JP7070965B2 - 心筋細胞製剤及びその製造方法、並びに応用 - Google Patents
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Description
ACC/AHAは、心不全をA、B、C、及びDの4つの段階に分けられ、段階A及びBとは、患者は心不全の初期症状がないが、危険因子または心臓異常があることを指し、これらの異常は、心臓の形態および構造の改変を含み、段階Cとは、患者が現在または以前に心不全の症状、例えば、息切れなどがあり、段階Dとは、末期心不全または難治性心不全と呼ばれる重度の心不全の段階を指す。
現在、心不全(heart failure)の治療法は、主に、化学的医薬品により神経内分泌系の活動を低下させ、AT1Rの過剰興奮によって引き起こされる悪影響を遮断または改善するか、又は心不全時の水分及びナトリウム貯留を排除することにより心不全の治療の役割を果たすが、臨床的実践では、これらの化学的医薬品は、心不全の治療においていずれも、例えば、低血圧や腎機能の低下などさまざまな副作用があることを示す。
幹細胞技術の発展に伴い、この分野の学者は、幹細胞移植によるさまざまな心疾患に起因する末期心不全の治療方法の研究に取り組んでいるが、心臓機能を改善する効果は明らかではなく、フォローアップの安全性研究では、体内への注射後の幹細胞は腫瘍形成能があり、臨床的研究や治療には適さない。
前記心筋細胞は、多能性幹細胞から直接分化した心筋細胞であってもよく、凍結保存によって蘇生された心筋細胞であってもよくい。
本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤中の心筋細胞の濃度は、0.75×107~1.0×109cells/mLに限定され、該濃度は、心筋細胞製剤中での細胞生存率を高めるだけでなく、前記心筋細胞製剤が心不全患者の駆出率及び左室内径短縮率を効果的に向上させ、心室壁の厚さを増加させ、心不全患者の心機能を改善することができる。また、本発明者らは、大量の実験を通じて、心筋細胞製剤に一定量の線維芽細胞を含ませることで心不全患者の心機能を改善するのに役立ち、心筋細胞製剤中の線維芽細胞の含有量が20%未満である場合には、前記心筋細胞製剤は、心臓の駆出率を効果的に向上させることができ、線維芽細胞の含有量が20%より高くなる場合には、駆出率の改善は明らかではなく、線維芽細胞の含有量が増加するにつれて減少することを発見した。
好ましくは、前記心筋細胞製剤において、前記心筋細胞の濃度は、0.5×108~1.2×108cells/mLである。心筋細胞製剤中の心筋細胞濃度はこの範囲にある場合には、前記心筋細胞製剤は、心不全患者の心機能を改善するより良い作用を有する。
好ましくは、前記心筋細胞製剤において、多能性幹細胞の残存量は1%以下であり、具体的には、前記心筋細胞製剤においてNanog、SSea4及びOct3/4が陽性に発現する細胞の含有量は、1%以下である。
さらに好ましくは、前記心筋細胞製剤において、多能性幹細胞の残存量は0.3%以下であり、具体的には、前記心筋細胞製剤においてNanog、SSea4、Oct3/Oct4が陽性に発現する細胞の含有量は、0.3%以下である。
他の一態様、本発明の実施例は、多能性幹細胞から以下の手順で調製される前記心筋細胞製剤の製造方法を提供する。
多能性幹細胞の前処理:前記多能性幹細胞を0.9×105~3.0×105cells/cm2で多能性幹細胞培養用培地に播種し、5% CO2、37℃条件下で密度が40%以上を超えるまで培養すること;
心筋細胞の分化:前記多能性幹細胞培養用培地を吸引除去し、濃度が0.01~0.09 mMのCHIR99021を含む心筋細胞分化誘導用培地を加えて48時間培養し、その培地を濃度が0.01~0.05mMのIWR-1を含む心筋細胞分化誘導用培地に交換し、48時間培養し続け、さらに、心筋細胞分化誘導用培地で培養し続け、細胞増殖状態に応じて心筋細胞分化誘導用培地を交換すること;
好ましくは、前記心筋細胞製剤の製造方法において、前記多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む。
さらに好ましくは、前記心筋細胞製剤の製造方法において、前記心筋細胞の精製は、さらに、濃度が0.75~5μMのSTF-31を含む心筋細胞培地で細胞を2~5日間培養することを含む。STF-31は、心筋細胞の分化での未分化の多能性幹細胞を除去し、心筋細胞の純度を向上させることができ、STF-31の濃度又は精製時間を変えることにより細胞中の多能性幹細胞の含有量を制御することができる。
多能性幹細胞から調製された心筋細胞は、それぞれ心筋細胞、多能性幹細胞及び線維芽細胞の含有量が検出された後、心筋細胞の濃度を制御するために必要に応じて生理食塩水の添加量を選択する。
他の一態様、本発明の実施例は、さらに、心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用を提供する。
さらに好ましくは、前記心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用において、前記心筋細胞製剤が注射器により外科心外膜を通して瘢痕領域または心筋壁の菲薄化した領域に注射される。
本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤は、以下の有益な効果を有する。即ち、本発明の実施例で提供される濃度範囲内の心筋細胞製剤は、心不全患者の心臓駆出率の低減を効果的に緩和し、左室内径短縮率を向上させ、心室壁の厚さを増加させ、心機能を改善させることができるとともに、腫瘍形成能を持たない。本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤の製造方法は、手順が簡単で、反復率が高く、大規模な生産に適する。
本発明をより明らかに説明するために、以下の用語を定義する。
多能性幹細胞培養用培地とは、多能性幹細胞(誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む)の培養及び増殖に用いれる培地。多能性幹細胞の最初に用いれる培養条件は、ゼラチンコート及びフィーダー層として使用されるマウス胚線維芽細胞(MEF)が必要であり、伝統的な培地は、さらに成分が複雑なノックアウト血清代替物(KOSR)を主な培地添加剤として使用する。技術の継続的な最適化に伴い、基本培地を添加剤被と組み合わせて多能性幹細胞の培養に用いられ、基本培地は、DMEM/F12を含むが、これに限定されなく、一定の濃度のグルコースを含み、干細胞の増殖に必要な必須アミノ酸がある培地も基本培地として使用でき、添加剤は、炭酸水素ナトリウム、組換え型ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、組換えヒトラクトフェリン、インスリン、アスコルビン酸、組換えヒト形質転換成長因子などを含むが、これらに限定されなく、本発明の実施例で使用される多能性幹細胞培養用培地は、前記の様々な培地に限定されなく、当業者に周知のすべての多能性幹細胞の培養に適用できる培地は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
本発明における心筋細胞とは、多能性幹細胞から分化した、cTnTを特異的に発現できる細胞を意味する。
多能性幹細胞の残存量とは、本発明において、多能性幹細胞から心筋細胞を分化した細胞産物において、未分化の多能性幹細胞の数量が細胞総量に占める比率%を意味する。
駆出率(EF)とは、心拍ごとに心臓が放出する血液量を心臓が拡張 したときの容積で除した値であり、容積の観点から心室の駆出機能を反映し、カラードップラー心臓超音波で検査でき、駆出率は、心筋の収縮性に関連し、心筋収縮力が強いほど、駆出率が高くなる。
駆出率の変化量=心筋細胞製剤治療後の駆出率-注射心筋細胞製剤前の駆出率
HFrEFとは、駆出率が低下した心不全であり、このタイプの心不全患者は、主な診断指標として身体症状及び左室駆出率(LVEF)に基づいて判定され、LVEF<40であるを指す。
HFpEFとは、駆出率が維持された心不全であり、左室拡張期能動的弛緩能が損なわれ、心筋のコンプライアンスが低下するので、左室拡張期充満が障害され、心拍出量が低減し、左室拡張末期圧が上昇し、心不全の症状及び身体症状が発生し、左室駆出率(LVEF)はほぼ正常であり、LVEF>50であることを指す。
一、心筋細胞製剤の製造方法
1、多能性幹細胞から心筋細胞への分化
多能性幹細胞の前処理:胚性幹細胞(ESC)又は誘導多能性幹細胞(iPSC)をそれぞれ0.9×105cells/cm2、1.5×105cells/cm2及び3.0×105cells/cm2で多能性幹細胞培養用培地に播種し、5%CO2、37℃条件下で密度超が40%以上を超えるまで培養した。ここで、多能性幹細胞培養用培地は、TeSRTM-E8TM培地である。多能性幹細胞の播種密度は、多能性幹細胞の増殖速度に影響を与え、多能性幹細胞の全体的な分化効率を向上させるため、本発明の実施例では、0.9×105~3.0×105の播種密度を使用した。
心筋細胞の分化:多能性幹細胞の密度が40%以上を超える場合には、多能性幹細胞培養用培地を吸引除去し、CHIR99021を含む心筋細胞分化誘導用培地を加えて48時間後培養し、その培地をIWR-1を含む心筋細胞分化誘導用培地に交換し、48時間培養後に心筋細胞分化誘導用培地で培養し続け、48時間ごとに培地を交換し、拍動が観察されるまで細胞を培養する際にその心筋細胞及線維芽細胞の含有量を検出し、ここで、本発明の実施例で提供される心筋細胞分化誘導用培地は、RPMI1640培地にインスリンが含まれていないB27(RPMI1640培地とB27の量は100:2)を添加し、本発明の実施例に係る心筋細胞培地は、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるために使用できる他の培地であってもよい。
CHIR99021の最終濃度が0.01~0.09mM、IWRの最終濃度が0.01~0.05mMになる場合には、心筋細胞の分化効率は比較的に高くなり、心筋細胞の分化効率をさらに向上させるために、心筋細胞が6日間分化した後に成熟促進因子、例えば、インスリン含有B27を添加してもよい。多能性幹細胞の培養密度が40%を超える場合には、心筋細胞の分化効率に明らかな影響を与えなく、生産コストを削減するために、本発明の実施例は、多能性幹細胞の培養密度が40%になる際に心筋細胞の分化を行うことを使用してもよい。
調製された細胞を免疫蛍光法により同定し、以上の操作はいずれも無菌条件下で行った。
当業者に知られている他の多能性幹細胞から心筋細胞への分化方法及び心筋細胞中の多能性幹細胞又は線維芽細胞の精製方法も同様に本発明に適用できる。
本発明の実施例において、多能性幹細胞から分化した細胞を注射液として異なる濃度の心筋細胞を有する心筋細胞製剤に調製した。具体的な方法は、以下の通りである。
心筋細胞分化及び精製工程で心筋細胞の純度、線維芽細胞の純度及び多能性幹細胞の残存量の検出により、必要に応じて心筋細胞分化及び精製工程のパラメーターを制御して心筋細胞及び線維芽細胞の含有量を調整し、多能性幹細胞の残存量をできるだけ低減させた。本発明の実施例はフローサイトメトリーを使用して上記の3つの細胞の含有量を検出した。
線維芽細胞の純度の検出:被験細胞をカウントした後、4% PFAで固定し、さらにDPBSで100μL濃度が1×107cells/mLの細胞懸濁液に調製し、遠心分離後、75μL濃度が1%のBSA及び20μLのFCR Blocking Reagentを加え、室温で30分間ブロッキングした後、5μLのAnti-human Vimentin Alexa 488を加えて均一に混合した後、室温、暗所で30分間インキュベートし、DPBS洗浄して遠心分離した後、フローサイトメーター分析を行い、ここで、対照群は、80μL濃度が1%のBSA及び20μLのFCR Blocking Reagentでインキュベートした。
本発明の実施例で提供される心筋細胞精製工程によれば、心筋細胞の精製液における精製の7日目的心筋細胞の純度は71.49%であり、線維芽細胞の純度は22.38%であり、多能性幹細胞の残存量は4.2%であり、心筋細胞の精製液での細胞の精製時間を12日間に延長して精製後の細胞を濃度が0.75~5μMのSTF-31を含む心筋細胞培地で2日間培養し、それぞれ心筋細胞の純度、線維芽細胞の純度及び多能性幹細胞の残存量をフローサイトメトリーにより検出し、ここで、心筋細胞の純度は94.42%であり、線維芽細胞の含有量は3.15%であり、誘導多能性幹細胞の残存量は0.53%であった。
本発明の実施例は、注射液として生理食塩水を使用した以外は、心筋細胞製剤の調製のために以下の注射液も提供した。即ち
(1)濃度が5%のヒト血清アルブミン;
(2)DMSOとHASと15%グルコースとブドウ糖加デキストラン40注射液と生理食塩水が7.5:20:30:10:32.5の体積比で均一に混合された混合溶液。
3、異なる濃度の心筋細胞製剤中の細胞生存率
心筋細胞製剤のサンプルの調製:上記分化工程による細胞から細胞懸濁液を調製した後、心筋細胞、多能性幹細胞及び線維芽細胞の含有量を検出し、心筋細胞の含有量が80%超え、線維芽細胞の含有量が20%以下且つ多能性幹細胞の残存量が1%以下であることを満たす細胞を心筋細胞の数量に応じて生理食塩水にて無菌条件下で心筋細胞の濃度が0.5×107、0.75×107、0.3×108、0.5×108、1.2×107、0.75×109、1.0×109及び3.0×109(cells/mL)である心筋細胞製剤を調製した。
細胞生存率に対する心筋細胞濃度の影響
表1には、それぞれ調製された異なる濃度の心筋細胞製剤の細胞生存率、及び異なる濃度の心筋細胞製剤が4℃で4h保存された後の細胞生存率を示し、表1から、心筋細胞の濃度が細胞生存率に影響を与え、濃度が高いほど、細胞生存率の低下が大きくなることが分かり、4時間以内の心筋細胞製剤での細胞生存率により、心筋細胞製剤の調製から使用までの過程中に、心筋細胞の損失をできるだけ回避するために、心筋細胞の濃度が1.0×109以下に選択する必要があった。
1、ラット心不全モデルの構築
ラット心筋梗塞後心不全モデルの作製原理は、ラットに心筋を壊死させ、心室壁運動およびコンプライアンスを低下させ、心機能が代償から代償不全へ変換し、最終的に心不全になることであり、現在、最も一般的に使用される方法は、冠動脈結紮法であるが、但し、結紮位置が高すぎてラットの死亡を引き起こしやすく、低すぎると梗塞領域が小さくなった。
本発明の実施例において、以下のように心不全モデルを構築した。ラットが麻酔された後、小動物呼吸換気装置が経口的にカニューレを介して接続され、開胸した視野下で冠動脈前下行枝を結紮した。手術後、160 IU/kgのペニシリンを3~5日間、毎日腹腔内注射する必要があった。
心エコー検査は、動物の心機能を動的に観察できる心機能の非侵襲的評価法であり、本発明の実施例では、左室収縮末期径(LVESD)、左室収縮末期容積(LVESV)、収縮末期左室前壁厚(LVAW)、左室駆出率(EF)及び左室短軸短縮率(FS)を心機能評価指標として選択した。
冠動脈結紮後のラットを2~6週間飼育し、その左室駆出率(EF)を心エコー検査で測定し、EF<40%のラットは実験選択基準を満たし、成功した心不全モデルとして使用できた。
本発明に係る心筋細胞製剤は、心不全の対象に応じて、同種異体由来の多能性幹細胞から調製された。研究によると、心不全モデルに同じ数量の心筋細胞を注入することを前提として、心機能の改善程度は、心筋細胞製剤中の心筋細胞の濃度によって異なることを発見し、心筋細胞の濃度が治療效果に及ぼす影響をさらに理解するために、上記の生理食塩水による心筋細胞製剤の調製方法に従い、表2に示す心筋細胞製剤を選択してラットの心外膜を通して瘢痕領域または心筋壁の菲薄化した領域に注射された後、免疫拒絶反応を防ぐためにラット15mg/kgのシクロスポリンA及び2mg/kgのメチルプレドニゾロンを毎日胃内投与し、心エコー検査により心不全モデルの心機能の回復を観察した。
本発明の実施例に係る中心筋細胞製剤は、誘導多能性幹細胞から分化してもよく、胚性幹細胞から分化してもよく、2つの由来源の心筋細胞製剤は、心不全モデルの心機能に対する改善に有意差はなく、次の実施例では、誘導多能性幹細胞から分化した心筋細胞を使用して心筋細胞製剤を調製した。
心不全モデル駆出率の変化量に対する異なる心筋細胞製剤の影響
ここで、実験群において、各々の実施例で注射される細胞総量が同じであり、且つ各実施例中の心筋細胞の濃度に応じて適合な注射量を選択し、例えば、各実施例で注射される細胞総量は1.2×106個であり、実施例6中の心筋細胞濃度は1.2×108cells/mLであり、実施例6では心筋細胞製剤10μlを注射して総注射量で1.2×106個の細胞に達した。
表2中の駆出率の変化量は、注射される心筋細胞総量が1.2×107個である実験群に心筋細胞製剤を注射してから28日後の駆出率と心筋細胞が注射される前の駆出率の差であり、図1は、対照群では時間とともに左室前壁が薄くなり、左心室内径と左心室容積がいずれも時間とともにある程度増加し、心機能が低下するが、実験群のD28での心機能は対照群のD28での心機能よりも優れたことを示した。本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤は、心機能低下の程度を効果的に低減することができた。
図4及び5は、それぞれ細胞療法を受けていない心不全モデルが時間とともに左室収縮末期径及び左室収縮末期容積が大きくなり、収縮末期左室前壁厚が薄くなるが、実験群で心筋細胞製剤による治療を受けてから28日後に左室収縮末期径及び左室収縮末期容積が拡大し続けず、しかも、収縮末期左室前壁厚が細胞治療後にある程度増加することを示すため、心機能を評価するためのさまざまな指標の観察によると、心筋細胞製剤は心筋収縮力をある程度高め、心室壁張力を増加させ、心機能を改善することができることが分かった。
本発明の実施例は、さらに、それぞれ心不全モデルに投与する心筋細胞総量7.5×106個及び心筋細胞総量2.0×108個の実験中の心筋細胞濃度が心機能に与える影響を研究した。ここで、各実験群あたりの各心不全モデルへの総注射量が特定される前提下で(同じ心筋細胞総量を注射する実施例は1群である)、心筋細胞製剤の注射方式は、1回の注射であってもよく、複数回の注射であってもよく、複数群の実験結果は、いずれも心筋細胞の濃度が心機能の改善に影響を与えることを示し、異なる群の実験において心機能の改善が心筋細胞濃度に伴う変化及び心筋細胞の総注射量が1.2×107個の心筋細胞である実験群の結果と一致し、実際の心不全治療過程中に、心不全の対象及び心不全の重症度に応じて適合な注射量及び適合な心筋細胞濃度の心筋細胞製剤を選択する必要があった。
腫瘍形成能とは、細胞が動物に播種された後、播種細胞が動物体内で腫瘍を形成する過程を意味し、本発明の実施例では、それぞれヌードマウス体内腫瘍形成能実験及び軟寒天コロニー形成試験を使用して心筋細胞製剤の腫瘍形成能を評価し、本発明の実施例では、それぞれ誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞製剤及び胚性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の腫瘍形成能の検出を研究し、ここで、Hela細胞は、陽性対照とした。腫瘍形成能の被験試料のパラメーターはそれぞれ表3、4に示した。
誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の腫瘍形成能検出用試料のパラメーター
胚性幹細胞に由来する心筋細胞製剤中の残存多能性幹細胞も腫瘍形成能を有する可能性があり、表4には、心筋細胞製剤中の異なる残存量の多能性幹細胞の腫瘍形成能の実験試料を示した。
胚性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の腫瘍形成能を検出するための試料のパラメーター
以上の実施例では心筋細胞製剤中の線維芽細胞の含有量はいずれも10%であった。
ヌードマウスを無作為に実験群、空白対照群及び陽性対照群に分け、表3及び4に示される実験試料を実験群とし、生理食塩水を空白対照群とし、濃度が1.8×106cells/mLのHelaを陽性対照とし、ヌードマウスの背中皮下に細胞を播種し、播種量はいずれも0.2mLであり、各実施例あたり5群の並行実験が行われ、播種されたヌードマウスの播種部位を定期的に観察した。
結果は、空白対照群、実施例13~22、実施例24~33では播種後6か月以内にいずれも腫瘍形成を認めず、接種部位に結節が形成されず、腫瘍形成率が0であり、実施例23の5群の並行実験において、1匹のヌードマウスが接種後28日目に播種部位で小さくて硬い小結節が触れ、播種2か月後に、そのヌードマウスの背中に明らかなしこりが見られ、その心筋細胞製剤の腫瘍形成率が1/5であることを示した。
1.2%アガロースと多能性幹細胞培養液を1:1で混合し、6cm培養皿に5mLを加えて底層寒天とし、0.5%アガロースと多能性幹細胞培養液を1:1で混合して上層寒天とし、実施例13~33の心筋細胞製剤について細胞計数及び生細胞検出を行い、それぞれ実施例13~33の心筋細胞製剤1mLを取り出して上層寒天5mLを加え、徐々に培養皿へ注入し、空白対照及び濃度が1.8×106cells/mLのHela細胞を陽性対照として設定し、2層軟寒天培養皿を37℃、5%CO2のインキュベーターに置いて30日目培養し、顕微鏡下で細胞クローンの形成を観察し、細胞コロニーのクローン率を計算した。
細胞コロニーのクローン率=(細胞コロニー数÷各ウェルに加えた細胞の数)×100%
陽性対照群の細胞コロニーのクローン率は5.1%であり、空白対照群及び実施例16、17、21、22、26、27、31、32、33はコロニーを形成していないが、残りの実施例は、いずれも異なる細胞コロニー数があり、細胞コロニーのクローン率は、多能性幹細胞の残存量が増加するにつれて高くなった。
以上の実施例は、本発明をさらに説明するためにのみ使用されるが、本発明の実施形態が上記の実施例によって限定されなく、本発明に基づいて加えた本発明と本質的に同じである他の変更、修飾、置換、組合せは、同等の交換手段とみなされ、本発明の保護範囲に含まれる。
Claims (10)
- 多能性幹細胞から分化した心筋細胞及び線維芽細胞を含む心筋細胞注射液であって、前記心筋細胞注射液中の心筋細胞濃度は0.5×10 8 ~1.2×10 8 cells/mLであり、前記心筋細胞の含有量は80%より高くなり、且つ前記線維芽細胞の含有量は、20%以下である、ことを特徴とする心筋細胞注射液。
- 前記心筋細胞注射液中の多能性幹細胞の残存量は1%以下である、ことを特徴とする請求項1に記載の心筋細胞注射液。
- 前記心筋細胞注射液中の多能性幹細胞の残存量は0.3%以下である、ことを特徴とする請求項2に記載の心筋細胞注射液。
- 前記心筋細胞は、多能性幹細胞から以下の手順で調製される。
多能性幹細胞の前処理:前記多能性幹細胞を0.9×105~3.0×105cells/cm2で多能性幹細胞培養用培地に播種し、5%CO2、37℃条件下で密度が40%以上を超えるまで培養すること;
心筋細胞の分化:前記多能性幹細胞培養用培地を吸引除去し、濃度が0.01~0.09mMのCHIR99021を含む心筋細胞分化誘導用培地を加えて48時間培養し、その培地を濃度が0.01~0.05mMのIWR-1を含む心筋細胞分化誘導用培地に交換し、48時間培養し続け、さらに、心筋細胞分化誘導用培地で培養し続け、しかも、細胞増殖状態に応じて心筋細胞分化誘導用培地を交換すること;
心筋細胞の精製:観察可能な拍動が見られるまで心筋細胞の分化を経た細胞を培養し続け、細胞を心筋細胞分化誘導用培地に6.0×105~9.0×105cells/cm2の密度で播種し、線維芽細胞の含有量を心筋細胞の精製液で20%未満に調整することである、ことを特徴とする請求項1に記載の心筋細胞注射液の製造方法。 - 前記多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む、ことを特徴とする請求項4に記載の心筋細胞注射液の製造方法。
- 前記心筋細胞の精製は、さらに、濃度が0.75~5μMのSTF-31を含む心筋細胞培地で細胞を2~5日間培養することを含む、ことを特徴とする請求項4に記載の心筋細胞注射液の製造方法。
- 心筋細胞の精製で得られた細胞及び生理食塩水は、無菌条件下で心筋細胞の濃度が0.5×10 8 ~1.2×10 8 cells/mLの細胞懸濁液に調製される、ことを特徴とする請求項4~6のいずれか1項に記載の心筋細胞注射液の製造方法。
- 請求項1に記載の心筋細胞注射液を含む、心不全を治療するための組成物。
- 前記心筋細胞注射液が、駆出率が低下した心不全(HFrEF)を治療するために用いられる、ことを特徴とする請求項8に記載の心不全を治療するための組成物。
- 前記心筋細胞注射液が、注射器により外科心外膜を通して瘢痕領域または心筋壁の菲薄化した領域に注射される、ことを特徴とする請求項8に記載の心不全を治療するための組成物。
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