CN106701665A - 人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及其应用 - Google Patents

人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，包括如下步骤：将人胎盘亚全能干细胞接种于含有干细胞培养液的24孔板中，待细胞贴壁后，将干细胞培养液去除，再加入心肌细胞培养液，培养28天，每3天换液。干细胞培养液包括：DMEM培养基、羟乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氢钾、二乙胺四乙酸钠盐、亚硒酸钠、转铁蛋白、透明质酸、牛磺酸、胎盘生长因子、成纤维细胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黄芪多糖、党参多糖、大枣多糖。心肌细胞培养液包括：RPMI‑1640培养基，海藻糖，牛磺酸，成纤维生长因子，内皮细胞生长因子，碳酸氢钾，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黄体酮，辅酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黄精多糖，人参皂苷。

Description

人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及其应用。
背景技术
由心肌细胞功能障碍引起的心脏衰竭是世界范围内的一种主要的疾病，心衰患者最终死亡的原因主要是心脏泵血功能丧失或心律不齐。严重的心衰患者一年期死亡率超过50％。虽然晚期患者可以进行心脏移植，然而由于供体器官缺乏，约有20％的病人在等待器官移植的过程中死亡。由于心力衰竭的高发病率和死亡率、移植心脏的死亡、免疫排斥反应等并发症以及移植心脏后期失效等客观现状，亟待发展新的治疗方法以提高心肌细胞的功能，阻止心力衰竭的发生。目前对心力衰竭的治疗方法主要集中于早期血管再生和抑制进一步的心肌细胞损失，而心肌细胞是一种终端分化的细胞，增殖能力极其有限，损失后极难恢复。而心肌细胞移植疗法着重于重建心肌功能，恢复再生心肌组织的泵血能力，也有研究发现注入心脏的心肌细胞能够形成新的心肌组织。但细胞移植治疗关键因素是确定合适的供体细胞类型。因此，如何诱导干细胞定向分化为心肌细胞以用于医药治疗是亟待解决的技术难题。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的是人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及其应用。
本发明提出的一种人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，包括如下步骤：将人胎盘亚全能干细胞以5000细胞/孔接种于含有干细胞培养液的24孔板中，待细胞贴壁后，将干细胞培养液去除，再加入心肌细胞培养液，培养28天，每3天换液。
优选地，干细胞培养液包括：DMEM培养基、羟乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氢钾、二乙胺四乙酸钠盐、亚硒酸钠、转铁蛋白、透明质酸、牛磺酸、胎盘生长因子、成纤维细胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黄芪多糖、党参多糖、大枣多糖。
优选地，干细胞培养液中，羟乙基淀粉的浓度为3～3.5g/L，人血清白蛋白的浓度为1.8～2.3g/L，碳酸氢钾的浓度为0.5～0.6g/L，二乙胺四乙酸钠盐的浓度为0.3～0.6μg/L，亚硒酸钠的浓度为0.2～0.5μg/L，转铁蛋白的浓度为50～100mg/L，透明质酸的浓度为2～5μg/L，牛磺酸的浓度为5～8μg/L，胎盘生长因子的浓度为10～20μg/L，成纤维细胞因子的浓度为10～20μg/L，谷胱甘肽的浓度为50～80mg/L，硫辛酸的浓度为15～25mg/L，黄芪多糖的浓度为20～40mg/L，党参多糖的浓度为30～60mg/L，大枣多糖的浓度为40～80mg/L。
优选地，心肌细胞培养液包括：RPMI-1640培养基，海藻糖，牛磺酸，成纤维生长因子，内皮细胞生长因子，碳酸氢钾，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黄体酮，辅酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黄精多糖，人参皂苷。
优选地，心肌细胞培养液中，海藻糖的浓度为2.5～3.5g/L，牛磺酸的浓度为1～1.2g/L，成纤维生长因子的浓度为25～40mg/L，内皮细胞生长因子的浓度为20～30μg/L，碳酸氢钾的浓度为0.8～1.3g/L，氨基酸螯合硒的浓度为1～2μg/L，谷氨酰胺的浓度为50～80mg/L，黄体酮的浓度为10～20mg/L，辅酶I的浓度为60～120μg/L，硫辛酸的浓度为15～25mg/L，维生素的浓度为50～100mg/L，丹酚酸B的浓度为20～40mg/L，黄精多糖的浓度为15～30mg/L，人参皂苷的浓度为30～50mg/L。
本发明还提出的一种心肌细胞，采用上述人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法制得。
本发明还提出的上述心肌细胞用于制备预防或治疗心肌细胞功能障碍疾病的药物组合物。
本发明能够将人胎盘亚全能干细胞诱导转分化为心肌细胞，所得心肌细胞具有正常心肌细胞特异性分子标签，并且具有正常心肌的功能，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，包括如下步骤：将人胎盘亚全能干细胞以5000细胞/孔接种于含有干细胞培养液的24孔板中，待细胞贴壁后，将干细胞培养液去除，再加入心肌细胞培养液，培养28天，每3天换液。
干细胞培养液包括：DMEM培养基、羟乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氢钾、二乙胺四乙酸钠盐、亚硒酸钠、转铁蛋白、透明质酸、牛磺酸、胎盘生长因子、成纤维细胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黄芪多糖、党参多糖、大枣多糖。其中羟乙基淀粉的浓度为3.2g/L，人血清白蛋白的浓度为2/L，碳酸氢钾的浓度为0.55g/L，二乙胺四乙酸钠盐的浓度为0.4μg/L，亚硒酸钠的浓度为0.4μg/L，转铁蛋白的浓度为70mg/L，透明质酸的浓度为3.5μg/L，牛磺酸的浓度为7μg/L，胎盘生长因子的浓度为15μg/L，成纤维细胞因子的浓度为15μg/L，谷胱甘肽的浓度为65mg/L，硫辛酸的浓度为20mg/L，黄芪多糖的浓度为30mg/L，党参多糖的浓度为50mg/L，大枣多糖的浓度为60mg/L。
心肌细胞培养液包括：RPMI-1640培养基，海藻糖，牛磺酸，成纤维生长因子，内皮细胞生长因子，碳酸氢钾，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黄体酮，辅酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黄精多糖，人参皂苷。其中海藻糖的浓度为3g/L，牛磺酸的浓度为1.1g/L，成纤维生长因子的浓度为32mg/L，内皮细胞生长因子的浓度为25μg/L，碳酸氢钾的浓度为1g/L，氨基酸螯合硒的浓度为1.5μg/L，谷氨酰胺的浓度为70mg/L，黄体酮的浓度为15mg/L，辅酶I的浓度为90μg/L，硫辛酸的浓度为20mg/L，维生素的浓度为75mg/L，丹酚酸B的浓度为30mg/L，黄精多糖的浓度为20mg/L，人参皂苷的浓度为40mg/L。
实施例2
本发明提出的一种人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，包括如下步骤：将人胎盘亚全能干细胞以5000细胞/孔接种于含有干细胞培养液的24孔板中，待细胞贴壁后，将干细胞培养液去除，再加入心肌细胞培养液，培养28天，每3天换液。
干细胞培养液包括：DMEM培养基、羟乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氢钾、二乙胺四乙酸钠盐、亚硒酸钠、转铁蛋白、透明质酸、牛磺酸、胎盘生长因子、成纤维细胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黄芪多糖、党参多糖、大枣多糖。其中羟乙基淀粉的浓度为3g/L，人血清白蛋白的浓度为2.3g/L，碳酸氢钾的浓度为0.5g/L，二乙胺四乙酸钠盐的浓度为0.6μg/L，亚硒酸钠的浓度为0.2μg/L，转铁蛋白的浓度为100mg/L，透明质酸的浓度为2μg/L，牛磺酸的浓度为8μg/L，胎盘生长因子的浓度为10μg/L，成纤维细胞因子的浓度为20μg/L，谷胱甘肽的浓度为50mg/L，硫辛酸的浓度为25mg/L，黄芪多糖的浓度为20mg/L，党参多糖的浓度为60mg/L，大枣多糖的浓度为40mg/L。
心肌细胞培养液包括：RPMI-1640培养基，海藻糖，牛磺酸，成纤维生长因子，内皮细胞生长因子，碳酸氢钾，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黄体酮，辅酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黄精多糖，人参皂苷。其中海藻糖的浓度为3.5g/L，牛磺酸的浓度为1g/L，成纤维生长因子的浓度为40mg/L，内皮细胞生长因子的浓度为20μg/L，碳酸氢钾的浓度为1.3g/L，氨基酸螯合硒的浓度为1μg/L，谷氨酰胺的浓度为80mg/L，黄体酮的浓度为10mg/L，辅酶I的浓度为120μg/L，硫辛酸的浓度为15mg/L，维生素的浓度为100mg/L，丹酚酸B的浓度为20mg/L，黄精多糖的浓度为30mg/L，人参皂苷的浓度为30mg/L。
实施例3
本发明提出的一种人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，包括如下步骤：将人胎盘亚全能干细胞以5000细胞/孔接种于含有干细胞培养液的24孔板中，待细胞贴壁后，将干细胞培养液去除，再加入心肌细胞培养液，培养28天，每3天换液。
干细胞培养液包括：DMEM培养基、羟乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氢钾、二乙胺四乙酸钠盐、亚硒酸钠、转铁蛋白、透明质酸、牛磺酸、胎盘生长因子、成纤维细胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黄芪多糖、党参多糖、大枣多糖。其中羟乙基淀粉的浓度为3.5g/L，人血清白蛋白的浓度为1.8g/L，碳酸氢钾的浓度为0.6g/L，二乙胺四乙酸钠盐的浓度为0.3μg/L，亚硒酸钠的浓度为0.5μg/L，转铁蛋白的浓度为50mg/L，透明质酸的浓度为5μg/L，牛磺酸的浓度为5μg/L，胎盘生长因子的浓度为20μg/L，成纤维细胞因子的浓度为10μg/L，谷胱甘肽的浓度为80mg/L，硫辛酸的浓度为15mg/L，黄芪多糖的浓度为40mg/L，党参多糖的浓度为30mg/L，大枣多糖的浓度为80mg/L。
心肌细胞培养液包括：RPMI-1640培养基，海藻糖，牛磺酸，成纤维生长因子，内皮细胞生长因子，碳酸氢钾，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黄体酮，辅酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黄精多糖，人参皂苷。其中海藻糖的浓度为2.5g/L，牛磺酸的浓度为1.2g/L，成纤维生长因子的浓度为25mg/L，内皮细胞生长因子的浓度为30μg/L，碳酸氢钾的浓度为0.8g/L，氨基酸螯合硒的浓度为2μg/L，谷氨酰胺的浓度为50mg/L，黄体酮的浓度为20mg/L，辅酶I的浓度为60μg/L，硫辛酸的浓度为25mg/L，维生素的浓度为50mg/L，丹酚酸B的浓度为40mg/L，黄精多糖的浓度为15mg/L，人参皂苷的浓度为50mg/L。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：将人胎盘亚全能干细胞以5000细胞/孔接种于含有干细胞培养液的24孔板中，待细胞贴壁后，将干细胞培养液去除，再加入心肌细胞培养液，培养28天，每3天换液。
2.根据权利要求1所述人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，干细胞培养液包括：DMEM培养基、羟乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氢钾、二乙胺四乙酸钠盐、亚硒酸钠、转铁蛋白、透明质酸、牛磺酸、胎盘生长因子、成纤维细胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黄芪多糖、党参多糖、大枣多糖。
3.根据权利要求1或2所述人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，干细胞培养液中，羟乙基淀粉的浓度为3～3.5g/L，人血清白蛋白的浓度为1.8～2.3g/L，碳酸氢钾的浓度为0.5～0.6g/L，二乙胺四乙酸钠盐的浓度为0.3～0.6μg/L，亚硒酸钠的浓度为0.2～0.5μg/L，转铁蛋白的浓度为50～100mg/L，透明质酸的浓度为2～5μg/L，牛磺酸的浓度为5～8μg/L，胎盘生长因子的浓度为10～20μg/L，成纤维细胞因子的浓度为10～20μg/L，谷胱甘肽的浓度为50～80mg/L，硫辛酸的浓度为15～25mg/L，黄芪多糖的浓度为20～40mg/L，党参多糖的浓度为30～60mg/L，大枣多糖的浓度为40～80mg/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，心肌细胞培养液包括：RPMI-1640培养基，海藻糖，牛磺酸，成纤维生长因子，内皮细胞生长因子，碳酸氢钾，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黄体酮，辅酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黄精多糖，人参皂苷。
5.根据权利要求1-4任一项所述人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，心肌细胞培养液中，海藻糖的浓度为2.5～3.5g/L，牛磺酸的浓度为1～1.2g/L，成纤维生长因子的浓度为25～40mg/L，内皮细胞生长因子的浓度为20～30μg/L，碳酸氢钾的浓度为0.8～1.3g/L，氨基酸螯合硒的浓度为1～2μg/L，谷氨酰胺的浓度为50～80mg/L，黄体酮的浓度为10～20mg/L，辅酶I的浓度为60～120μg/L，硫辛酸的浓度为15～25mg/L，维生素的浓度为50～100mg/L，丹酚酸B的浓度为20～40mg/L，黄精多糖的浓度为15～30mg/L，人参皂苷的浓度为30～50mg/L。
6.一种心肌细胞，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述人胎盘亚全能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法制得。
7.一种如权利要求6所述心肌细胞用于制备预防或治疗心肌细胞功能障碍疾病的药物组合物。
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