CN108201538A - 褪黑素在促进心肌干细胞移植治疗心肌梗死中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了褪黑素在促进心肌干细胞移植治疗心肌梗死中的应用。本发明通过离体培养心肌干细胞(CPCs)，采用不同浓度的褪黑素预处理CPCs 2h，随后加入150μM H2O2模拟细胞氧化应激损失，24h后，应用EdU染色检测褪黑素对CPCs细胞增殖的影响，应用Tunel实验检测细胞凋亡。此外，通过离体培养CPCs，采用10μM褪黑素处理后将CPCs注入心肌梗死小鼠心脏中，采用B型超声多普勒仪检测小鼠心脏功能。结果发现，褪黑素可有效抵抗CPCs的氧化应激状损伤，增加损伤CPCs的细胞增殖能力，抑制凋亡，同时褪黑素具有促进心肌干细胞移植对心肌梗死的治疗作用。本发明的提出在一定程度上增加了心肌梗死患者治疗效果，降低了病死率，为心肌梗死的治疗提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种褪黑素的新的治疗用途，特别涉及褪黑素在促进心肌干细胞移植治疗心肌梗死中的应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
心肌梗死是由冠状动脉粥样硬化形成的冠状动脉血栓或分支阻塞，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死，可并发心律失常、心力衰竭或休克，危及生命。成年人心肌细胞缺乏再生修复能力，一旦坏死，梗死区心肌细胞形成瘢痕组织，导致心功能难以恢复，可最终导致死亡。目前，心肌梗死的治疗方法主要包括药物治疗、外科手术治疗和介入治疗。这些方法虽然可以解除血管阻塞，缓解心室重构，改善心功能的恶化及心律失常的发生，但无法逆转心肌坏死，使已梗死的心肌细胞再生。心脏移植是包括心肌梗死在内的多种严重心脏病的治疗方法之一，但由于供体来源缺乏、移植排斥、移植组织功能衰竭及费用高昂等原因，临床难以广泛应用。对于心肌梗死的治疗，以上治疗方法在改善心肌供血和心功能方面仍然存在难题。
干细胞是具有自我复制功能的多潜能细胞，自我更新能力很强，成为细胞和器官移植领域最具潜在优势的资源。大量动物实验已证实，移植心肌前体细胞-又称为心肌干细胞能够分化为心肌细胞，并且分泌大量抗凋亡和促血管新生的细胞因子。心肌干细胞移植为治疗心肌梗死提供了新的途径和方法，成为国内外治疗心肌梗死的研究热点。
褪黑素(melatonin,简称Mel)是一种主要由松果体细胞分泌的吲哚类神经内分泌激素，褪黑激素的分子式为C13N2H16O2，分子量232.27，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)。褪黑素广泛存在于机体的各个器官内，是一种具有多功能的激素，其生理作用包括促进睡眠、抗衰老、免疫调节、神经保护、抗肿瘤、对其他内分泌的调节、促进细胞生长等多种功能。近年来相关研究表明，褪黑素在高血压、肺动脉高压、心肌缺血/再灌注损伤(MI/R)、血管疾病、心肌慢性间歇性低氧损伤以及心脏瓣膜疾病等多种心血管疾病中起着重要作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供褪黑素在促进心肌干细胞增殖、抑制心肌干细胞凋亡中的应用；
本发明的目的之二是提供褪黑素在促进心肌干细胞移植治疗心肌梗死中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过离体培养心肌干细胞(CPCs)，采用不同浓度的褪黑素预处理CPCs2h，随后加入150μM H2O2模拟细胞氧化应激损失，褪黑素浓度分别为0nM,10nM,100nM,1μM,10μM,100μM。24h后，应用EdU染色检测褪黑素对CPCs细胞增殖的影响，应用Tunel实验检测细胞凋亡。此外，采用10μM褪黑素膜受体阻断剂luzindole与10μM褪黑素作用于150μM H2O2处理的CPCs，同样采用EdU染色检测CPCs细胞增殖能力，应用Tunel实验检测CPCs细胞凋亡。通过离体培养CPCs，采用10μM褪黑素处理后将CPCs注入心肌梗死小鼠心脏中，采用B型超声多普勒仪检测小鼠心脏功能，检测左室末内径(left ventricular internal diastolicdiameter,LVIDd)，左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension at end-systole,LVIDs)，左室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume,LV vold)，左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LV vol s)，心脏射血分数(ejection fraction,EF)以及左室短轴缩短分数(fractional shortening,FS)反应小鼠心功变化。结果发现，褪黑素可有效抵抗CPCs的氧化应激状损伤，增加损伤CPCs的细胞增殖能力，抑制凋亡，同时褪黑素具有促进心肌干细胞移植对心肌梗死的治疗作用。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了褪黑素在制备促进心肌干细胞增殖、抑制心肌干细胞凋亡的药物中的应用。
其中，优选的，所述的心肌干细胞为氧化应激状态下的心肌干细胞。
进一步的，本发明还提出了褪黑素在制备促进心肌干细胞移植治疗心肌梗死药物中的应用。相较于直接通过心肌干细胞移植治疗心肌梗死，采用褪黑素处理后的心肌干细胞通过移植治疗心肌梗死具有提高心脏舒缩功能，心脏射血分数和左室短轴缩短分数的作用。
综上，本发明探究了褪黑素对处于氧化应激状态下心肌干细胞增殖、凋亡的影响以及褪黑素对于心肌干细胞移植在心肌梗死治疗中的增加心肌干细胞的心脏保护作用，有利于心肌梗死的治疗。本发明的提出在一定程度上增加了心肌梗死患者治疗效果，降低病死率，为心肌梗死的治疗提供了新的技术手段。
附图说明
图1为褪黑素对处于氧化应激状态下CPCs增殖与凋亡的影响；
图1A为EDU染色荧光显微镜下拍照及EDU阳性细胞率；图1B为Tunel染色荧光显微镜下拍照及Tunel阳性细胞率；
图2为褪黑素对心肌干细胞移植治疗小鼠心肌梗死的影响；
图2A为小鼠心脏超声图；图2B为左室末内径(LVIDd)，左室收缩末期内径(LVIDs)，左室舒张末期容积(LV vol d)，左室收缩末期容积(LV vol s)统计图；图2C为心脏射血分数(EF)统计图；图2D为左室短轴缩短分数(FS)统计图；
图3为褪黑素受体拮抗剂luzindole抵抗褪黑素的心肌保护作用。
图3A为EDU染色荧光显微镜下拍照及EDU阳性细胞率；图3B为Tunel染色荧光显微镜下拍照及Tunel阳性细胞率。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例所涉及的材料及其来源：
1.主要试剂：
褪黑素(Sigama公司)；luzindole(Sigama公司)；EdU染色试剂盒(Ribobio公司)；Tunel染色试剂盒(Roche)
2.主要仪器：
荧光倒置显微镜；B型超声多普勒仪(VisualSonics公司)
实施例1：褪黑素促进氧化应激损伤的CPCs细胞增殖，抑制凋亡
1实验方法
1.1 EdU染色检测细胞增殖，Tunel染色检测细胞凋亡
通过离体培养心肌干细胞(CPCs)，采用不同浓度的褪黑素预处理CPCs，2h后加入150μM H2O2使细胞处于氧化应激诱导损伤状态下，按照是否给予H2O2以及褪黑素浓度的不同实验分为7组：对照组(CTL)，H2O2，H2O2+Mel(10nM)，H2O2+Mel(100nM)，H2O2+Mel(1μM)，H2O2+Mel(10μM)，H2O2+Mel(100μM)。处理24h后，应用EdU染色检测褪黑素对CPCs细胞增殖的作用。
1.2实验分组设计
按照是否给予H2O2以及褪黑素浓度的不同实验分为7组：对照组(CTL)，H2O2，H2O2+Mel(10nM),H2O2+Mel(100nM),H2O2+Mel(1μM),H2O2+Mel(10μM),H2O2+Mel(100μM)。
1.3实验检测项目：EdU染色、Tunel染色
2数据处理
本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用Graphpad prism 5.0进行作图，各组之间的相关性用T检验来衡量。
3观察结果
如图1所示，EdU染色结果显示(图1A)，随着褪黑素浓度的增加，细胞增殖能力逐渐增加，当给药剂量为100μM时，细胞增殖能力与对照组相当。说明褪黑素促进氧化应激CPCs细胞增殖。此外，Tunel染色结果显示(图1B)，随着给药浓度的增加，细胞凋亡逐渐减弱，当给药剂量为100μM时，细胞凋亡水平与对照组相当。说明褪黑素抑制氧化应激CPCs细胞凋亡。
实施例2：褪黑素促进心肌干细胞移植对小鼠心肌梗死的治疗作用
1实验方法
1.1B型超声多普勒仪检测小鼠心脏功能
通过离体培养CPCs，采用10μM褪黑素处理CPCs 2h，将处理后的CPCs或未处理的CPCs分别以点注射形式注入心肌梗死小鼠心脏梗死组织周围，4周后，采用B型超声多普勒仪检测小鼠心脏功能，检测左室末内径(left ventricular internal diastolicdiameter,LVIDd)，左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension at end-systole,LVIDs)，左室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume,LV vold)，左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LV vol s)，心脏射血分数(ejection fraction,EF)以及左室短轴缩短分数(fractional shortening,FS)，通过以上数据反应小鼠心功的变化。
1.2实验分组设计：
实验分组为假手术组(sham)，心肌梗死组(MI)，移植心肌干细胞的心肌梗死组[MI(cell)]，移植褪黑素处理后的心肌干细胞的心肌梗死组[MI(cell+Mel)]。
1.3实验检测项目：小鼠心脏超声
2数据处理
本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用Graphpad prism 5.0进行作图，各组之间的相关性用T检验来衡量。
3观察结果
如图2A、2C以及2D所示，MI组心脏舒缩功能明显减弱，心脏射血分数和左室短轴缩短分数明显降低；[MI(cell)]组心脏功能有所恢复，EF和FS也有所增加；[MI(cell+Mel)]组进一步增加心脏舒缩功能，EF和FS进一步增加，几乎接近于正常组。如图2B所示，检测的LVIDd，LVIDs，LV vol d和LV vol s同样证明了心脏功能的变化。
实施例3：褪黑素保护CPCs的作用依赖于褪黑素膜受体
1实验方法
1.1EdU染色检测CPCs细胞增殖能力，Tunel染色检测CPCs细胞凋亡水平
离体培养CPCs细胞，根据处理方式不同实验分组为氧化应激组(H2O2),褪黑素处理的氧化应激组(H2O2+Mel),褪黑素与luzindole共同处理的氧化应激组(H2O2+Mel+L)。氧化应激组(H2O2)向培养的CPCs细胞中加入150μM H2O2，褪黑素处理的氧化应激组(H2O2+Mel)向培养的CPCs细胞中加入150μM H2O2和10μM褪黑素，褪黑素与luzindole共同处理的氧化应激组(H2O2+Mel+L)向培养的CPCs细胞中加入10μM褪黑素膜受体luzindole(L)处理CPCs，随后共同加入150μM H2O2和10μM褪黑素。处理24h后，采用EdU染色以及Tunel染色检测CPCs细胞增殖能力。
1.2实验分组设计：
根据处理方式不同实验分组为氧化应激组(H2O2)，褪黑素处理的氧化应激组(H2O2+Mel)，褪黑素与luzindole共同处理的氧化应激组(H2O2+Mel+L)。
1.3实验检测项目：EdU染色实验、Tunel染色实验
2.数据处理
本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用Graphpad prism 5.0进行作图，各组之间的相关性用T检验来衡量。
3观察结果
如图3A所示，luzindole抵抗了褪黑素的心肌保护作用，降低CPCs细胞增殖。应用Tunel实验检测CPCs细胞凋亡，如图3B所示，luzindole解除了褪黑素抑制CPCs氧化应激诱导的细胞凋亡。
Claims (4)
1.褪黑素在制备促进心肌干细胞增殖、抑制心肌干细胞凋亡的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的心肌干细胞为氧化应激状态下的心肌干细胞。
3.褪黑素在制备促进心肌干细胞移植治疗心肌梗死药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，相较于直接通过心肌干细胞移植治疗心肌梗死，采用褪黑素处理后的心肌干细胞通过移植治疗心肌梗死具有提高心脏舒缩功能，心脏射血分数和左室短轴缩短分数的作用。
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