解试验(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册,第一版.北京,科学出版社,2001)。

结果表明：QNJK01的菌落为微黄色、较大、圆形或者近似圆形、边缘透明锯齿状长时间培养形成皱褶，当培养基表面湿润时，容易扩散。QNJK01为杆状，其长度为2μm～3μm、宽度为0.7μm～0.8μm；产芽孢、芽孢中生至偏端生、柱状(见图1)，孢子囊不膨大，革兰氏染色反应阳性。

QNJK01能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇，柠檬酸盐试验阳性、淀粉水解试验阳性、接触酶试验阳性、伏普试验反应阳性、明胶水解试验阳性、甲基红试验阳性和酪素水解阳性，该菌不能利用乳糖、山梨醇和丙酸盐。

2、16S rRNA基因序列的测定分析

挑取QNJK01菌株单菌落接种于LB液体培养基中28℃、200rpm振荡培养18h，采用DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组。

利用细菌16S rRNA基因通用引物27f和1492r，进行16S rRNA基因的PCR扩增，引物序列如下：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO:1)

1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:2)

PCR反应体系(25μL)：

PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性0.5min、51℃退火0.5min、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，胶回收产物与pMD 18-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆并进行测序，测序由北京擎科生物技术有限公司完成，序列利用RDP数据库和NCBI数据库进行BLAST分析。

16S rDNA扩增产物为1500bp左右，测序获得菌株QNJK01的16S rRNA基因序列(1509bp)如SEQ ID NO:3所示(具体见序列表)。

基因比对结果显示，菌株QNJK01的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中Bacillussubtilis subsp.subtilis NCIB 3610 16S ribosomal RNA基因(CP034484)和Bacillussubtilis subsp.subtilis strain DSM 10(CP060710)16S ribosomal RNA基因的序列相似性均为99.67％；与RDP数据库中Bacillus subtilis strain DSM10的16S ribosomalRNA(short ID：S000003473)相似性最高，S_ab score为0.987。

结合菌株的形态学特征、生理生化特性和上述基因序列比对结果，最终将菌株QNJK01鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

将筛选到的枯草芽孢杆菌QNJK01于2020年7月18日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 20376，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

实施例3枯草芽孢杆菌QNJK01发酵培养基的优化

为了摸索出最适合枯草芽孢杆菌QNJK01这个新菌株生长繁殖的发酵培养基，便于工业化生产应用，进行以下发酵培养及的优化实验。

采用L₉(3⁴)正交试验设计，对枯草芽孢杆菌QNJK01的发酵培养基中的葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、硫酸锰浓度进行优化，按照表3设置处理组1-9，每组中向200g/L煮沸后过滤的马铃薯汁中分别按照表3中的要求加入其它成分，正交试验极差分析结果如表3所示：

表3 QNJK01发酵培养基L₉(3⁴)正交试验设计极差分析

通过极差分析结果得到：枯草芽孢杆菌QNJK01最优发酵培养基制备方法为：200g/L马铃薯煮沸20～30min纱布过滤取滤汁后，向滤汁中加入葡萄糖50g/L，氯化铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.3g/L，混合均匀，即得到发酵培养基。

对正交试验结果进行验证，控制其它成分含量不变，设置A处理(葡萄糖浓度为50g/L)和B处理(葡萄糖含量为60g/L)，于28℃、150rpm/min条件下发酵48h，采用涂布法计算每mL发酵液中的活菌数，结果发现A处理的活菌数为2.78×10⁹cfu/mL，B处理的活菌数为2.47×10⁹cfu/mL，经验证，QNJK01发酵培养基中最适葡萄糖含量为50g/L。

实施例4枯草芽孢杆菌QNJK01菌剂的制备

按照前一实施例的优化后配方制备发酵培养基，并将其加入全自动机械搅拌通风发酵罐中，装料系数65％，121℃灭菌30min，按3％的接种量接入培养16～18h的种子液，250r/min，28℃发酵，以豆油为消泡剂自动控制消泡；发酵过程中通气量(V/V·min)为1:1.2，并控制发酵培养基的pH为5.0，发酵48h后，活菌数达到3.2×10¹⁰CFU/mL。

用无菌水将QNJK01发酵液的浓度调整到1×10⁹CFU/mL，即得QNJK01液体菌剂，将QNJK01液体菌剂按1:1(V:W)的比例加入灭菌的麸皮进行菌剂吸附，待麸皮干燥后即得QNJK01固体菌剂。

实施例5：盆栽条件下枯草芽孢杆菌QNJK01对花生真菌性根部病害的防治

1、实验方法：

病原菌培养液制备：分别将花生根腐病病原菌(镰刀菌)、立枯病病原菌(立枯丝核菌)、花生白绢病病原菌(齐整小核菌)、花生冠腐病病原菌(黑曲霉)接种到PD液体培养基中，28℃、200rpm振荡发酵培养5d，制备花生真菌性根部病害病原菌发酵液。

花育25号花生种子用1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗，28℃保湿催芽。将花生田土壤165℃干热灭菌2.5h去除大土块混匀装至花盆中，每盆1kg，播种催芽的花生种子，每盆7粒。空白组浇灌20mL无菌水，处理组为每盆浇20mL QNJK01液体菌液和发酵5d的病原菌培养液，对照组为每盆接种发酵5d的相应病原菌培养液20mL，5次重复。28℃气候室培养4个月，期间定时浇水。调查发病率，计算防病效果。统计分析采用DPS v7.5(DataProcessing System)软件进行Duncan新复极差法。

防效(％)＝(对照区发病率－处理区发病率)/对照区发病率×100

2、实验结果：

如表4和表5所示，枯草芽孢杆菌QNJK01处理能显著地增加花生的茎叶鲜重、株高、根长，提高花生的叶绿素含量，促进花生的生长，有效抑制花生根部真菌病害，对花生根腐病、立枯病、白绢病和冠腐病具有很好的防治效果。

表4 QNJK01防治花生根部真菌病害对花生生长的影响

表5 QNJK01对花生真菌性根部病害的防治效果

实施例5：QNJK01对花生根结线虫病的防治

1、实验方法：

花育25号用1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗，28℃保湿催芽。将取自花生根结线虫病害严重的土壤装入花盆中，每盆装3Kg，之后播种催芽的花生种子，每盆15粒。处理为每盆浇150mL QNJK01液体菌剂，向对照组中加入150mL无菌水，向化学药剂组中加入0.07克噻唑磷和150mL无菌水。每组重复3次，以确保数据的准确性。花生在28℃和80％湿度的温室中培养3个月。然后对花生的叶绿素含量、株高、根长、根重和根瘤指数进行了调查和记录。

花生根结线虫病病情指数符合《中华人民共和国国家标准》(GB/T17980.38-2000)根结线虫病病情指数分级标准。统计分析采用DPS v7.5(Data Processing System)软件进行Duncan新复极差法。

2、实验结果及分析：

从表6的结果中可知，QNJK01处理能显著地增加花生的茎叶鲜重、株高，提高花生的叶绿素含量，减少花生根结线虫侵染花生，促进花生的生长，防治花生根结线虫病。

表6 QNJK01对花生生长的影响以及防病效果

实施例6：QNJK01防治花生根部病害大田试验

1、实验方法：

试验在山东平度花生根部病害严重的花生田进行，供试作物为花生，品种为花育15号，小区试验，试验设A(QNJK01液体菌剂)、B(10％噻唑磷颗粒剂)和CK(对照)3个处理，A处理于花生播种前沟施QNJK01固体菌剂，剂量为5kg/666.7m²；B处理于花生播种前混土撒施2kg/666.7m²的10％噻唑磷颗粒剂，对照区不处理。

5月8日播种花生，3次重复，常规田间管理，播种后2个月取样调查花生生长情况，播种4个月之后调查花生根部真菌病害发生情况及防效、根结线虫根结指数、每株花生亩产、饱果率、秕果率、烂果率，评价防治效果，收获前根据植株地上部生长情况调查统计病死株率。花生根结线虫病病情指数符合《中华人民共和国国家标准》(GB/T17980.38-2000)根结线虫病病情指数分级标准，采用DPS v7.5(Data Processing System)软件进行Duncan新复极差法统计分析。

根结线虫病防治效果(％)＝(对照区根结指数－处理区根结指数)/对照区根结指数×100

2、实验结果及分析：

从表7和表8的实验结果中可知，QNJK01处理组的植株株高和植株鲜重以及根长显著高于对照组，说明QNJK01的处理能促进花生的生长；QNJK01处理组的花生真菌病害以及根结线虫侵害程度明显低于对照组，其饱果率和产量高于对照组以及噻唑膦组，可见QNJK01对花生真菌病害及根结虫的防病效果明显。

表7 QNJK01对花生生长的影响(第1次调查)

表8 QNJK01对花生病害的防治效果(第2次调查)

实施例7：枯草芽孢杆菌QNJK01防治甜瓜根结线虫和枯萎病

1、实验方法：

试验在山东即墨移风店黄瓜根结线虫和枯萎病危害严重的温室大棚中进行，供试作物为甜瓜，品种为羊角蜜。小区试验，试验设A、B和CK(对照)3个处理，A处理于黄瓜移栽前穴施1×10⁹CFU/mL QNJK01液体菌剂40mL、B处理于黄瓜移栽前混土撒施2kg/666.7m²的10％噻唑磷颗粒剂，对照区移栽前不处理。2019年4月18日移栽，大垄双行，垄距85cm，株距35cm，31.88m²/区；3次重复。滴灌，常规田间管理，移栽后2个月调查黄瓜根结线虫根结指数，黄瓜枯萎病发病率，评价防治效果。根结严重度分0～10级，采用DPS v7.5(Data ProcessingSystem)软件进行Duncan氏新复极差法统计分析。

防治效果(％)＝(对照区根结指数－处理区根结指数)/对照区根结指数×100

或防治效果(％)＝(对照区发病率－处理区发病率)/对照区发病率×100

2、实验结果及分析：

试验结果见表9，QNJK01处理甜瓜根结线虫病根结指数显著低于对照，但与对照药剂差异不显著，效果显著；QNJK01处理对甜瓜根结线虫病防效66％，效果显著；防效高于对照药剂。QNJK01处理甜瓜枯萎病发病率显著低于对照，对甜瓜枯萎病平均防效达到75％，效果显著。

表9 QNJK01菌剂对甜瓜枯萎病和根结线虫病的防治效果

实施例8：枯草芽孢杆菌QNJK01对番茄病害的防治

1、实验方法：

试验在山东即墨移风店蔬菜根结线虫危害严重的温室大棚中进行，供试作物为番茄，番茄品种为齐大力，试验设A、B和CK(对照)3个处理，A处理于番茄移栽前穴施1×10⁹CFU/mL QNJK01液体菌剂40mL、B处理于番茄移栽前混土撒施10％噻唑磷颗粒剂2kg/666.7m²，对照区移栽前不处理。2018年9月18日移栽，大垄双行，垄距90cm，垄内行距60cm、株距40cm，25.2m²/区；3次重复。滴灌，常规田间管理，移栽后80天调查枯萎病发病率并取样调查根结线虫根结指数，评价防治效果，根结严重度分0～10级，统计分析参见实施例7。

防治效果(％)＝(对照区根结指数－处理区根结指数)/对照区根结指数×100

或防治效果(％)＝(对照区发病率－处理区发病率)/对照区发病率×100

2、实验结果及分析：

试验结果见表10，QNJK01处理根结指数显著低于对照，与化学药剂差异不显著，QNJK01处理防病效果显著，平均防效60％以上，防效与对照化学药剂相当。QNJK01处理番茄枯萎病发病率略低于对照，平均防效70％以上，效果显著高于B处理(10％噻唑磷颗粒剂处理)的效果。

表10 QNJK01菌剂对番茄枯萎病和根结线虫病的防治效果

实施例9：枯草芽孢杆菌QNJK01防治茄子黄萎病

1、实验方法：

试验设在山东即墨移风店蔬菜大棚中，大棚棚宽7.5米，上茬茄子。供试茄子品种为紫长茄，采用宽垄双行栽培，垄宽1.3米，株距35厘米，每穴栽一株，3月下旬移栽定植。试验设3个处理，A：定植时穴施QNJK01菌剂2g/株；B：定植时每株100毫升70％甲基托布津1000倍液灌根；CK，空白对照；39m²/小区，随机排列，3次重复。定植后2个月调查发病情况，茄子黄萎病调查参照农药田间药效试验准则第34部分:杀菌剂防治茄子黄萎病(NY/T1464.34-2010)。

防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)÷对照区病情指数×100

2、实验结果及分析：

试验结果见表11，QNJK01处理茄子黄萎病发病率明显下降，可显著降低茄子黄萎病的病情指数，平均防效70％以上，优于化学药剂，但与化学药剂比差异不显著，实验结果表明QNJK01可有效防治茄子黄萎病。

表11枯草芽孢杆菌QNJK01对茄子黄萎病的防治效果

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株枯草芽孢杆菌、菌剂及其在防治植物病害中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列27F(Synthetic sequence 27F)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列1492R(Synthetic sequence 1492R)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌 QNJK01的16S rDNA 基因(16S rDNA of Bacillus subtilisQNJK01)

<400> 3

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttagggtt 840

tccgccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag 900

actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac 1020

gtcccttcgg ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc 1140

actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1200

gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc 1260

gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac 1320

tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1380

ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt 1440

aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag tcgtaacaag 1500

gtagccgta 1509

Claims (9)

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，为枯草芽孢杆菌QNJK01，其保藏编号为CGMCC20376。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，具有以下生物学特性：所述的枯草芽孢杆菌QNJK01为杆状，其长度为2～3μm、宽度为0.7μm～0.8μm；产芽孢、芽孢中生至偏端生，革兰氏染色反应阳性；所述枯草芽孢杆菌能利用蔗糖、葡萄糖，不能利用乳糖和山梨醇，柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、明胶水解、接触酶试验反应都为阳性；酪氨酸分解、丙酸盐利用反应都为阴性。

3.一种用于培养如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于，包括以下成分：180～220g/L的马铃薯、10～50g/L的葡萄糖、1～5g/L的氯化铵、0.1～0.5g/L的硫酸锰、0.1～0.5g/L的硫酸镁。

4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，包括以下组分：200g/L的马铃薯、50g/L的葡萄糖，2g/L的氯化铵、0.2g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸锰。

5.一种枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂采用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌QNJK01进行发酵培养制备得到。

6.一种如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵种子培养液制备：调节发酵培养基初始pH值为5，装瓶量为20％，按1％接种量接种1×10⁸CFU/mL枯草芽孢杆菌悬浮液，在28℃培养条件下振荡培养16～18h，得到枯草芽孢杆菌种子液；

(2)将发酵培养基加入发酵罐中，装料系数为50～80％，121℃灭菌20～40min；再按1％～9％的接种量接入上一步制备得到的枯草芽孢杆菌种子液，200～300r/min，20℃～40℃条件下发酵，加入消泡剂控制消泡，发酵过程中通气量(V/V·min)为1:1～1:2，控制pH为5，发酵30～40h，得到发酵液；

(3)用无菌水将发酵液调整到1×10⁹CFU/mL，即得枯草芽孢杆菌的液体菌剂；将所述液体菌剂按1:1的体积质量比加入灭菌的麸皮吸附，待麸皮干燥后即得枯草芽孢杆菌固体菌剂。

7.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述植物病害包括花生病害、棉花病害、番茄病害、黄瓜、茄子病害和瓜类病害。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，花生病害包括花生冠腐病、花生立枯病、花生根腐病、花生白绢病和花生根结线虫病。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌的固体菌剂的使用方法为：在植物播种时，施用枯草芽孢杆菌的固体菌剂，施用剂量为5kg/亩～7kg/亩。

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