CN107603945A - 一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，包括以下组分：透明质酸、胰岛素、地塞米松、氨基酸、L‑氨酰胺、维生素、人干细胞因子、表皮生长因子。其具有配方温和、脂肪干细胞活性和存活率高的特点。

Description

一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术及细胞工程技术领域，尤其涉及一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的细胞。人脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从人体脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。然而，脂肪干细胞十分脆弱，将其制成制剂很难保证存活率，而如果制剂中脂肪干细胞的存活率不足则不能发挥很好的作用。因此，进一步提高脂肪干细胞在制剂中的存活率和活性，保证移植的干细胞在体内存活十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其具有配方温和、脂肪干细胞活性和存活率高的特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，包括以下组分：透明质酸、胰岛素、地塞米松、氨基酸、L-氨酰胺、维生素、人干细胞因子、表皮生长因子。

透明质酸是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。

胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，可促进糖原、脂肪、蛋白质合成，能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。

地塞米松是肾上腺皮质激素类药物，在细胞培养过程中起到生长因子的作用，促进细胞的增殖分化。

氨基酸是细胞合成蛋白质的必须原料，对干细胞的生长起促进作用，，一般包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸和半胱氨酸等。

L-氨酰胺为机体提供必需的氮源，促使肌细胞内蛋白质合成；通过细胞增容作用，促进肌细胞的生长和分化。

维生素是维持细胞新陈代谢的一种生物活性物质，形成辅基或辅酶。

人干细胞因子是一种广泛表达的Ⅰ型跨膜糖蛋白，可促进干细胞成活、加速增殖。

表皮生长因子对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。

本发明的有益效果在于：脂肪干细胞在透明质酸的保护下获得较好的基质环境，地塞米松、人干细胞因子和表皮生长因子的刺激下快速分裂增长，氨基酸、L-氨酰胺和维生素提供了脂肪干细胞生长需要的养分，胰岛素促进脂肪干细胞利用培养物中的营养物质，使脂肪干细胞快速、健康生长，并保持良好的活性；本发明的提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物配方温和，对脂肪干细胞的增殖起到很好的促进作用，脂肪干细胞在本发明的培养物中存放72h后，存活率达95以上，脂肪干细胞的存活率高，且活性佳。

优选的，上述组分的浓度分别为：透明质酸0.1-15μg /ml、氨基酸0.5-3.5 μg /ml、胰岛素0.01-16μg/ml、L-氨酰胺4-10μg /ml、维生素2-20μg /ml、地塞米松0.01-6μg/ml、人干细胞因子0.01-0.5μg/ml、表皮生长因子0.01-0.1μg/ml，此配方下的脂肪干细胞增殖存活率最高，活性也相较高。

优选的，透明质酸的分子量为400000-1000000。按照分子量的大小，透明质酸可分为：大分子量透明质酸、中分子量透明质酸、小分子量透明质酸三类。其中：大分子量透明质酸的分子量为1800000-2200000，主要用于防止脱水，组织细胞再生，紧致肌肤；中分子量透明质酸的分子量为1000000～1800000，主要用于紧致肌肤,长久保湿；小分子量透明质酸的分子量为400000～1000000，主要用于快速与细胞发生水合作用，保持细胞的水分。在脂肪干细胞培养物中添加透明质酸可以为脂肪干细胞提供合适的基质环境，维持脂肪干细胞的存活率。

优选的，维生素包括脂溶性维生素和水溶性维生素。

优选的，脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E 和维生素K。

优选的，水溶性维生素一般包括叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素和硫胺素。

具体实施方式

实施例1

本实施例的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，按重量份计，配方包括以下组分：透明质酸0.1μg /ml、氨基酸0.5μg /ml、胰岛素0.01μg/ml、L-氨酰胺4μg /ml、维生素2μg /ml、地塞米松0.01μg/ml、人干细胞因子0.01μg/ml、表皮生长因子0.01μg/ml。

实施例2

本实施例的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，按重量份计，配方包括以下组分：透明质酸1μg/ml、氨基酸1.5μg/ml、胰岛素0.5μg/ml、L-氨酰胺6μg /ml、维生素8μg /ml、地塞米松0.6μg/ml、人干细胞因子0.05μg/ml、表皮生长因子0.03μg/ml。

实施例3

本实施例的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，按重量份计，配方包括以下组分：透明质酸5μg /ml、氨基酸2μg /ml、胰岛素5μg/ml、L-氨酰胺7μg /ml、维生素10μg /ml、地塞米松2.2μg/ml、人干细胞因子0.1μg/ml、表皮生长因子0.05μg/ml。

实施例4

本实施例的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，按重量份计，配方包括以下组分：透明质酸10μg /ml、氨基酸3μg/ml、胰岛素8μg/ml、L-氨酰胺8μg /ml、维生素15μg /ml、地塞米松3μg/ml、人干细胞因子0.25μg/ml、表皮生长因子0.08μg/ml。

实施例5

本实施例的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，按重量份计，配方包括以下组分：透明质酸15μg /ml、氨基酸3.5μg /ml、胰岛素16μg/ml、L-氨酰胺10μg/ml、维生素20μg /ml、地塞米松6μg/ml、人干细胞因子0.5μg/ml、表皮生长因子0.1μg/ml。

脂肪干细胞的制备

1）分离

采集脂肪组织100ml，用pH值为7.0的5％葡萄糖盐水进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；将脂肪组织破碎成体积为0.5-1.0mm³的组织块，用pH值为7.0的5％葡萄糖盐水清洗若干次至洗出液清亮，获得92ml脂肪组织；加入92ml的0.5-0.7％( m/v )混合胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化55分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，离心机的转速1800转/分钟，离心时间为15分钟，沉淀即为脂肪干细胞群；将脂肪干细胞群重悬浮，获得脂肪干细胞群的重悬液。

2）培养

获得的脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入培养液，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，对脂肪干细胞进行传代处理，获得1-3代的脂肪干细胞。

培养液分别采用实施例1至实施例5的配方。

对获得1-3代的脂肪干细胞进行观察，采用实施例1至实施例5配方的脂肪干细胞存活率如表1。

对以上实施例中的细胞进行观察，细胞大小均匀、呈梭型，，在台盼蓝检测下，细胞均拒染( 死细胞被染成蓝色，活细胞拒染) ；说明了脂肪干细胞没有出现死亡，活力好。

由以上实验结果可知，在本发明一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物中，脂肪干细胞的活性好，存活率达95%以上，且本发明的培养物采用人体所需的营养组分或自人体内提取的生长因子，对人体作用温和，无副作用。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其特征在于：包括以下组分：透明质酸、胰岛素、地塞米松、氨基酸、L-氨酰胺、维生素、人干细胞因子、表皮生长因子。

2.根据权利要求1所述的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其特征在于：所述组分的浓度分别为：透明质酸0.1-15μg /ml、氨基酸0.5-3.5μg /ml、胰岛素0.01-16μg/ml、L-氨酰胺4-10μg /ml、维生素2-20μg /ml、地塞米松0.01-6μg/ml、人干细胞因子0.01-0.5μg/ml、表皮生长因子0.01-0.1μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其特征在于：所述透明质酸的分子量为400 000～1 000 000。

4.根据权利要求1或2所述的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其特征在于：所述维生素包括脂溶性维生素和水溶性维生素。

5.根据权利要求4所述的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其特征在于：所述脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E 和维生素K。

6.根据权利要求4所述的一种提高自体脂肪干细胞增殖的新型培养物，其特征在于：所述水溶性维生素一般包括叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素和硫胺素。